2, 3, 4: các dòng plasmid tái tổ hợp
Đối với plasmid được nhân dòng thành công thì theo lý thuyết sau khi cắt sẽ tạo ra hai băng: một băng có kích thước 2700bp tương ứng với băng của vector pBT và một băng có kích thước ~390bp là sản phẩm nối 27aa_LTB. Trên hình 3.3 mẫu plasmid số 2 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2700bp và 390bp, điều này thể hiện đúng như tính toán. Các mẫu plasmid ở giếng số 3 và 4 chỉ có một băng khoảng 2700bp, chứng tỏ đoạn gen nối chưa được gắn vào vector để nhân dòng. Giếng số 1 là đối chứng âm chỉ
~2700bp
~390bp
M 1 2 3 4
B
có vector pBT nên chỉ có một băng khoảng 2700bp, điều này cho thấy đây là kết quả hợp lý. Như vậy chỉ có plasmid số 2 là được nhân dòng thành công. Để có thêm cơ sở khẳng định đoạn gen nối 27aa_LTB này được nhân dòng trong vector pBT, chúng tôi đã xác định trình tự dòng plasmid số 2. Kết quả đọc trình tự plasmid 2 (pBT_27aa_LTB_M13F) và so sánh với trình tự gốc (Doan 27aa_LTB(chuan)) bằng phương pháp MegAlign ClusterW (DNAStar) được thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn 27 aa_LTB với trình tự gốc lần
Trình tự được đọc có một số điểm sai khác giữa trình tự đoạn 27aa_LTB so với trình tự gốc. Những đoạn có trình tự giống nhau được thể hiện bằng trình tự có nền màu xanh ở cả hai dòng. Trình tự khác nhau được thể hiện bằng nền trắng. Từ kết quả trình tự này chúng tôi chưa thể khẳng định đoạn được gắn vào vector pBT có phải là đoạn 27aa_LTB hay không. Do vậy chúng tôi tiếp
tục đọc trình tự đoạn 27aa_LTB này lại một lần nữa. Dựa trên kết quả so sánh trình tự lần này vẫn có một số nucleotide của gen chưa chính xác so với trình tự gốc. Tỉ lệ số trình tự nucleotid sai khác 7%. Đây có thể là do sản phẩm PCR từ bước nhân gen 27 aa cho tới khi PCR nối đoạn 27 aa với LTB không đạt kết quả chính xác tuyệt đối như mong muốn. Qúa trình thôi gen các sản phẩm PCR (do có bước soi dưới tia cực tím) cũng có thể làm mất đi một số nucleotid trên gen và điều này làm cho trình tự không được đúng như mong muốn. Tuy nhiên từ hai lần đọc trình tự trên chúng tôi thấy sự có mặt đoạn LTB và một phần trình tự đoạn 27aa trong trình tự đó. Do vậy, chúng tôi vẫn tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để xem khả năng biểu hiện protein của sản phẩm này.
Để có nguyên liệu thiết kế vector biểu hiện cả ở thực vật và E.coli thì đoạn gen nối 27aa_LTB phải chứa hai đầu là hai điểm cắt của BamHI và NotI. Plasmid pBT_27aa_LTB được cắt bằng enzyme cắt hạn chế BamHI và NotI để tạo ra đoạn 27aa_LTB ở hai đầu chứa hai điểm cắt của BamHI và NotI (27aa_LTB/BamHI/NotI).
3.3 Thiết kế vector biểu hiện gen 27 aa_LTB trong E.Coli
Để thiết kế vector biểu hiện trong E.Coli chúng tôi lựa chọn hệ thống biểu hiện của vector pET21(a+). Đây là loại vector được thiết kế thích hợp cho việc hiểu hiện gen trong E.coli. Protein được tổng hợp dưới sự điều khiển của promoter T7. Một thành phần quan trọng trong vector pET21(a+) là có một đoạn trình tự mã hoá cho 6 histidine tích điện âm, còn được gọi là đuôi His- tag. Đuôi này được gắn vào đầu C của protein ngoại lai, nhờ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh sạch protein sau này.
Chúng tôi gắn đoạn 27aa_LTB/BamHI/NotI vào vector pET21(a+) được mở vòng bằng BamHI và NotI. Sản phẩm được nhân dòng trong E.coli DH5α.
Plasmid từ những khuẩn lạc trắng được chọn và cắt kiểm tra với enzyme
BamHI và NotI. Kết quả sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.5B.
Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB A: Sơ đồ cấu trúc biểu hiện đoạn 27aa_LTB trong E.Coli