Bài viết trình bày về Vi khuẩn Lactobacillus thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae tiết ra độc tố như acid α – pycolinic (C6H5NO2 ) và pyricularin (C18H14N2O3 ) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn sau 16 giờ cũng thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae từ khi khảo sát bằng phương pháp cấy đối kháng trên đĩa thạch. Mời các bạn cùng tham khảo!
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM ĐẠO ƠN PYRICULARIA ORYZAE CỦA BỘ Ư TẬP VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG Nguyễn Bảo Trân, Hồ Thị Dưỡng*, Nguyễn Tấn Lộc, Trần Quang, Nguyễn Hoàng Anh Viện Khoa học Ứng dụng (HUTECH), Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương TĨM TẮT Vi khuẩn Lactobacillus thể khả kháng nấm Pyricularia oryzae tiết độc tố acid α – pycolinic (C6H5NO2) pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hơ hấp phân hủy enzyme chứa kim loại cây, kìm hãm sinh trưởng lúa Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn sau 16 thể khả kháng nấm Pyricularia oryzae từ khảo sát phương pháp cấy đối kháng đ a thạch Từ khố: Hoạt tính kháng nấm, nấm Pyricularia oryzae, phương pháp cấy đối kháng, vi khuẩn lên men lactic ĐẶT VẤN ĐỀ Lactobacillus spp vi khuẩn gram dương, hình que hình cầu, không sinh bào tử, sinh acid lactic tạo thành phần vi khuẩn đường ruột thơng thường người động vật Chúng đẩy mạnh kháng lại sinh vật ngoại sinh sinh vật mang mầm bệnh, hình thành hợp chất đối kháng: bacteriocin đồng thời có khả ức chế phát triển nấm đạo ôn sinh độc tố acid α – pycolinic (C6H5NO2) pyricularin (C18H14N2O3) Nấm Pyricularia oryzae tác nhân gây bệnh đạo ôn, nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp nhiệt độ 24 – 28oC ẩm độ khơng khí 93% trở lên Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử 10 – 30oC Ở 28oC cường độ sinh bào tử nhanh mạnh sức sinh sản giảm dần sau ngày, 16oC, 20oC 24oC sinh sản tăng kéo dài tới 15 ngày sau giảm xuống Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy trình sinh sản bào tử nấm Bào tử nảy mầm tốt nhiệt độ 24 – 28oC có giọt nước Q trình xâm nhập nấm vào phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ khơng khí ánh sáng Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24oC ẩm độ bão hòa thuận lợi cho nấm xâm nhập vào Trong trình gây bệnh nấm tiết số độc tố acid α – picolinic (C6H5NO2) pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hơ hấp phân hủy enzyme chứa kim loại cây, kìm hãm sinh trưởng lúa Do việc phát kịp thời, xác tác nhân gây bệnh lúa giúp ích cho việc đưa biện pháp phòng ngừa điều trị sớm, kịp thời để có hiệu tốt 309 Hiện nay, việc sử dụng thuốc hóa học rộng rãi để điều trị bệnh đạo ôn lúa nông nghiệp với ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu kinh tế cao, hợp chất hóa học dần có điểm yếu độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước khơng khí, hình thành lồi kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe người Việc sử dụng hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho người hướng mở rộng chủng nghiên cứu ứng dụng nhiều chủng sinh acid lactic [1,2] Mục tiêu nghiên cứu khảo sát khả kháng nấm Pyricularia oryzae sưu tập sẵn có vi khuẩn lên men lactic phịng thí nghiệm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 cung cấp phòng thí nghiệm khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh Ký hiệu chủng Nguồn phân lập KC1A Kim chi L5, L3, L1, L10L, L2N Nem chua C1 Cơm mẻ Nấm Pyricularia oryzae phân lập từ lúa nhiễm bệnh đạo ôn quà tặng Đại học Cần Thơ Daconil từ nhà sản xuất Công ty TNHH Việt Thắng 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát tính khiết đặc điểm nuôi cấy chủng Lactobacillus spp Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 tăng sinh môi trường MRS Broth ủ 37 oC 16 Sau đó, tiến hành cấy chuyển MRS Agar ủ ngày 37 oC sau quan sát hình thái khuẩn lạc khảo sát đặc điểm nuôi cấy thí nghiệm sinh lý, sinh hố gồm: Nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase, thử nghiệm khả sinh acid lactic (ARNOLD J P., 1987, [3]), khả lên men đường khả di động 2.2.2 Khảo sát khả lên men lactic Nuôi cấy mơi trường MRS Broth vịng 16 giờ, chuẩn độ acid tổng NaOH 0,1N, thị phenolphtalein đến màu hồng nhạt Xác định hàm lượng acid tổng quy acid lactic theo công thức [3] %Acid lactic V 1.K 100 V2 đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) V2: Thể tích ni cấy đem chuẩn độ (ml) K: Thể tích ni cấy đem chuẩn độ (Acid lactic 0,009) 310 2.2.3 Khảo sát khả đối kháng in vitro chủng Lactobacillus spp L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 với Pyricularia oryzae Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 tăng sinh môi trường MRS Broth 37 oC 24 giờ, tỷ lệ cấy giống 5% Môi trường sử dụng PSA Chủng nấm đục từ môi trường PSA cấy trước ngày đặt vào tâm đ a Dịch nuôi cấy cấy đường cách mép đ a 15 mm với nghiệm thức cấy đồng thời Theo dõi đường kính phát triển nấm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Tính tỷ lệ kháng nấm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đặc điểm ni cấy Khảo sát tính khiết đặc điểm nuôi cấy chủng vi khuẩn giữ sưu tập cần thiết trước thử hoạt tính sinh học chúng Trên MRS agar, chủng Lactobacillus spp L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 khiết, có khuẩn lạc trịn lồi, mép nhẵn, trắng sữa Các đặc điểm nuôi cấy khác trình bày Bảng 1, cho thấy vi khuẩn gram dương, khơng sinh bào tử, khơng có khả di động, catalase âm tính, có khả sinh acid lactic, lên men đồng hình Bảng 1: Kết hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng Lactobacillus spp L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 Đặc điểm Mô tả hình thái L5 L3 L1 L2N L10L KC1A Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn C1 Que dài Nhuộm gram + + + + + + + Nhuộm tử - - - - - - - Khả di động - - - - - - - Thử nghiệm Catalase - - - - - - - Khả sinh acid lactic (thuốc thử Uffelmann) + + + + + + + Lên men đường * + + + + + + + (*glucose, fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, maltose) Các thử nghiệm cho thấy, chủng L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 giữ đặc điểm chi Lactobacillus dựa Khóa phân loại Bergey 311 Hình 1: Khuẩn lạc chủng L10L môi trường MRS agar tế bào C1 nhuộm Gram 3.2 Khảo sát khả lên men lactic Các chủng vi khuẩn L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 ni cấy mơi trường MRS Broth vịng 16 để xác định hàm lượng acid tổng Dựa vào Bảng 2, ta thấy chủng L2N sinh acid nhiều 1,63% chủng C1 có mật độ sinh khối cao ODhc600nm = 9,036 Bảng 2: Nồng độ acid tổng sinh khối sau lên men 16 môi trường MRS Stt Chủng KC1A 3,2.107 1,41 C1 4,4.107 1,46 L5 2,5.107 1,91 L3 4,6.107 1,68 L1 3,7.107 1,89 L2N 5,1.107 1,63 L10L 1,68 ật độ (tb/ml) 4,4.10 % cid tổng Bảng 3: Tỷ lệ ức chế nấm (%) chủng Lactobacillus spp với nấm Pyricularia oryzae Chủng Lactic Cấy khuẩn đồng thời cấy nấm (chi u ngang-chi u dọc) (mm) Tỷ lệ ức chế nấm (%) L3 [33 – 36] 47,2 L5 [28,5 – 35,5] 54,4 L2N [31 – 39] 50,4 L10L [28,5 – 32] 54,4 KC1A [33 – 36] 47,2 C1 [30,5 – 35] 51,2 L1 [29,3 – 33] 53,1 Daconil [62,5 – 63,5] 312 Đối chứng âm L5 L10L L1 Hình 3: Thí nghiệm đối kháng Lactobacillus sp L5, L10L, L1 với nấm Pyricularia oryzae sau 14 ngày đồng nuôi cấy Bảng cho thấy hai chủng L5 L10L kháng nấm Pyricularia oryzae tốt KẾT LUẬN Tất chủng vi khuẩn Lactobacillus spp L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 có khả kháng nấm cấy đồng thời Bản chất hợp chất kháng nấm chủng khác Nghiên cứu kháng nấm in vivo tiến hành TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Laitila A, Alakomi H-L, Raaska L, Mattila-Sandholm T and Haikara A 2002 Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley Findland : VTT Biotechnology [2] Kim Jeong Dong A 2005 Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatus Inha University, Incheon: Institute of Industrial Biotechnology [3] ARNOLD J P, M.D 1987 ‚A New Test For Lactic Acid In The Gastric Contents And A Method of Estimating Approximately The Quantity Present‛ The Journal of the American Medical Association (JAMA) Vol XXIX, No.08 pp 371 313 ... kháng nấm, vừa không gây hại cho người hướng mở rộng chủng nghiên cứu ứng dụng nhiều chủng sinh acid lactic [1,2] Mục tiêu nghiên cứu khảo sát khả kháng nấm Pyricularia oryzae sưu tập sẵn có vi khuẩn. .. nghiệm lặp lại lần Tính tỷ lệ kháng nấm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy Khảo sát tính khiết đặc điểm ni cấy chủng vi khuẩn giữ sưu tập cần thiết trước thử hoạt tính sinh học chúng... Nguồn phân lập KC1A Kim chi L5, L3, L1, L10L, L2N Nem chua C1 Cơm mẻ Nấm Pyricularia oryzae phân lập từ lúa nhiễm bệnh đạo ôn quà tặng Đại học Cần Thơ Daconil từ nhà sản xuất Công ty TNHH Vi? ??t