Chế tạo và khảo sát hoạt tính kháng nấm của hạt đồng nano được ổn định bằng Chitosan

Trong nghiên cứu này, kim loại đồng có kích thước nanomet đã được tổng hợp bằng phương pháp hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định và NaBH4 làm chất khử. Sự hình thành hạt đồng nano được xác định bằng màu sắc đặc trưng và phổ UV-vis. Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GỊN SAIGON UNIVERSITY TẠP CHÍ KHOA HỌC SCIENTIFIC JOURNAL ĐẠI HỌC SÀI GÒN OF SAIGON UNIVERSITY Số 71 (05/2020) No 71 (05/2020) Email: tcdhsg@sgu.edu.vn ; Website: http://sj.sgu.edu.vn/ CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA HẠT ĐỒNG NANO ĐƯỢC ỔN ĐỊNH BẰNG CHITOSAN Copper nanoparticles stabilized by Chitosan: preparation and antifungal activity ThS Phạm Thị Giang Anh(1), TS Đặng Xuân Dự(2) Trường Đại học Sài Gịn (1),(2) TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, kim loại đồng có kích thước nanomet tổng hợp phương pháp hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định NaBH4 làm chất khử Sự hình thành hạt đồng nano xác định màu sắc đặc trưng phổ UV-vis Hình thái kích thước hạt xác định phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Kết cho thấy với diện chitosan, hạt đồng nano chế tạo thành cơng với kích thước hạt khoảng 3,7 nm Vật liệu thu thể hoạt tính kháng nấm tốt Nấm mốc Aspergillus niger bị ức chế gần hoàn toàn nồng độ đồng nano 50 ppm Từ khóa: chất ổn định, chitosan, đồng nano, hoạt tính kháng nấm ABSTRACT In this present paper, copper nanoparticles were prepared by a chemical method using chitosan as a stabilizer and NaBH4 as a reducing agent The formation of copper nanoparticles was confirmed by the characteristic of colour and UV-vis spectra The morphology and particle size of the material were determined by transmission electron microscopy (TEM) The results showed that copper nanoparticles with a particle size of 3,7 nm were successfully prepared in the presence of chitosan The as-prepared materials exhibited a good antifungal activity The Aspergillus niger fungus was almost entirely inhibited by the copper nanoparticles at the concentration of 50 ppm Keywords: stabilizer, chitosan, copper nanoparticles, antifungal activity kim loại quý bạc, vàng bạch kim thường ứng dụng hiệu lĩnh vực nêu Tuy vậy, giá thành cao nên việc sản xuất chúng để ứng dụng rộng rãi với số lượng lớn khả thi Để giải vấn đề đó, đồng nano xem lựa chọn tốt để thay giá thành rẻ Chế tạo đồng nano thường khó thu hiệu suất độ tinh khiết cao Mở đầu Chế tạo nghiên cứu hoạt tính hạt nano kim loại với kích thước hình dạng khác nhằm khám phá tính chất khả ứng dụng chúng lĩnh vực khác y sinh [1], điện tử, quang học [2], xúc tác [3], [4]… hướng nghiên cứu hấp dẫn, thu hút nhiều quan tâm thời gian gần Vật liệu nano Email: dangxuandu@sgu.edu.vn 34 PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN bề mặt dễ bị oxi hóa, sản phẩm dễ lẫn CuO Cu2O Để khắc phục hạn chế này, chất chống oxy hố thường sử dụng cho q trình chế tạo Một số loại polymer thường sử dụng nhằm ổn định hệ hạt, tránh keo tụ bảo vệ hạt khỏi bị oxy hố Những nghiên cứu hướng đến mục tiêu chung tạo hạt đồng nano có kích thước nhỏ với độ ổn định cao để khai thác tối đa ứng dụng chúng Chitosan polymer tự nhiên chế tạo q trình đề axetyl hóa chitin sử dụng kiềm đặc Chitosan có ưu điểm bật phân hủy sinh học, khơng độc, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa.v.v [3] Những nghiên cứu gần cho thấy, chitosan có khả ổn định tốt hạt nano hạn chế q trình oxy hóa [3] Ngoài ra, loại polymer tồn phong phú tự nhiên, dễ tách chiết điều kiện bình thường, có triển vọng áp dụng quy mô lớn Trong nghiên cứu này, đồng nano chế tạo cách khử ion Cu2+ với NaBH4 chất khử, chitosan làm chất ổn định, chế ổn định hạt đồng nano chitosan thảo luận Ngoài ra, sản phẩm tạo thành kiểm tra hoạt tính chống nấm nồng độ khác chủng Aspergillus niger Thực nghiệm 2.1 Nguyên liệu hóa chất Chitosan với khối lượng phân tử 90 kDa cung cấp công ty Cổ phần Đầu tư Công nghệ Hương Nam, Bà Rịa - Vũng Tàu NaBH4 sản phẩm tinh khiết Merck (Đức), CuSO4.5H2O dạng tinh khiết Beijing (Trung Quốc) Các hóa chất khác acid acetic, acid ascorbic… sử dụng dạng tinh khiết phân tích Nước cất hai lần sử dụng cho tồn thí nghiệm 2.2 Phương pháp thực nghiệm 2.2.1 Chế tạo đồng nano ổn định chitosan Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano theo tài liệu [3], thay đổi khối lượng phân tử chitosan nồng độ, thể Hình Hịa tan 0,25 gam CuSO4.5H2O nước cất thu 40 mL dung dịch CuSO4 nồng độ 0,025M, thêm 100 mL acid acetic 0,1M chứa 1% chitosan theo khối lượng, khuấy hỗn hợp vòng 20 phút máy khuấy từ gia nhiệt Cho 0,5 mL acid ascorbic 0,5M vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục khuấy từ 20 phút Nhỏ 0,5 mL NaBH4 0,4M vào hỗn hợp, tiếp tục khuấy phút, dung dịch chuyển sang màu nâu đen Tiếp tục khuấy từ 30 phút để phản ứng xảy hoàn toàn Dung dịch đồng nano hình thành bảo quản điều kiện nhiệt độ phịng, tránh tiếp xúc với khơng khí cho nghiên cứu 35 SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No 71 (05/2020) Hình Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano 2.2.2 Đặc trưng đồng nano Đồng nano sau chế tạo đặc trưng phương pháp phổ UV-vis thiết bị UV - DR 5000; phương pháp nhiễu xạ tia X, sử dụng thiết bị đo XRD với xạ CuKα (λ = 0,15406 nm), tăng tốc 40kV, 40mA, góc 2θ = 20° – 90°, tốc độ qt 0,03°/s Hình thái kích thước hạt xác định kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) thiết bị JEM-1400 2.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Dung dịch keo đồng nano sau chế tạo, khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Aspergillus Niger theo bước sau: a) Pha môi trường Môi trường Crapek (môi trường đối chứng): Thành phần gồm Sucrose 15g, NaNO3 1,5g, K2HPO4 0,5g, KCl 0,25g, FeSO4.7H2O 0,05g, MgSO4.7H2O 0,25g, Agar 15g Cách pha: cân xác thành phần môi trường, cho 200ml nước cất vào cốc thủy tinh, sau thêm NaNO3, K2HPO4, KCl, FeSO4.7H2O, MgSO4.7H2O sucrose vào cốc khuấy từ tan hết Tiếp đến, chuyển dung dịch vào bình định mức thêm nước để thu 500 mL dung dịch Đổ dung dịch lại cốc thủy tinh điều chỉnh pH = NaOH 1M HCl 1M, thêm agar tiếp tục khuấy từ khoảng 10 phút Cuối cùng, đổ môi trường vào bình erlen dung tích 250 ml, đậy kín bơng bọc bên ngồi giấy để hấp vô trùng Môi trường mẫu Thành phần cách pha tương tự môi trường đối chứng cho thêm đồng nano vào dung dịch sau chỉnh pH để nồng độ đồng nano khoảng từ 20 ppm đến 100 ppm, đồng nano thêm vào dạng dung dịch, nồng độ tính theo nồng độ ion Cu2+ b) Hấp dụng cụ, môi trường Dụng cụ môi trường hấp vô trùng 121ºC 30 phút sử dụng nồi hấp khử trùng Tomy Autoclave Dụng cụ 36 PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN sau hấp vô trùng sấy nhiệt độ 120ºC c) Đổ môi trường Pha từ từ dung dịch môi trường mẫu có chứa đồng nano mơi trường đối chứng vào đĩa petri hấp vô trùng Giai đoạn tiến hành tủ cấy d) Nuôi cấy Cấy nấm mốc Aspergillus Niger vào môi trường mẫu môi trường đối chứng Sau ngày nuôi cấy, quan sát kết phát triển nấm mốc môi trường mẫu môi trường đối chứng để đánh giá hiệu kháng nấm dung dịch keo đồng nano Kết thảo luận 3.1 Sự hình thành keo đồng nano Hình Phổ UV-vis dung dịch trước sau phản ứng Sự thay đổi màu sắc dung dịch phản ứng thể Hình Trước phản ứng, dung dịch có màu xanh dương, màu đặc trưng ion Cu2+ Khi thêm NaBH4 vào hệ phản ứng khuấy đều, dung dịch dần chuyển sang màu nâu đen, màu đặc trưng dung dịch đồng nano [3] Phản ứng khử ion đồng Cu2+ NaBH4 diễn sau [5]: CuSO4 + NaBH4 + H2O → Cu + 2H3BO3 + 7H2 + Na2SO4 Usman cộng chế tạo đồng nano sử dụng chitosan làm chất ổn định [6] Kết dung dịch keo đồng nano thu cho màu nâu đen đặc trưng, tương tự nghiên cứu Theo nghiên cứu trước đây, đỉnh hấp thụ gây tượng plasmom dung dịch keo đồng nano ghi nhận phổ UV-vis khoảng bước sóng từ 500 – 600 nm [1], [7] Hình cho thấy trước phản ứng, vừa thêm NaBH4 vào dung dịch, chưa quan sát rõ đỉnh hấp thụ khoảng bước sóng Sau phản ứng, xuất hấp thụ cực đại 579 nm bước sóng hấp thụ đặc trưng dung dịch keo đồng nano [3] 37 SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No 71 (05/2020) Hình Giản đồ XRD chitosan đồng nano ổn định chitosan Giản đồ XRD chitosan vật liệu đồng nano ổn định chitosan thể Hình 3a Hình 3b Hình 3a cho thấy đỉnh nhiễu xạ 2θ = 9,26° 2θ = 19,82°, hai đỉnh nhiễu xạ đặc trưng chitosan [3], [8] Đối với giản đồ nhiễu xạ vật liệu đồng nano, ngồi đỉnh nhiễu xạ chitosan cịn quan sát đỉnh có cường độ nhiễu xạ tương đối cao hoàn toàn trùng hợp với đỉnh nhiễu xạ chuẩn kim loại đồng góc 2θ = 43,35°; 2θ = 50,60° 2θ = 74,17° tương ứng với mặt (111), (200) (220) thuộc ô mạng Bravais cấu trúc lập phương tâm diện kim loại đồng [3], [7] 3.2 Hình thái kích thước hạt keo đồng nano Hình Ảnh TEM giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu đồng nano 38 PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN Hình mơ tả hình thái kích thước hạt đồng nano Hình ảnh cho thấy hạt có dạng hình cầu, phân bố đồng đều, kính thước hạt từ đến 10 nm, đường kính trung bình vào khoảng 3,7 nm Như vậy, có mặt chitosan đóng vai trò chất ổn định hạn chế phát triển mầm, kích thước hạt thu tương đối nhỏ Ngồi có mặt chitosan cho tác nhân giảm thiểu oxy hoá bề mặt, ngăn cản keo tụ, làm bền cho hệ keo đồng nano [8] Cơ chế ổn định keo đồng nano chitosan số tác giả đề cập [1], [6], [8] Theo đó, thêm Cu2+ vào dung dịch chitosan, ion Cu2+ gắn vào đại phân tử chitosan tương tác tĩnh điện Nguyên tử oxy giàu electron nhóm hydroxyl phân cực nhóm ether phân tử chitosan tương tác với điện tích dương cation kim loại [9] Nhờ đó, chitosan đóng vai trị vừa chất điều khiển tạo thành hạt nhân keo vừa chất ổn định [10] Ngồi ra, nhờ có nhóm amine nhóm hydroxyl có lực mạnh với ion kim loại, chitosan gắn với kim loại thông qua tạo phức cách chuyển electron Theo cách đó, chúng thúc đẩy tạo thành hạt nhân keo đồng Sự hình thành phức chitosan Cu2+ làm cho khả khử ion đồng diễn thuận lợi [8] 3.3 Khả kháng nấm đồng nano ổn định chitosan Hình Sự phát triển nấm mốc Aspergillus niger sau ngày cấy đĩa petri phát triển nấm mốc Từ kết thí nghiệm nhận thấy khả phát triển nấm mốc Aspergillus niger bị ức chế gần hoàn toàn nồng độ đồng nano 50 ppm Pariona cộng (2019) tổng hợp đồng nano khảo sát khả ức chế số loại nấm Fusarium solani, Neofusicoccum sp Fusarium oxysporum [11] Kết cho thấy nồng độ tối thiểu hiệu ức chế hoàn toàn loại nấm 750 ppm lớn nhiều so với nghiên cứu chúng tơi Ngun nhân đồng nano thu nghiên cứu Parion khoảng nm, lớn Hình kết thử nghiệm hoạt tính diệt nấm mốc Aspergillus niger với mẫu đồng nano ổn định chitosan có nồng độ khác Sau ngày ni cấy mẫu, kết cho thấy mẫu đối chứng - khơng có đồng nano, nấm phát triển mạnh Đối với mẫu có chứa đồng nano khả phát triển nấm mốc bị ức chế đáng kể sau ngày nuôi cấy Ở mẫu chứa đồng nano nồng độ 25 ppm nấm mốc phát triển tương đối yếu sau ngày nuôi cấy so với mẫu đối chứng Trong đó, mẫu có đồng nano nồng độ 50 ppm 100 ppm gần không quan sát 39 SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No 71 (05/2020) so với nghiên cứu Ngoài ra, khác biệt chủng nấm nghiên cứu chúng tơi (Aspergillus niger) nguyên nhân làm cho nồng độ ức chế nấm tối thiểu tương đối nhỏ Nhìn chung khả kháng nấm kháng khuẩn đồng nano phụ thuộc vào nhiều yếu tố thời điểm chủ đề mở cần tiếp tục bàn luận, đặc biệt chúng ổn định chitosan tác nhân có hiệu ứng kháng khuẩn Theo số nghiên cứu gần đây, vật liệu đồng định chitosan, tốc độ khuếch tán đồng nano phóng thích (release) khỏi mơi trường chitosan yếu tố định đến khả kháng khuẩn Và vậy, cần ý khơng phải kích thước hạt nhỏ vật liệu cho hiệu kháng vi sinh vật tốt, trường hợp đó, khả hạt bọc lớp polymer tương đối dày, dẫn đến tốc độ phóng thích chậm hiệu kháng vi sinh vật trường hợp thường không cao Usman cộng (2013) xem xét khả kháng khuẩn đồng nano ổn định chitosan với nồng độ khác Kết cho thấy nồng độ chitosan 0,2% cho hiệu kháng vi sinh vật tốt kích thước hạt trung bình tương đối lớn so với đồng nano ổn định dung dịch chitosan 0,5% [3] Nhìn chung, hạt nano ổn định loại polymer sinh học có thuận lợi việc kéo dài thời gian phóng thích, cải tiến tính chất kháng vi sinh vật chúng Tuy vậy, nồng độ chất ổn định tối ưu cho hoạt động hạt nano vấn đề cần nghiên cứu Kết luận Đồng nano chế tạo đơn giản phương pháp khử hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định Sự hình thành pha đồng nano xác định dựa vào màu sắc đặc trưng tín hiệu plasmom phổ UV-vis Kết cho thấy hạt đồng nano thu có dạng hình cầu, kích thước hạt khoảng 3,7 nm Dung dịch keo đồng nano thu có khả ức chế tốt phát triển nấm mốc Ở nồng độ lớn 50 ppm, đồng nano ức chế gần hoàn toàn phát triển nấm mốc sau ngày nuôi cấy Với phương pháp chế tạo đơn giản, sản phẩm có hoạt tính kháng nấm cao, đồng nano có triển vọng để chế tạo với quy mô lớn làm chế phẩm kháng nấm ứng dụng nông nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Tokarek K, Hueso J L, Kuśtrowski P, Stochel G, Kyzioł A, “Green Synthesis of Chitosan-Stabilized Copper Nanoparticles”, European Journal of Inorganic Chemistry, 2013 (28), 4940-4947, 2013 [2] Ponce A A, Klabunde K J, “Chemical and catalytic activity of copper nanoparticles prepared via metal vapor synthesis”, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 225(1), 1-6, 2005 [3] Usman M S, El Zowalaty M E, Shameli K, Zainuddin N, Salama M, Ibrahim N A, “Synthesis, characterization, and antimicrobial properties of copper nanoparticles”, International journal of nanomedicine, 8, 4467, 2013 40 PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN [4] Raffi M, Mehrwan S, Bhatti T M, Akhter J I, Hameed A, Yawar W, Ul Hasan, M M, “Investigations into the antibacterial behavior of copper nanoparticles against Escherichia coli”, Annals of microbiology, 60(1), 75-80, 2010 [5] De S, Mandal S, “Surfactant-assisted shape control of copper nanostructures” Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 421, 72-83, 2013 [6] Usman M S, Ibrahim N A, Shameli K, Zainuddin N, Yunus W M Z W, “Copper nanoparticles mediated by chitosan: synthesis and characterization via chemical methods”, Molecules, 17(12), 14928-14936, 2012 [7] Dang T M D, Le T T T, Fribourg-Blanc E, Dang M C, “The influence of solvents and surfactants on the preparation of copper nanoparticles by a chemical reduction method”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 2(2), 025004, 2011 [8] Manikandan A, Sathiyabama M, “Green synthesis of copper-chitosan nanoparticles and study of its antibacterial activity”, Journal of Nanomedicine & Nanotechnology, 6(1), 1, 2015 [9] Zain N M, Stapley A G F, Shama G, “Green synthesis of silver and copper nanoparticles using ascorbic acid and chitosan for antimicrobial applications”, Carbohydrate polymers, 112, 195-202, 2014 [10] Muzzarelli R A, “Potential of chitin/chitosan-bearing materials for uranium recovery: An interdisciplinary review”, Carbohydrate Polymers, 84(1), 54-63, 2011 [11] Pariona N, Mtz-Enriquez A I, Sánchez-Rangel D, Carrión G, Paraguay-Delgado F, Rosas-Saito G, “Green-synthesized copper nanoparticles as a potential antifungal against plant pathogens”, RSC advances, 9(33), 18835-18843, 2019 Ngày nhận bài: 04/5/2020 Biên tập xong: 15/5/2020 41 Duyệt đăng: 20/5/2020 ... này, đồng nano chế tạo cách khử ion Cu2+ với NaBH4 chất khử, chitosan làm chất ổn định, chế ổn định hạt đồng nano chitosan thảo luận Ngoài ra, sản phẩm tạo thành kiểm tra hoạt tính chống nấm nồng... kích thước hạt xác định kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) thiết bị JEM-1400 2.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Dung dịch keo đồng nano sau chế tạo, khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Aspergillus... dịch keo đồng nano [3] 37 SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No 71 (05/2020) Hình Giản đồ XRD chitosan đồng nano ổn định chitosan Giản đồ XRD chitosan vật liệu đồng nano ổn định chitosan