Nghiên cứu xử lý nâng cao giá trị của bã đậu nành (okara) bởi bacillus amyloliquefaciens n1 và lactobacillus fermentum dc4t2

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan luận văn tiến hành nghiên cứu cách nghiêm túc kết nhà nghiên cứu trước tiếp thu cách chân thực, cẩn thận, có trích nguồn dẫn cụ thể luận văn Nếu khơng nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Huế, ngày 27 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Thị Kim Anh ii LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình tổ chức cá nhân Tôi xin cảm ơn đến Thầy Cơ giáo khoa Cơ Khí - Cơng Nghệ, Phòng Đào tạo Sau đại học, tất quý Thầy Cô khác Trường Đại học Nông Lâm Huế truyền đạt kiến thức quý giá cho suốt q trình học trường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo PGS.TS Đỗ Thị Bích Thủy tận tình, bảo giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến giáo viên bạn phịng thí nghiệm khoa Cơ Khí - Cơng Nghệ, Trường Đại học Nông Lâm anh, chị cơng tác Phịng thí nghiệm khoa Hóa Học, Trường Đại Học Khoa Học, Đại học Huế nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, Lãnh đạo anh, chị đồng nghiệp Trung tâm Y tế huyện Bố Trạch - tỉnh Quảng Bình ủng hộ, chia sẻ, giúp đỡ hỗ trợ mặt suốt thời gian qua Do thân thiếu kinh nghiệm nên luận văn hạn chế thiếu sót Rất mong thơng cảm đóng góp ý kiến từ quý thầy cô bạn bè để luận văn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày 27 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Thị Kim Anh iii TÓM TẮT Ở giới Việt Nam, năm, lượng bã đậu nành (okara), phế phụ phẩm trình sản xuất sữa đậu nành, thải lớn Okara chứa hàm lượng nước lớn nên bị thối hỏng sau đến ngày bảo quản Các hợp chất carbohydrate có okara rafinose, stachyose, chất xơ thường khó tiêu hóa nên giá trị dinh dưỡng khơng cao Trong cơng trình này, chúng tơi tiến hành “Nghiên cứu xử lý nâng cao giá trị bã đậu nành (okara) Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2” với mục đích nâng cao giá trị sử dụng bã đậu nành, phế phụ phẩm nhà máy sản xuất sữa đậu nành Theo đó, xây dựng sơ đồ công nghệ nghiên cứu xử lý okara riêng rẽ Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2 Tỷ lệ okara xử lý riêng rẽ phối trộn lại theo tỷ lệ khác theo dõi tiêu hoạt độ protease, amylase, hàm lượng đường khử, nitơ formol trình bảo quản để xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp Kết quả, quy trình cơng nghệ xử lý nâng cao giá trị sử dụng kéo dài thời gian bảo quản bã đậu nành xác định với thông số công nghệ sau: Bước 1: Xử lý bã đậu nành riêng rẽ chế phẩm vi sinh theo thông số công nghệ sau: - Đối với chủng Lactobacillus fermentum DC4t2: + Mật độ gieo cấy ban đầu: 106 CFU/g + Thời gian ủ 22 giờ; + Nhiệt độ 43oC - Đối với chủng Bacillus amyloliquefaciens N1: + Mật độ gieo cấy ban đầu: 107CFU/g + Quá trình ủ chia làm hai giai đoạn: * Giai đoạn ủ 37oC để vi khuẩn phát triển sinh khối sinh tổng hợp enzyme ngoại bào với thời gian ủ thích hợp 24 * Giai đoạn ủ với nhiệt độ thích hợp 45oC để tạo điều kiện cho enzyme hoạt động thủy phân Bước 2: Phối trộn bã đâu nành xử lý chủng Lactobacillus fermentum DC4t2 Bacillus amyloliquefaciens N1 để bảo quản nhiệt độ thường Tỷ lệ khối lượng mẫu xử lý Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2 thích hợp 2:1 iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ .ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn .2 Tính đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Thành phần bã đậu nành tác dụng lên men vi sinh vật .3 1.2 TỔNG QUAN VỀ Bacillus sp 1.2.1 Khả sinh tổng hợp amylase Bacillus sp 1.2.2 Khả sinh tổng hợp protease Bacillus sp 1.2.3 Khả sinh tổng hợp cellulase Bacillus sp 1.2.4 Khả sinh tổng hợp lipase Bacillus sp 1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 10 1.3.1 Tiềm probiotic vi khuẩn lactic 11 1.3.2 Lên men lactic vi khuẩn lactic 12 1.4 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 13 1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu nước 13 1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu nước 17 v CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình thuỷ phân bã đậu nành Bacillus amyloliquefciens N1 .20 2.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men bã đậu nành Lactobacillus fermentum DC4t2 20 2.2.3 Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối trộn bã đậu nành xử lý riêng rẽ Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2 ảnh hưởng đến số tiêu thời gian bảo quản .20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Các phương pháp sử dụng để phân tích vi sinh hóa sinh 20 2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm để nghiên cứu nội dung đề tài .23 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH THUỶ PHÂN BÃ ĐẬU NÀNH BỞI Bacillus amyloliquefaciens N1 25 3.1.1 Ảnh hưởng mật độ gieo cấy ban đầu Bacillus amyloliquefaciens N1 lên hoạt độ enzyme khả thủy phân bã đậu nành 25 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh enzyme ngoại bào bã đậu nành 26 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian ủ lên mật độ tế bào sống bã đậu nành .27 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ lên khả thủy phân bã đậu nành chế phẩm vi sinh Bacillus amyloliquefaciens N1 28 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN BÃ ĐẬU NÀNH BỞI Lactobacillus fermentum DC4t2 29 3.2.1 Ảnh hưởng mật độ gieo cấy ban đầu lên phát triển số lượng tế bào sống Lactobacillus fermentum DC4t2 bã đậu nành .30 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên phát triển số lượng tế bào sống Lactobacillus fermentum DC4t2 bã đậu nành 30 vi 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ PHỐI TRỘN CỦA BÃ ĐẬU NÀNH ĐÃ ĐƯỢC XỬ LÝ RIÊNG RẼ BỞI Bacillus amyloliquefaciens N1 VÀ Lactobacillus fermentum DC4t2 ẢNH HƯỞNG ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU TRONG THỜI GIAN BẢO QUẢN 31 3.3.1 Biến đổi hoạt độ amylase 32 3.3.2 Biến đổi hoạt độ protease 32 3.3.3 Biến đổi hàm lượng nitơ formol 34 3.3.4 Sự biến đổi hàm lượng đường khử 35 3.3.5 Sự biến đổi giá trị pH hàm lượng acid tổng trình bảo quản 36 3.3.6 Hàm lượng NH3 hỗn hợp sau bảo quản 15 ngày 37 3.3.7 Mật độ tế bào sống hỗn hợp sau 15 ngày bảo quản 38 3.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NÂNG CAO GIÁ TRỊ SỬ DỤNG BÃ ĐẬU NÀNH Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 39 3.4.1 Giai đoạn xử lý riêng rẽ 39 3.4.2 Giai đoạn xử lý kết hợp 39 3.4.3 Tính chất chế phẩm thu 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .41 4.1 KẾT LUẬN 41 4.2 ĐỀ NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 49 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết tắt BĐN : Bã đậu nành DNS : Dinitrosalisilic acid ĐC : Đối chứng LAB : Lactic acid bacteria MRS : The Man, Rogosa and Sharpes NMR : Monophosphate nucleoside OD : Optical Density TCA : Trichloacetic acid viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần bã đậu nành Bảng 3.1 Ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu B amyloliquefaciens N1 lên hoạt độ enzyme BĐN 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy B amyloliquefaciens N1 lên hoạt độ enzyme ngoại bào BĐN 27 Bảng 3.3 Hoạt độ enzyme hàm lượng nitơ formol đường khử BĐN ủ với B amyloliquefaciens N1 nhiệt độ khác .29 Bảng 3.4 Mật độ tế bào sống tương ứng với tỷ lệ phối trộn khác BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 sau 15 ngày bảo quản (lg CFU/g) 38 ix DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ chế biến hạt đậu nành tạo thành okara Hình 1.2 Trạng thái okara Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian lên số lượng tế bào sống bã đậu nành sau ủ với B amyloliquefaciens N1 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng mật độ gieo cấy ban đầu lên số lượng tế bào sống bã đậu nành sau ủ với L fermentum DC4t2 30 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên số lượng tế bào sống L fermentum DC4t2 bã đậu nành sau ủ .31 Hình 3.4 Sự biến đổi hoạt độ amylase theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ bã đậu nành xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) 32 Hình 3.5 Sự biến đổi hoạt độ protease theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) .33 Hình 3.6 Sự biến đổi hàm lượng nitơ formol theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) 34 Hình 3.7 Sự biến đổi hàm lượng đường khử theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L.fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) 35 Hình 3.8 Sự biến đổi pH theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) 36 Hình 3.9 Sự biến đổi hàm lượng acid tổng theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 0:1 tỷ lệ BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2) 36 x Hình 3.10 Hàm lượng NH3 hỗn hợp bảo quản 15 ngày sau phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1và L fermentum DC4t2 37 Hình 3.11 Sơ đồ cơng nghệ xử lý bã nâng cao giá trị sử dụng bã đậu nành hai giai đoạn 40 65 * Tỉ lệ 0:1 Duncana Thời gian ủ (ngày) Subset for alpha = 0.05 N 15.00 3.79967 13.00 3.80100 11.00 9.00 7.00 5.00 1.00 3.00 00 Sig 3.94067 4.11167 4.33867 4.64133 5.00133 5.10133 5.17100 731 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 2.3.5 Sự biến đổi pH theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 tỉ lệ khác * Tỉ lệ 1:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile1.1 N 11.00 3.65000 15.00 3.65000 13.00 9.00 7.00 5.00 3.00 00 1.00 Sig 3.84000 4.15000 4.68000 5.03000 5.63000 5.83000 6.14000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 66 * Tỉ lệ 1:2 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile1.2 N 15.00 3.72000 13.00 3.74000 9.00 3.82967 11.00 3.84000 7.00 5.00 3.00 1.00 00 Sig 3.93000 4.57000 5.20000 5.30000 5.40033 475 710 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 * Tỉ lệ 2:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile2.1 N 11.00 3.63000 15.00 13.00 9.00 7.00 5.00 3.00 1.00 00 Sig 3.79000 3.83000 4.03000 4.57000 4.74000 5.06000 5.74000 5.84033 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 67 * Tỉ lệ 0:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile0.1 N 9.00 3.26000 5.00 3.28000 3.28000 7.00 3.29000 3.29000 11.00 15.00 3.36000 13.00 3.37000 3.00 1.00 00 3.33000 3.33000 4.04000 4.35000 4.60000 Sig .253 063 132 1.000 1.000 1.000 * Đối chứng Duncana Subset for alpha = 0.05 tileDC N 00 7.04000 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 15.00 13.00 Sig 7.12000 7.24000 7.82000 7.93000 8.09000 8.31000 8.80000 8.89000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 68 2.3.6 Sự biến đổi acid tổng theo thời gian bảo quản nhiệt độ thường phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 tỉ lệ khác * Tỉ lệ 1:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile1.1 N 00 1.59000 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 2.68000 15.00 2.71000 13.00 Sig 1.94000 2.04000 2.18000 2.38000 2.61000 2.71000 2.73000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 140 317 * Tỉ lệ 1:2 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile1.2 N 00 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 3.40000 13.00 3.45000 15.00 Sig 2.28033 2.67000 2.92000 3.08000 3.26000 3.33000 3.51000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 054 1.000 69 * Tỉ lệ 2:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile2.1 N 00 1.61000 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 2.86000 15.00 2.89000 13.00 Sig 2.00967 2.22000 2.39000 2.65000 2.79000 2.89000 2.91000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 179 363 * Tỉ lệ 0:1 Duncana Subset for alpha = 0.05 tile1.0 N 00 2.60967 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 Sig 2.97000 3.29000 3.50000 3.68000 3.90000 3.97000 4.02000 4.12000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 70 2.4.7 Sự biến đổi hàm lượng NH3 hỗn hợp bảo quản 15 ngày sau phối trộn BĐN xử lý B amyloliquefaciens N1 L fermentum DC4t2 Duncana Subset for alpha = 0.05 Tỉ lệ N 01:01 01300 0:01 01700 02:01 01:02 ĐC Sig 01700 01867 02833 42867 110 482 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 1.000 1.000 71 Phụ lục 3: Cách tiến hành phương pháp nghiên cứu 3.1 Xác định hoạt độ protease phương pháp Anson cải tiến - Chuẩn bị mẫu thử, cân xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml Dùng nước cất để hịa tan mẫu chuyển toàn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức 100 ml, sau cho thêm nước cất cho 100ml Tiến hành lắc sau đem lọc - Nguyên tắc phương pháp định lượng sản phẩm tạo thành trình thủy phân chất casein protease phản ứng màu với thuốc thử Folin - Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) ủ 30oC, 10 phút; chuẩn bị eppendorf sạch, cho vào eppendorf thí nghiệm 175µl dung dịch enzyme - Ngưng phản ứng dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ thể tích dung dịch axit cho thể tích enzyme; - Ly tâm thu dịch để thực phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi:dung dịch Na2CO3:Folin 0,2N = 1:4:1) - Thực đồng thời mẫu kiểm tra cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước ủ với chất - Độ hấp thụ ánh sáng (OD) dung dịch màu thu sau phản ứng đo máy quang phổ kế bước sóng 750nm Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine, để tính sản phẩm tạo thành tương ứng tác dụng enzyme Một đơn vị hoạt độ protease (HP) định nghĩa lượng enzyme mà phút 30oC có khả phân giải protein tạo thành sản phẩm hoà tan axit tricloacetic, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine - Tính kết quả: từ kết OD đo + Dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrozin tương ứng + Tính số đơn vị hoạt động proteolitic 1ml dung dịch enzyme lấy xác định hoạt độ theo công thức: HP/ml = µmol tyrozin đơn vị t Trong đó: t: thời gian phản ứng 8: số phần thể tích dung dịch phản ứng 72 Hoạt độ tính theo gam HP/g = Trong đó: HP/ml ×a 𝑏 a: số ml dịch enzyme trích ly ly tâm b: số gam canh trường B amyloliquefaciens N1 đem ly tâm - Phương trình đường chuẩn tyrosine: y = 1,8207x + 0,0501 y: OD750nm, x: nồng độ tyrozin µmol/ml 3.2 Xác định hoạt độ amylase phương pháp Bernfiel - Tinh bột sử dụng làm chất để xác định hoạt độ amylase sở định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử 3,5- axit dinitrosalisilic (hòa tan 1g axit 3,5-dinitrosalisilic (DNS) 20 ml NaOH 2N 50ml nước cất, cho thêm 30g kali/natri tartrate dẫn nước đến 100 ml) - Độ hấp thụ ánh sáng (OD) đo máy quang phổ bước sóng 540 nm Dựa vào đường chuẩn để tính sản phẩm tạo thành tác dụng enzyme - Chuẩn bị mẫu thử, cân xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml Dùng nước cất để hịa tan mẫu chuyển tồn (cả nước tráng cốc ) vào bình định mức 100 ml, sau cho thêm nước cất cho 100ml Tiến hành lắc sau đem lọc - Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml 1% tinh bột (hòa tan 1g tinh bột 35mg NaCl 60ml dịch đệm phosphate, pH = 7, đun sôi tan, để nguội dẫn đến 100ml) 0,1ml dung dịch enzyme + Hỗn hợp phản ứng ủ 10 phút 30C, + Tiếp tục cho vào hỗn hợp 0,2 ml dung dịch 1% DNS ủ 10 phút 100C, sau đó, ủ 10 phút nước đá + Bổ sung ml nước cất vào hỗn hợp so màu 540nm - Mẫu trắng làm song song với mẫu chuẩn enzyme bị biến tính 10 phút nước sơi 1% DNS - Lượng đường khử tạo thành xác định dựa vào đường chuẩn maltose Một đơn vị hoạt độ α-amylase xác định lượng μmol maltose tạo thành ml dịch enzyme thời gian phút 30C - Tính kết quả: Từ giá trị OD thu được, dựa vào phương trình đường chuẩn maltose để biết nồng độ maltose Một đơn vị hoạt độ α- amylase xác định lượng μ mol maltose tạo thàmh 1ml dịch enzyme thời gian phút nhiệt độ 30oC Hoạt độ (U/ml) Trong t: v: = 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑒 𝑡×𝑣 Thời gian phản ứng Thể tích enzyme 73 Hoạt độ U/g = 𝑈/𝑚𝑙×𝑎 𝑏 a: Số ml dịch enzyme trích ly ly tâm b: Số gam canh trường vi sinh vật đem ly tâm - Phương trình đường chuẩn maltose : y = 0,0507x + 0,014 y: OD540nm, x: Nồng độ maltose µmol/ml 3.3 Định lượng hàm lượng đường khử phương pháp Bertrand - Nguyên tắc: Phương pháp dựa sở mơi trường kiềm (glucose, fructose, maltose) dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua tính lượng đường khử - Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử fehling Thuốc thử fehling hỗn hợp (1:1) hai dung dịch Dung dịch đồng sunfat gọi fehling I (fehling A) dung dịch kiềm muối Seignett (muối Kali natri tactrat) gọi fehling II (fehling B) - Khi trộn hai dung dịch fehling với phản ứng chúng theo hai giai đoạn Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hydroxit màu xanh da trời CuSO4 + NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 Sau Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối phức hòa tan, dung dịch có màu xanh thẫm Muối phức hợp chất khơng bền Các đường có chứa nhóm andehit xeton dễ dàng khử Cu2+ thành Cu1+, tạo kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch đường bị oxy hóa tác dụng với dung dịch fehling Để định lượng đồng (I) oxit tạo thành, trước hết oxy hóa sắt (III) sunfat amoni sắt kép sunfat mơi trường axit sunfuric, Cu1+ bị oxy hóa trở lại thành Cu2+, Fe3+ bị khử thành Fe2+ Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4→ 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Lượng Fe2+ tạo thành xác định cách oxy hóa nhờ dung dịch KMnO mơi trường axit 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4→ K2SO4+ 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + H2O Biết lượng KMnO4(1/30N) dùng để chuẩn độ lượng đồng tạo thành, dựa vào bảng tỷ lệ trực tiếp lượng KMnO4 (1/30N) đường khử thực nghiệm, tính đường dung dịch thí nghiệm - Hóa chất + Dung dịch fehling A: CuSO4.5H2O 4% 74 + Dung dịch fehling B: cân 200g muối Seignett 150g NaOH hịa tan nước chuyển vào bình định mức lít thêm nước cất đến vạch mức, lắc + Dung dịch Fe2(SO4)3 axit sunfuric: hòa tan 50g Fe2(SO4)3trong 400ml H2O, thêm từ từ thận trọng 100ml H2SO4 đậm dặc, để nguội thêm nước cất đến 1000ml + KMnO4 1/30N: cân 1,06g KMnO4 lít nước cất, đun nóng đến tan - Cách tiến hành: + Lấy 10ml dung dịch thí nghiệm có chứa khoảng 0,8 - 40mg đường cho vào bình nón dung tích 100ml + Thêm vào 10ml dung dịch fehling (5ml fehling A + 5ml fehling B) + Đun sôi hỗn hợp phút + Để lắng kết tủa, lọc vào bình lọc chân khơng Buchner (phễu lọc xốp chuyên dùng để định lượng đường) + Rửa bình phễu lọc nước cất nóng - lần cần ý cho giữ phần lớn kết tủa đồng (I) oxit phễu bình nón ln phủ lớp nước nóng, tránh cho Cu2O khỏi bị oxy hóa khơng khí + Hịa tan kết tủa đồng (I) oxit vào bình Buchner cách cho lượng nhỏ (5ml) dung dịch Fe2(SO4)3 môi trường H2SO4 dùng đũa thủy tinh khuấy thật cẩn thận để hịa tan hồn tồn kết tủa đồng oxit phễu + Tráng cẩn thận bình phễu lọc nước cất nóng, cho vào bình nón + Chuẩn độ dung dịch thu KMnO4 1/30N xuất màu hồng nhạt bền khoảng 20 - 30 giây + Tính lượng KMnO4 chuẩn độ, tra bảng suy lượng đường có mẫu thí nghiệm Song song làm thí nghiệm đối chứng cách thay dung dịch đường nước cất - Tính kết quả: X= 𝑎 × V × 100 𝑉1 × 𝑤 × 1000 Trong đó: X: Hàm lượng đường khử tính theo % a: Số mg glucose tìm tra bảng ứng với ml KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm trừ số ml KMnO4 1/30N chuẩn độ mẫu đối chứng V: Dung tích bình định mức V1: Lượng dung dịch lấy để xác định đường khử (ml) 75 w: Lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: Hệ số tính chuyển thành % 1000: Hệ số đổi gam thành mg 3.4 Xác định hàm lượng Nitơ formol - Ngun tắc Axit amin hịa tan nước có tính chất muối nội phân tử, nhóm amin cacboxyl trung hịa lẫn Nhóm –COO- axit amin bị cản trở nhóm amin nên khơng thể chuẩn độ trực tiếp Trong fomandehyt, nhóm amin axit amin phản ứng với nhóm andehyt cho metylen, kết phản ứng nhóm amin tính chất nó, ngược lại nhóm cacboxyl axit amin tồn dạng metylen không bị cản trở chuẩn độ Số nhóm cacboxyl tự số nhóm amin liên kết với fomandehyt, chuẩn độ nhóm cacboxyl xác định nhóm amin Vì cho phép định lượng axit amin có dung dịch nghiên cứu - Hóa chất + Dung dịch NaOH 0,1N + Dung dịch fomandehyt trung hòa: lấy 50ml fomandehyt 30% cho 0,1ml phenolphtalein 1% chỉnh NaOH 0,1N đến có màu hồng nhạt + Dung dịch phenolphtalein 1% - Cách tiến hành + Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1% + Để trung hòa dung dịch axit amin, cho giọt NaOH 0,1N đến xuất màu vàng nhạt + Cho thêm 20 ml dung dịch fomandehyt 30% trung hịa lắc bình nón Sau phút, dung dịch màu + Chuẩn độ NaOH 0,1N đến xuất màu vàng nhạt trở lại Thí nghiệm kiểm tra tiến hành tương tự với hóa chất thay dung dịch axit amin nước cất thể tích + Tính kết quả: 1ml dung dịch NaOH tương đương 1,4mg nitơ Số mg nito amin dung dịch nghiên cứu tính theo cơng thức: mgN = (A – B) × 1,4 đó: A- Số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm B- Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 76 3.5 Phương pháp xác định hàm lượng NH3 - Chuẩn bị mẫu thử, cân xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml Dùng nước cất để hịa tan mẫu chuyển tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức 250 ml, sau cho thêm nước cất cho 250 ml Tiến hành lắc sau đem lọc - Dùng pipet hút xác 50ml dịch lọc vào bình Kejldahl, thêm tiếp 20ml nước cất, giọt phenolphatalein 1% cho dung dịch magie oxyt 5% bình xuất màu hồng - Đặt bình Kejldahl có chứa mẫu xử lý vào vị trí bên trái hệ thống chưng cất đạm, đặt bình hứng chứa 20ml dung dịch acid sunfuric 0,1N vào vị trí bên phải hệ thống chưng cất - Bật hệ thống chưng cất để hệ thống chân cất sục vào bình, trình chưng cất bắt đầu, khí bay lên ngưng tụ chảy vào bình hứng - Khi chưng cất khoảng 10p, dùng giấy đo pH thử dịch chảy đầu ống ngưng Nếu giấy khơng có màu xanh nghĩa trình chưng cất kết thúc Lấy bình hứng chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N dung dịch có màu xanh mạ - Tiến hành xác định mẫu trắng với lượng hóa chất, nước cất với bước tiến hành tương tự 77 Phụ lục 4: Một số hình ảnh trình nguyên cứu Tủ sấy Nồi hấp khử trùng Thiết bị phân tích NH3 phương pháp kjeldahl Phản ứng tạo màu emzyme Ủ BĐN tủ ấm 78 BĐN phối trộn Máy ly tâm Máy đo pH Ủ bã đậu nành 79 Den p1s1-p3s2,p5s2-27,29,38-76 P4s2,28,30-37,77,78 ... hóa nên giá trị dinh dưỡng khơng cao Trong cơng trình này, chúng tơi tiến hành ? ?Nghiên cứu xử lý nâng cao giá trị bã đậu nành (okara) Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2? ??... trình lên men bã đậu nành Lactobacillus fermentum DC4t2 2.2.3 Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối trộn bã đậu nành xử lý riêng rẽ Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2 ảnh hưởng... quản bã đậu nành Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông số công nghệ việc xử lý nâng cao giá trị sử dụng bã đậu nành Bacillus amyloliquefaciens N1 Lactobacillus fermentum DC4t2