Nghiên cứu nhân giống cây ngãi đen

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN VÙNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY NGẢI ĐEN (KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL EX BAKER) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ” Cơ quan chủ quản : Bộ Khoa học Công nghệ Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Nghiên cứu Phát triển Vùng Hà Nội – 2020 i MỤC LỤC HÀ NỘI – 2020 I PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 1.3 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NGẢI ĐEN 2.1.1 KHÁI QUÁT VỀ CHI KAEMPFERIA 2.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO (VI NHÂN GIỐNG) 3 2.2.1 Các phương pháp nuôi cấy mô 10 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật .11 2.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 15 2.2.3.1 Khử trùng mô nuôi cấy 15 2.2.3.2 Tái sinh mẫu 15 2.2.3.3 Nhân nhanh 15 2.2.4 Giai đoạn huấn luyện đưa môi trường thực tiễn sản xuất .16 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 19 19 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng mẫu kích thước mẫu ni cấy invitro Ngải đen 19 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng 19 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% 20 3.3.2 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (TẠO CHỒI) ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI 20 PHƯƠNG PHÁP NHÂN NHANH IN VITRO: 20 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM: THÍ NGHIỆM BỐ TRÍ THEO KIỂU NGẪU NHIÊN HỒN TỒN VỚI CƠNG THỨC, MỖI CÔNG THỨC LẦN NHẮC LẠI, MỖI LẦN NHẮC LẠI CÂY 10 BÌNH, MỖI BÌNH CẤY CHỒI THÍ NGHIỆM ĐƯỢC BỐ TRÍ NHƯ SAU: 21 CHỈ TIÊU THEO DÕI SAU 30 NGÀY: HỆ SỐ NHÂN, CHẤT LƯỢNG CHỒI 21 CHÚ Ý: MT NỀN = MS (KHOÁNG ĐA LƯỢNG, VI LƯỢNG, VITAMIN) + INOSITOL 100MG/L + ĐƯỜNG 30G/L + AGAR 6G/L, PH = 5,6-5,8 21 LỰA CHỌN CHỒI NGẢI ĐEN CĨ TỪ 2-3 LÁ CHUYỂN SANG MƠI TRƯỜNG RA RỄ MƠI TRƯỜNG RA RỄ DỰA TRÊN MƠI TRƯỜNG MS CĨ BỔ SUNG CÁC NỒNG ĐỘ NAA VÀ NỒNG ĐỘ IAA KHÁC NHAU ĐỂ KÍCH THÍCH TẠO RỄ BẤT ĐỊNH, HÌNH THÀNH CÂY CON HOÀN CHỈNH 22 HỆ SỐ NHÂN CHỒI (LẦN) 23 = 23 TỔNG SỐ CHỒI (CHỒI) 23 TỔNG SỐ MẪU NI CẤY (MẪU) 23 SỐ RỄ TRUNG BÌNH/CÂY (RỄ) 23 = 23 TỔNG SỐ RỄ RA (RỄ) 23 TỔNG SỐ MẪU CẤY (MẪU) 23 TỶ LỆ CÂY SỐNG (%) 23 = 23 TỔNG SỐ CÂY SỐNG (CÂY) 23 ii X 100% TỔNG SỐ CÂY BAN ĐẦU (CÂY) TỶ LỆ CÂY CHẾT (%) = TỔNG SỐ CÂY CHẾT (CÂY) X 100% TỔNG SỐ CÂY BAN ĐẦU (CÂY) 23 23 23 23 23 23 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 NGHIÊN CỨU CƠ QUAN SỬ DỤNG LÀM VẬT LIỆU VÀO MẪU NGẢI ĐEN 24 Bảng 4.1 Kết nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu 24 Biểu đồ 4.1 Kết nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu 24 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO VẬT LIỆU SẠCH NẤM, VI KHUẨN CỦA NGẢI ĐEN 24 Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen 25 Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể kết nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen 25 Hình 4.1 Ảnh Ngải đen bệnh sau tái sinh chồi 26 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn 27 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng 27 HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen 27 (sau 10 ngày nuôi cấy) 27 Biểu đồ 4.3 Biểu đồ thể hiên kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen (sau 10 ngày nuôi cấy) 28 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (TẠO CHỒI) ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI NGẢI ĐEN 29 4.2.1 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG MS, B5, WPM ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI NGẢI ĐEN 29 BẢNG 4.4 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG MS, B5, WPM ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI NGẢI ĐEN (SAU 20 NGÀY NUÔI CẤY) 29 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ thể ảnh hưởng môi trường MS, B5, WPM đến khả tái sinh chồi Ngải đen (sau 20 ngày nuôi cấy) 30 4.2.2 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI NGẢI ĐEN 31 BẢNG 4.5 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI NGẢI ĐEN (SAU 30 NGÀY NUÔI CẤY)31 4.2.3 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA KẾT HỢP VỚI KINETIN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI NGẢI ĐEN 33 34 Biểu đồ 4.6 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 KẾT LUẬN 5.2 KIẾN NGHỊ 37 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP : Adenosin triphosphat AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CV : Coefficient of Variation CT : Công thức ĐC : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid PE : Polyetylen TN : Thí nghiệm RNA : Axit ribonucleic WPM : Woody Plant Medium iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân bố số loài thuộc chi Kaempferia Việt Nam Bảng 1.2 Bảng tóm tắt thành phần hóa học chi Kaempferia L Bảng 4.1 Kết nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu 24 Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen (Sau 10 ngày nuôi cấy) 25 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen (sau 10 ngày nuôi cấy) 27 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng môi trường MS, B5, WPM đến khả tái sinh chồi Ngải đen (sau 20 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Ngải đen (sau tuần nuôi cấy) 34 v DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Kết nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu 24 Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể kết nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen (sau 10 ngày nuôi cấy) 26 Biểu đồ 4.3 Biểu đồ thể hiên kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Ngải đen (sau 10 ngày nuôi cấy) 28 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ thể ảnh hưởng môi trường MS, B5, WPM đến khả tái sinh chồi Ngải đen (sau 20 ngày nuôi cấy) 30 Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Biểu đồ 4.6 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Biểu đồ 4.7 Biểu đồ thể ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Ngải đen 35 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Ngải đen Hình 1.2 Cụm Ngải đen Hình 1.3 Hình ảnh hoa cụm hoa Ngải đen Hình 4.1 Ảnh Ngải đen bệnh sau tái sinh chồi 24 Hình 4.2 Kết ảnh hưởng chất khử trùng công thức đến vật liệu vào mẫu Ngải đen 25 Hình 4.3 Kết ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả tạo mẫu Ngải đen nấm, vi khuẩn (sau ngày ni cấy) 27 Hình 4.4 Chồi Ngải đen công thức nồng độ BA khác 31 vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) gọi sâm thái, địa liền đen thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Ngải đen sử dụng loại thuốc dân gian có tác dụng như: kích thích tiêu hóa, cải thiện lưu lượng máu tăng cường sức khỏe Các chiết xuất hoạt chất sinh học củ gừng đen có tác dụng kháng khuẩn mạnh giúp điều trị bệnh dị ứng (Tewtrakul cs., 2007), chống loét dày (Rujanawate cs., 2005), chống viêm (Panthong cs., 1989), kháng ký sinh trùng sốt rét kháng nấm (Yenjai cs., 2004), Ngoài ra, theo Trisomboon (2009), củ ngải đen xem nhân sâm Thái, có khả tăng cường sinh lực, tăng mật độ tinh trùng tăng cường sức đề kháng thể stress, làm giảm triglycerides, ngăn ngừa bệnh tiểu đường Trên giới, ngải đen chưa trồng với quy mô lớn chưa có nhiều nghiên cứu nhân giống Một số cơng trình nghiên cứu canh tác Ngải đen, Iwana (2014), nghiên cứu nhân giống Kaempferia parviflora trồng số thành phần môi trường nồng độ Paclobutrazol khác Catherine et al (2014), mơ tả hình thái Kaempferia parviflora thúc đẩy chồi ngủ xử lý BAP Ethephon Muaz et al (2014), Kaempferia parviflora có tiềm để phát triển cho thuốc Indonesia Một vấn đề canh tác Kaempferia parviflora thiếu hụt giống sẵn có thời gian ngủ đơng dài Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khác BAP ethephon, ảnh hưởng điều kiện phát triển trước phá vỡ trạng thái ngủ tốc độ tăng trưởng thân rễ K.parviflora Một số nghiên cứu trồng trọt, Jeff et al (2005), ảnh hưởng cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng chất làm chậm sinh trưởng đến sản xuất Kaempferia parviflora (họ Zingiberacea) trồng chậu cảnh Khumaida (2012), nghiên cứu điều kiện độ cao che bóng ảnh hưởng đến tăng trưởng sinh dưỡng Kaempferia parviflora Ở Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố kết nghiên cứu nhân giống vơ tính Ngải đen Do đó, nghiên cứu thực nhằm bước đầu xây dựng quy trình nhân giống vơ tính Ngải đen tạo số lượng giống lớn, bệnh, đồng phục vụ cho công tác bảo tồn phát triển nguồn gen quý Để tạo nguồn vật liệu bệnh, số lượng giống lớn, đồng phục vụ cho công tác bảo tồn phát triển nguồn gen quý này, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu nhân giống vơ tính Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) kỹ thuật nuôi cấy mơ” để tìm quy trình nhân nhanh đạt hiệu kinh tế cao 1.2 Mục đích đề tài - Nghiên cứu, xây dựng bước quy trình nhân giống Ngải đen phương pháp invitro 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định phương pháp ảnh hưởng số chất khử trùng đến trình tạo mẫu bệnh Ngải đen - Xác định quan vào mẫu phù hợp - Xác định mơi trường thích hợp nhân nhanh cụm chồi Ngải đen - Xác định môi trường rễ tối ưu 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Quá trình nghiên cứu đánh giá xác định phương pháp hóa chất khử trùng, quan vào mẫu để tạo mẫu bệnh; chất kích thích sinh trưởng dưỡng chất cần cung cấp để tạo chồi rễ khỏe mạnh, phát triển tốt đồng - Kết nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitro Ngải đen 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Ngải đen, nâng cao hiệu trình nhân giống, tạo nguồn giống đồng đều, chất lượng tốt, đem lại hiệu kinh tế áp dụng vào sản xuất đại trà PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Ngải đen 2.1.1 Khái quát chi Kaempferia 2.1.1.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan công bố năm 2009, chi Kaempferia có vị trí phân loại sau: Giới: Thực vật – Plantae Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật mầm Liliopsida Phân lớp: Gừng - Zingiberidae Bộ: Gừng - Zingiberables Họ: Gừng – Zingibericeae 2.1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây thân thảo nhỏ, đầu rễ thường phình lên thành dạng củ Thân giả ngắn khơng có Lá ít, phiến gần tròn đến dạng chỉ; cuống ngắn; lưỡi thường nhỏ hay khơng có Cụm hoa mọc bẹ hay từ thân rễ, hoa xuất trước sau có Các bắc xếp xoắn, bắc chứa hoa, bắc nhỏ, đầu xẻ thành hai thùy, xẻ sâu đến gốc Hoa có đài dạng ống phần dưới, phần xẻ vát xuống bên, đầu chia 2-3 thùy Cánh mơi màu trắng hay hồng, đơi có đốm màu sắc khác gần gốc cánh môi, đầu xẻ nơng hay sâu thành thùy Nhị có nhị dạng ngắn hay khơng có; bao phấn ơ, nỗn nhiều Qủa nang hình cầu hay bầu dục dài Hạt gần tròn hay bầu dục dài, áo hạt xẻ không 2.1.1.3 Đa dạng phân bố Theo trang The Plant list có 38 lồi thuộc chi Karmpferia Chi Kaempferia phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, Nam Á, Đông Nam Á, tập trung số nước: Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia Việt Nam Trong nước, chi Kaempferia có 9-10 lồi Phân bố số lồi thuộc Kaempferia Việt Nam trình bày bảng 1.1 Hình 4.4 Chồi Ngải đen cơng thức nồng độ BA khác Như với nồng độ BA 0,5mg/l cho hệ số nhân chồi cao đạt 3,8 chồi, chất lượng chồi trung bình sử dụng cho nghiên cứu 4.2.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi Ngải đen thể qua bảng 4.3 hình 4.3: Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) Công thức Nồng độ BA mg/l Nồng độ Kinetin mg/l Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng chồi (chồi) Hệ số nhân (lần) Chất lượng chồi CT1 0,5 30 117 3,9 Chồi tốt CT2 0,5 0,1 30 126 4,2 Chồi CT3 0,5 0,3 30 138 4,6 Chồi CT4 0,5 0,5 30 132 4,4 Chồi CT5 0,5 1,0 30 123 4,1 Chồi tốt LSD.05 CV% 0,34 4,6 33 Biểu đồ 4.6 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy) Mục tiêu nhà nhân giống tạo hệ số nhân giống cao, đồng thời khỏe mạnh Nhóm Cytokine ứng dụng rộng rãi việc nâng cao hệ số nhân chồi phương pháp in vitro, việc tìm kiếm mơi trường cho hệ số nhân chồi cao mục tiêu nhà nhân giống Từ kết bảng 4.4 hình 4.4 cho thấy: Với giá trị LSD.05 đạt 0,34 CT3, CT4 có sai khác có ý nghĩa độ tin cậy 95%, hệ số nhân chồi cao CT3 với nồng độ 0,3mg/l đạt 4,6 chồi, CT4 nồng độ 0,5mg/l hệ số nhân chồi giảm khơng đáng kể cịn 4,4 chồi Các CT2 CT5 có sai khác cơng thức khơng có ý nghĩa CT1 (ĐC) cho hệ số nhân chồi thấp đạt 3,9 chồi/mẫu Kết giải thích sau: BA Kinetine cytokine có tác dụng phân bào, kích thích khả tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động mơ phân sinh, hạn chế hóa già tế bào (Ngơ Xn Bình cs, 2003) [11], (Vũ Văn Vụ cs, 2009) [12] Ảnh hưởng BA + Kinetin cho tốc độ nâng cao chồi báo cáo Saxena (1990); Bejoy Hariharan (1993); Vincent et al (1992b); Jinu Aravindan (2008) Chồi rễ đồng thời có nguồn gốc môi trường với TDZ, BA + TDZ, BA + Kinetin Như kết hợp nồng đồ BA (0,5mg/l) với Kinetin (0,3mg/l) cho hệ số nhân chồi cao 4,6 chồi 34 Các chất hữu sử dụng nhiều nuôi cấy mô thực vật Nhiều loại sinh trưởng, phát triển tốt bổ sung thêm lượng định chất hữu Nhiều chất hữu chứa amino acid, peptide, acid béo, carbohydrate, vitamin chất tăng trưởng thực vật nguồn bổ sung thiếu nuôi cấy nhiều loại thực vật (Thorpe cs., 2008) Do tính đề tài nên thí nghiệm đưa kết giải thích khơng so sánh kết thảo luận 4.3 Xác định môi trường rễ tối ưu cho chồi Ngải đen invitro Ra rễ khâu cuối gian đoạn nhân giống in vitro Chất kích thích sinh trưởng dùng chủ yếu giai đoạn thuộc nhóm auxin Các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn tách đưa vào trường kích thích tạo rễ Môi trường rễ bổ sung với hàm lượng NAA khác Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ chồi Ngải đen thể bảng 4.7 (sau tuần nuôi cấy) Bảng 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Ngải đen (sau tuần nuôi cấy) Công thức (CT) Nông độ NAA (mg/l) Tổng số mẫu (mẫu) Tổng số rễ (rễ) Số rễ (rễ) CT CT CT CT CT 0,0 0,2 0,5 1,0 1,5 30 30 30 30 30 55 85 98 109 92 1,8 2,8 3,2 3,6 3,0 0,1 2,0 LSD05 CV% 35 Chất lượng rễ Ngắn, nhỏ Mập, dài Mập, dài Nhỏ, dài Nhỏ, dài Biểu đồ 4.7 Biểu đồ thể ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Ngải đen Ở cơng thức có tổng số rễ 109 rễ tương đương 3,6 rễ/cây Từ kết bảng 4.7 cho thấy NAA có hiệu tích cực việc kích thích chồi rễ, tạo rễ bất định Số rễ tăng dần từ công thức đối chứng (0 mg/l NAA) đến công thức (bổ sung NAA 1mg/l) tương ứng đạt 1,8 rễ/cây đến 3,6 rễ/cây Ở công thức nghiên cứu nhận thấy hàm lượng NAA 1,5 mg/l số rễ/cây có xu hướng giảm xuống cịn rễ/cây NAA khơng ảnh hưởng tới số rễ mà ảnh hưởng đến chất lượng rễ Cụ thể cơng thức có bổ sung NAA cho chất lượng rễ cao so với không bổ sung NAA Chất lượng rễ tốt thí nghiệm công thức Nếu lựa chọn chất lượng rễ lựa chọn cơng thức (NAA 0,5 mg/l), lựa chon số rễ/cây lựa chọn cơng thức (NAA 1mg/l) Điều chứng minh NAA có hiệu tích cực việc tạo rễ bất định chồi Ngải đen 36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Vật liệu khởi đầu để sử dụng nhân giống in vitro Ngải đen tốt mầm củ già đoạn thân chứa chồi hình thành - Chế độ khử trùng tốt Ngải đen sử dụng HgCl2 0,1% thời gian phút (đạt 82,2%) - Môi trường tái sinh sử dụng môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH: 5,6-5,8, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 77,78% - Môi trường nhân nhanh sử dụng môi trường MS + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l + BA 0,5mg/l + agar 5,2mg/l, pH = 5,6-5,8 cho hệ số nhân nhanh đạt 3,8 lần + Môi trường nhân nhanh sử dụng môi trường MS + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l + BA 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + agar 5,2mg/l, pH = 5,6-5,8 cho hệ số nhân nhanh đạt 4,6 lần - Môi trường rễ sử dụng môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + NAA 1mg/l + agar 5,2g/l, pH = 5,6-5,8 cho khả rễ đạt 3,6 rễ/cây; chất lượng rễ nhỏ, dài + Môi trường rễ sử dụng môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + NAA 0,05mg/l + agar 5,2g/l, pH = 5,6-5,8 cho khả rễ đạt 3,2 rễ/cây; chất lượng rễ mập, dài 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu yếu tố khác quy trình in vitro quy trình chăm sóc giai đoạn vườn ươm với Ngải đen để tạo quy trình hoàn chỉnh - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng số chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh Ngải đen - Nghiên cứu đưa Ngải đen trồng vườn trồng Nghiên cứu hoạt chất dược lý Ngải đen 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt 1) Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, III, Nxb Trẻ, 1999 2) Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Nxb KH&KT, Hà Nội, Tập I-II, 2006 3) Nguyễn Tập (2007), Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam Mạng lưới Lâm sản gỗ Việt Nam, 2007, Tr.1-233 4) Nguyễn Thị Ngọc Huệ (2013), Bàn định hướng bảo tồn nguồn gen gừng (Zingiber spp.) Việt Nam http://www.pgrvietnam.org.vn/? lang=vi&tab=news&pid=21&cid=21&id=603 5) Hoàng Thị Sản (2006), Phân loại học thực vật, Nxb Đại học Sư phạm 6) Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập 2-Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục 7) Mai Thị Thúy, Ninh Thị Phíp (2013), “Ảnh hưởng giá thể khối lượng củ giống đến sinh trưởng suất gừng trồng bao Gia Lâm, Hà Nồi” Tạp chí KH-PT,tập 11, số 4, trang 482-491 8) Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 9) Nguyễn Quốc Bình (1994), Tạp chí Sinh học, 16(4), 143-145 10) Nguyễn Thanh Huệ, Trịnh Minh Khang, Nguyễn Tấn Hoàng Sơn, Nguyễn Thị Bích Thuyền (2012), “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu gừng (Zingiber officinale Rosc) tinh dầu tiêu (Piper nigrum L)”, Tạp chí Khoa học, 21a, trang 139-143 11) NgơXnBình, Bùi Bảo Hồn, NguyễnThịThHà (2003),Giáotrìnhcơng nghệsinhhọc, Nxb Nơngnghiệp, Hà Nội 12) Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục B Tiếng Anh 13)Murashige, T., and F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473–479 14)Tyagi, R K., A Yusuf, P Dua, and A Agrawal (2004) In vitro plant regeneration and genotype conservation of eight wild species of Curcuma Biol Plant 48: 129–132 15)Yusuf, N A., M M Suffian Annuar, and N., Khalid (2011) Rapid micropropagation of Boesenbergia rotunda (L.) Mansf Kulturpfl (a valuable medicinal plant) from shoot bud explants Afr J Biotechnol 10(7): 1194–1199 38 16)Mohanty, P., S Behera, S S Swain, D P Barik, and S K Naik (2013) Micropropagation of Hedychium coronarium J Koenig through rhizome bud Physiol Mol Biol Plants 19(4): 605-610 17)Shirin, F., S Kumar, and Y Mishra (2000) In vitro plantlet production system for Kaempferia galanga, a rare indian medicinal herb Plant Cell Tiss Organ Cult 63: 193–197 18)Chirangini P., S K Sinha, and G J Sharma (2005) In vitro propagation and microrhizome induction in Kaempferia galanga L and K rotunda L Indian J Biotechnol 4: 404–408 19)Saxena, S (1990) In vitro propagation of the Bamboo (Bambusa tulda Roxb.) through shoot proliferation Plant Cell Rep 9: 431–434 20)Bejoy, M., and M Hariharan (1993) In vitro propagation of Adenanthera pavonina L J Tree Sci 12: 69–72 21)Vincent, K A., K M Mathew, and M Hariharan (1992b) Micropropagation of Kaempferia galanga L.-a medicinal plant Plant Cell Tiss Organ Cult 28: 229–230 22)Jinu, J., and K M Aravinthan (2008) Micropropagation of Alpinia zerumbet Vaigata through in vitro rhizome bud culture Ind J Bot Res 4: 197–200 23)Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S & Kummee, S (2007) Anti - Allergic Activity of Compounds from Keampferia parviflora Journal of Ethnopharmacology 116, 191 - 1993 24)Rujjanawate, C., Kanjanapothi, D., Amornlerdpison, D & Pojanagaroon, S (2005) Anti-gastric ulcer effect of Keampferia parviflora.J Ethnopharmacol 102, 120-122 25)Panthong, A., Tassaneeyakul, W., Kanjanapothi, D., Tantiwachwuttikul, P., & Reutrakul, V (1989) Anti-inflammatory activity of 5,7-dimethoxyflavone Planta Med 55, 133-136 26)Yenjai, C., Prasanphen, K., Daodee, S., Wongpanich, V., & Kittakoop, P (2004) Bioactive flavonoids from Keampferia parviflora Fitoterapia 75(1), 89-92 27)Trisomboon, H (2009) Keampferia parviflora: A Thai Herbal Plant, Nerther Promote Reproductive Function Nor Increase Lobido via Male Hormone Thai Journal of Physiological Sciences 21,83-86 28)Iwana P.P (2014), Acclimatization of Kaempferia parvifloraWall Ex Baker on Several Growing Medium Compositions and Various Paclobutrazol Concentrations Institut Pertanian Bogor, 2014, 33pp 29)Catherine D.L., Thohirah L.A., Johnson S., NurAshikin P.A and Maheran A.A (2014), Morphological Description for Kunyit Hitam (Kaempferia parviflora) and Breaking Bud Dormancy with BAP and Ethephon Treatments Trans Malaysian Soc Plant Physiol., 2014, 22, pp 139-142 39 30)Muaz A.K., S W Ardie, D N Khumaida (2014), Pematahan Dormansi Rimpang Kaempferia parviflora Wall ex Baker Bul Agrohorti, 2014, 2(1), pp.104114 31)Jeff S.K., M Sarmiento, M.P Paz, and P.C Branch (2005), Effect of Light Intensity, Photoperiod and Plant Growth Retardants on Production of Zingiberacea as Pot Plants Proc VthIS on New Flor Crops, 2005, pp.145-154 32)Khumaida N (2012), Altitude And Shading Conditions Affect Vegetative Growth Of Kaempferia parviflora Bogor Agricultural University, 2012, 61pp 40 PHỤ LỤC Môi trường Table 1: Preparation of modified Murashige AND Skoog’s MS medium Thể tích dung Hàm lượng Dung dịch lít hóa chất TT Hóa chất dịch me môi trường môi trường (g/l) (ml) (mg/ l) NH4NO3 82,5 1.650,0 I 20 KNO3 95 1.900,0 MgSO4 7H2O 37,0 370,0 MgSO4 4H2O 2,23 22,3 II 10 ZnSO4 7H2O 1,058 10,6 CuSO4 5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44,0 440,0 III KI 0,083 10 0,83 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 17,0 KH2PO4 170,0 0,62 IV H3BO3 10 6,2 0,025 Na2MoO4.2H2O 0,25 V Vitamin FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl 2,784 3,724 mg/100ml 100 100 100 100 10 0,5 2,0 0,1 0,5 27,85 37,25 0,5 2,0 0,1 0,5 100,0 30.000,0 8.000,0 Inositol Sucrose Agar PH 5,8 Table 2: Preparation of modified Gamborg’s B5 medium (E-24medium ) Thể tích Hàm lượng Dung dịch dung dịch hóa chất TT Hóa chất me lít mơi trường (g/l) mơi trường (mg/ l) (ml) KNO3 250 20 2500,0 (NH4)2SO4 13,4 10 134,0 MgSO4.7H2O 15,0 NaH2PO4.H2O 15 10 150,0 41 10 11 12 13 14 15 MnSO4.H2O H3BO3 ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA CaCl2.2H2O Inositol Vitamins 1,0 0,3 0,2 0,075 0,025 0,0025 0,0025 2,785 3,725 15,0 Nicotinic acid Thiamine HCL Pyridoxine HCL Sucrose Agar PH 10 10 10 10 mg/100ml 100 100 100 10 10,0 3,0 2,0 0,75 0,25 0,025 0,025 27,85 37,25 150,0 160 1,0 10,0 1,0 8000,0 5,6 - 5,8 Table 3: Môi trường WPM - Woody Plant Medium Nồng độ Muối khoáng Muối khoáng (mg/l) Nồng độ (mg/l) NH4NO3 400 H3BO3 6,2 Ca(NO3)2.4H2O 556 ZnSO4.7H2O 8,6 CaCl2.2H2O 96 MgSO4.7H2O 370 CuSO4.5H2O 0,25 K2SO4 990 FeSO4.7H2O 27,8 KH2PO4 170 MgSO4.4H2O 22,3 Na2MoO4.2H2O 0,25 Na2EDTA.2 H2O 37,2 Các chất hữu Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCL 0,5 Thiamine HCL 1,0 Glycine 2,0 Agar 6,0 Sucrose 20 pH 5,6 - 5,8 42 PHỤ LỤC Kết xử lý số liệu Bảng 4.4 Ảnh hưởng số môi trường đến khả tái sinh chồi Ngải đen BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE NGAI 24/ 4/13 15: :PAGE anh huong cua moi truong MS, B5, WPM den kha nang tai sinh choi Ngai den VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================= CT$ 1172.79 586.395 19.01 0.003 * RESIDUAL 185.037 30.8395 * TOTAL (CORRECTED) 1357.83 169.728 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NGAI 24/ 4/13 15: :PAGE anh huong cua moi truong MS, B5, WPM den kha nang tai sinh choi Ngai den MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TLTS 77.7767 66.6700 3 50.0000 SE(N= 3) 3.20622 5%LSD 6DF 11.0908 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NGAI 24/ 4/13 15: :PAGE anh huong cua moi truong MS, B5, WPM den kha nang tai sinh choi Ngai den F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 43 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | TLTS 64.816 13.028 5.5533 8.6 0.0030 Bảng 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA đến hệ số nhân nhanh chồi Ngải den BALANCED ANOVA FOR VARIATE HS FILE BBBBBBA 24/ 4/13 21:16 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Ngai den VARIATE V003 HS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================= CT$ 4.84267 1.21067 82.54 0.000 * RESIDUAL 10 146668 146668E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 4.98933 356381 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BBBBBBA 24/ 4/13 21:16 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Ngai den MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS HS 2.23333 2.50000 3 2.73333 3.83333 3.23333 SE(N= 3) 0.699208E-01 5%LSD 10DF 0.220323 44 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BBBBBBA 24/ 4/13 21:16 :PAGE Anh huong cua nong BA den he so nhan nhanh choi Ngai den F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HS 15 2.9067 0.59698 0.12111 4.2 0.0000 Bảng 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Kinetin BA đến hệ số nhân nhanh chồi Ngải đen BALANCED ANOVA FOR VARIATE HS FILE BOOK5 24/ 4/13 21:21 :PAGE Anh huong cua nong BA va Kinetin den kha nang nhan nhanh choi cua Ngai den VARIATE V003 HS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================= CT$ 982667 245667 6.70 0.007 * RESIDUAL 10 366667 366667E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 1.34933 963810E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK5 24/ 4/13 21:21 :PAGE Anh huong cua nong BA va Kinetin den kha nang nhan nhanh choi cua Ngai den MEANS FOR EFFECT CT$ 45 CT$ NOS HS 3.86667 4.16667 3 4.60000 4.36667 4.03333 SE(N= 3) 0.110554 5%LSD 10DF 0.348360 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK5 24/ 4/13 21:21 :PAGE Anh huong cua nong BA va Kinetin den kha nang nhan nhanh choi cua Ngai den F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | HS 15 4.2067 0.31045 0.19149 4.6 0.0071 Bảng 4.7: Kết ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Ngải đen BALANCED ANOVA FOR VARIATE SR FILE RA RE 22/ 5/** 16:20 PAGE anh huong cua NAA den kha nang re Ngai den VARIATE V003 SR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================= ==================== CT$ 5.51600 1.37900 413.70 0.000 * RESIDUAL 10 333334E-01 333334E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.54933 396381 46 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RA RE 22/ 5/** 16:20 PAGE anh huong cua NAA den kha nang re Ngai den MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS SR 1.83333 2.83333 3.26667 3.63333 3.06667 SE(N= 3) 0.333334E-01 5%LSD 10DF 0.105035 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RA RE 22/ 5/** 16:20 PAGE anh huong cua NAA den kha nang re Ngai den F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | SR 15 2.9267 0.62959 0.57735E-01 2.0 0.0000 47 ... ngải đen chưa trồng với quy mô lớn chưa có nhiều nghiên cứu nhân giống Một số cơng trình nghiên cứu canh tác Ngải đen, Iwana (2014), nghiên cứu nhân giống Kaempferia parviflora trồng số thành phần... nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitro Ngải đen 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Ngải đen, nâng cao hiệu trình nhân giống, tạo nguồn giống. .. liệu nhân giống bệnh trồng bảo quản điều kiện cách ly theo hệ thống nhà lưới cấp 18 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu Cây Ngải đen giống trồng Viện Nghiên cứu