Nghiên cứu nhân giống cây oải hương lá xẻ (lavandula dentata l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy canh

Cây Lavandula có nguồn gốc từ sự nhân giống in vitro đã cho thấy năng suất cao và chất lượng tinh dầu tốt, được coi như là một giải pháp tuyệt vời để vượt qua các vấn đề như sự thoái hó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY

OẢI HƯƠNG LÁ XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

VÀ VI THỦY CANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI- 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY

OẢI HƯƠNG LÁ XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến

TS La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,

đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành luận văn này, nhân đây tôi cũng xin chânthành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành luận văn

Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độ chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để luận văn của tôi có thể hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2018

Học viên NGUYỄN THỊ THÚY MAI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống

cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

và vi thủy canh” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS La Việt Hồng

hướng dẫn Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và chưa

được công bố

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2018

Học viên

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

IAA: Indol-3-axit axetic

IBA: Indol butyric acid

MS: Murashige và Skoog

NAA: Napthlacetic acid

Nxb, NXB: Nhà xuất bản

TDZ: Thidiazuron

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Oải hương lá xẻ 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây Oải hương lá xẻ 5

1.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải hương lá xẻ 6

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây Oải hương lá xẻ 6

1.2 Giới thiệu phương pháp nhân giống cây Oải hương in vitro 8

1.2.1 Nhân giống cây Oải hương từ mô phân sinh 9

1.2.2 Nhân giống cây Oải hương thông qua sự phát sinh cơ quan 12

1.3 Phương pháp vi thủy canh 14

1.3.1 Sơ lược về phương pháp vi thủy canh 14

1.3.2 Ưu điểm của phương pháp vi thủy canh 15

1.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hương lá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hương lá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu cây Oải hương lá xẻ ở Việt Nam 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Thời gian và điạ điểm nghiên cứu 20

2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 20

2.3.1 Thiết bị 20

2.3.2 Dụng cụ 20

2.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.5 Điều kiện nuôi cấy 21

2.6 Phương pháp nghiên cứu 21

2.6.1 Bố trí thí nghiệm 21

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu in vitro 27

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro 29

3.3 Ra rễ in vitro tạo cây hoàn chỉnh 31

3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 34

3.5 Thiết kế, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn luyện cây Oải hương lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 36

3.5.1 Thiết kế hệ thống vi thủy canh, xác định thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi thủy canh và môi trường 36

3.5.2 Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và dung dịch dinh dưỡng đến tỷ lệ ra rễ và sự sinh trưởng của chồi cây Oải hương 39

3.5.3 Chuyển và huấn luyện cây Oải hương từ hệ thống vi thủy canh thích nghi với điều kiện tự nhiên 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 42 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

và tạo cây Oải hương hoàn chỉnh 24 Bảng 2.4: Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây Oải hương 25

Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân cây Oải

hương lá xẻ 27 Bảng 3.2: Kết quả ảnh hưởng của BAP và KIN đến quá trình nhân nhanh

chồi cây Oải hương in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 29

Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IAA đến khả năng

ra rễ của chồi 32

Bảng 3.4: Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên 35

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi

thủy canh và môi trường đến tỷ lệ sống (%) của chồi cây Oải hương 38 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và

dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chồi cây Oải hương 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentate L.) 5

Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic) 15

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 21

Hình 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân 28

Hình 3.2: Chồi cây hoa Oải hương 31

Hình 3.3: Rễ cây Oải hương lá xẻ in vitro 34

Hình 3.4: Rèn luyện cây Oải hương lá xẻ in vitro 36

Hình 3.5: Thiết kế hệ thống vi thủy canh đơn giản để huấn luyện cây Oải hương lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 37

Hình 3.6: Sơ đồ quy trình nhân giống cây hoa Oải hương lá xẻ Lavandula dentata L bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy canh 41

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây hoa Oải hương lá xẻ hay còn gọi là Oải hương Pháp có tên khoa

học là Lavandula dentata L là một loài thực vật có hoa thuộc họ Hoa môi

(Lamiaceae), có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, các hòn đảo Đại Tây Dương

và bán đảo Ả-rập Đây là loài cây bụi thường niên, hoa thường có màu tím đặc trưng và mùi thơm nồng, thích nghi với những nơi có khí hậu ôn đới khô và lạnh

Lavandula là cây hương liệu có giá trị thương mại quan trọng và

thường được trồng bằng hạt hay giâm cành bằng thân cây Tuy nhiên, các phương pháp này thường tốn nhiều thời gian mà hiệu suất không cao và tổng hợp các chất thứ cấp thấp, chưa kể đến các biến dị về kiểu gen và kiểu

hình Cây Lavandula có nguồn gốc từ sự nhân giống in vitro đã cho thấy

năng suất cao và chất lượng tinh dầu tốt, được coi như là một giải pháp tuyệt vời để vượt qua các vấn đề như sự thoái hóa giống đã được quan sát thấy ở các giống Oải hương trồng theo phương pháp truyền thống [17]

Kỹ thuật nuôi cấy mô (hay còn gọi là vi nhân giống, nhân giống in

vitro) đã được nghiên cứu và thương mại hóa trên nhiều đối tượng cây trồng

khác nhau, kỹ thuật này có ưu điểm có thể nhân nhanh với số lượng lớn trong thời gian ngắn, giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ [6] Phươngpháp nhân giống này đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng và cho chất chuyển hoá có giá trị trong suốt cả năm mà không hạn chế theo mùa [62] Tuy nhiên, nuôi cấy mô theo phương pháp truyền thống còn sử dụng quy trình phức tạp và kéo dài Việc nuôi cấy trong các điều kiện vô trùng có ảnh hưởnglớn đến sự tăng trưởng và phát triển của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm(quá trình thuần hóa) Những hạn chế kể trên làm cho sản phẩm nuôi cấy mô

có giá thành tương đối cao [67]

Hệ thống vi thủy canh là sự kết hợp giữa thủy canh và vi nhân giống,

có nhiều ưu điểm vượt trội và là một kỹ thuật mới trong nuôi cấy mô Các bước nuôi cấy phức tạp được rút ngắn; do đó, công lao động và thời gianđược giảm bớt; các bước nuôi cấy ban đầu, nhân nhanh, tạo chồi, ra rễ đượcthực hiện một cách liên tục Trong đó, bước ra rễ và thuần dưỡng có thể kếthợp thành một bước

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu

nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật

nuôi cấy mô và vi thủy canh.”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây Oải hương lá xẻ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, nhằm góp phần đáp ứng cây cây giống phục vụ nhu cầu cho con người

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro từ đốt thân

- Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi Oải hương in vitro

- Nghiên cứu tạo cây Oải hương in vitro hoàn chỉnh

- Nghiên cứu rèn luyện cây Oải hương in vitro thích nghi với điều kiện

tự nhiên

- Nghiên cứu cải tiến, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn luyện

cây Oải hương in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

Đề tài góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu nhân giống in

vitro và vi thủy canh trên đối tượng cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.)

5.2.Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở cho nhân giống cây Oải hương lá xẻ bằng

kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, cung cấp cây giống sạch bệnh số lượng lớn

Tên khoa học: Lavandula dentata L

Tên Việt Nam: Cây Oải hương lá xẻ

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Oải hương lá xẻ hay còn gọi là Oải hương Pháp có tên khoa học

là Lavandula dentata L có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, các hòn đảo Đại

Tây Dương và bán đảo Ả-rập… [53] Chi Oải hương có khoảng 39 loài, nhiều giống lai và gần 400 giống cây trồng đã có đăng ký [58]

Lavandula là một chi nhỏ thuộc các loài cây nửa bụi hoặc cây bụi

thuộc họ Bạc hà (Lamiacae) [5] Thời kỳ ra hoa thường từ tháng 6 đến tháng

8 [52] Rất nhiều trong số đó có chất thơm và dược tính được sử dụng rộng rãi để chiết xuất tinh dầu Nhu cầu tinh dầu hoa Oải hương ngày càng nhiều, tinh dầu hoa Oải hương được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, hương liệu, dược liệu, gia vị cho món ăn, ngoài ra còn có tác dụng trong trang trí [53]

Tên khoa học chi Lavendula (Lavandula) bắt nguồn từ tiếng Latinh

―Lavare‖, chúng phân bố chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, bán đảo Ả Rập, quần đảo Canary, Maderia, Bắc phi, Tây Nam Á và Ấn Độ Ở Việt Nam,

có khoảng 4 loài và một số giống lai được trồng chủ yếu ở Đà Lạt- nơi có

khí hậu mát mẻ và một số ít ở Hà Nội, vì chúng là loài hoa ưa lạnh và khô, không chịu được độ ẩm cao, nắng nóng [3]

Cây Oải hương có hai loại: Lá lớn và lá nhỏ Oải hương lá nhỏ tuy lớn

chậm hơn nhưng được yêu thích bởi hoa thơm và hoa đẹp hơn Lavandula

dentata L thuộc loại lá nhỏ

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây Oải hương lá xẻ

Hình 1.1: Cây hoa Oải hương lá xẻ (Lavandula dentate L.) [66]

Thân: Cây Oải hương lá xẻ có thân nhỏ, cao từ 0,2 - 1m, cây phân

thành nhiều nhánh và mọc thành bụi Toàn thân có lớp lông mỏng phủ

ngoài

Lá: Cây có nhiều lá, lá nhỏ, hẹp, hình dải có mép hơi gập xuống,

không có cuống, màu xanh thẫm, mọc đối xứng Bề mặt lá cũng có lông.Đặc biệt, cây có mép lá xẻ nên được gọi là cây Oải hương lá xẻ

Rễ: Rễ cây dạng chùm, ưa sống ở những nơi hơi kiềm, đất tơi xốp,

thoát nước tốt

Hoa: Hoa mọc thành chùm ở đỉnh, đối xứng hai bên, lưỡng tính, mẫu 5,

đài và tràng hợp thành ống có hai môi rõ Hoa Oải hương có màu tím hoa cà,ống hoa được sắp xếp liên tục vòng quanh cuống hoa Cuống hoa dài, màu

xám, có góc cạnh Thời kì ra hoa của cây là vào khoảng tháng 6 đến tháng 8

[63]

1.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải hương lá xẻ

Những yếu tố như khí hậu, nguồn nước…cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần và tính chất của tinh dầu [8]

- Đất: phù hợp với đất cát hơi có tính kiềm hoặc trung tính, khả năngthoát nước tốt

- Nước: hoa Oải hương không thích rễ thường xuyên giữ nước Tướinước vào buổi sáng để tránh ánh nắng mặt trời, tránh làm gẫy dập lá dễ gây

hư hỏng, sinh sản của sâu hại và dịch bệnh

- Ánh sáng: là cây ưa sáng nên cần rất nhiều ánh sáng mặt trời và môi

trường độ ẩm thích hợp Nên có ít nhất 50 ánh sáng của mặt trời che khuấttrong mùa hè, tăng cường thông gió để giảm nhiệt độ môi trường xungquanh

- Nhiệt độ: nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất 15-25°C và từ 5-300C có thểphát triển [65]

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây Oải hương lá xẻ

Hoa Oải hương được sử dụng rộng rãi để trang trí và tạo mật cho ong bướm đến hút và cũng có thể trồng tái tạo cho các khu rừng bị cháy do hỏa hoạn [53]

Trong y học cổ truyền, lá và hoa tươi của cây Oải hương được sửdụng để làm giảm đau đầu và đau khớp, dùng lá và hoa để xông cho người

bị cảm lạnh [7]

Tuy nhiên, giá trị kinh tế của Lavandula spp chủ yếu liên quan đến

các đặc tính của các loại tinh dầu thường được sử dụng trong ngành thẩm

mỹ và trị liệu Tinh dầu Oải hương được sử dụng rộng rãi trong sản xuất xà phòng, nước hoa, phụ gia thực phẩm và các sản phẩm khác, như các chất làm dễ chịu hay là tác nhân kháng khuẩn [10]

Bằng chứng cho việc sử dụng Lavandula spp trị liệu có thể được bắt

nguồn từ những người La Mã cổ đại và người Hy Lạp [60]

Tinh dầu Oải hương được sinh ra từ tuyến lông trên bề mặt của lá và

có thành phần chính là các nhóm hidrocacbon không no, có khoảng từ 50 đến 60 trong số đó đã được xác [13] Linalool và linalool acetate là các nhóm hidrocacbon không no phong phú nhất trong các giống hoa Oải hương[34] Thành phần của tinh dầu được xác định chủ yếu bởi kiểu gen, mặc dù điều kiện môi trường và nuôi cấy cũng có thể gây ảnh hưởng lớn Trong cây thành phần tinh dầu cũng có sự sai khác giữa các mô khác nhau [45]

Thành phần hoá học của các loại tinh dầu trong lá của cây Oải hương

lá xẻ có chứa tám hợp chất Các thành phần hoá học chính trong tinh dầu thu

từ cây Oải hương lá xẻ được xác định là α-terpinolen (51,13%) và camphor

(13,43%) có khả năng chống lại ấu trùng của Culiseta longiareolata Macquart và Culex pipiens L., mở ra tiềm năng của sản phẩm tự nhiên này

có thể thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp để kiểm soát muỗi [21] Ngoài ra, tinh dầu từ Oải hương cũng gây độc với một số loại côn trùng, từ đó gợi ý chúng có giá trị trong ngành công nghiệp hoá chất dùng trong nông nghiệp [29]

Gần đây, các đặc tính dược liệu của tinh dầu hoa Oải hương đã được nghiên cứu bởi Woronuk [60] Những loại dầu này có thể được cơ thể người hấp thụ qua ba đường: hệ hô hấp, tiếp xúc trực tiếp qua da và đường tiêu hóa

[49] Tinh dầu được sử dụng rộng rãi trong hương liệu và xoa bóp, có nhiều lợi ích đã được công bố [10] Dầu hoa Oải hương được cho là có thể kích thích giấc ngủ và được sử dụng rộng rãi để giảm bớt âu lo [30], [33] Tinh dầu của cây Oải hương đã được đánh giá để điều trị chứng mất trí [54] Chất chiết xuất từ hoa Oải hương cũng đã được báo cáo với các đặc tính thích hợp cho việc quản lý các rối loạn hệ thần kinh trung ương (Alnamer R A K., 2012) [8], [11].

Tinh dầu được chiết suất từ cây Oải hương cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm do có tác dụng tăng cường sức khỏe và dinh dưỡng Kovatcheva-Apostolova và cộng sự (2008) còn nhận thấy rằng việc

bổ sung chiết suất Lavandula vera vào gà băm nhỏ giảm quá trình oxy hóa

lipid và sự phá hủy α-tocopherol trong thịt nấu chín, chứng minh tác dụng chống sự oxy hóa thực phẩm [32]

1.2 Giới thiệu phương pháp nhân giống cây Oải hương in vitro

Theo tác giả George (2008), có 2 phương pháp chính trong nhân

giống in vitro: nhân giống từ nách hoặc chồi đỉnh và nhân giống thông qua

sự hình thành các chồi non hoặc phôi soma Phương pháp đầu tiên yêu cầu các mô phân sinh tồn tại từ trước trong các mẫu cấy Trong khi phương phápthứ 2 liên quan đến việc xảy ra ngẫu nhiên và tạo phôi trực tiếp từ mô cấy

mà không có mô sẹo hình thành trước (phát sinh cơ quan trực tiếp hoặc phôi trực tiếp) hoặc gián tiếp khi chồi hoặc phôi tái sinh trên mô sẹo được hình thành trước đó hoặc trong nuôi cấy tế bào (phát sinh cơ quan hoặc phôi gián tiếp) Trong hầu hết các loài (bao gồm cả hoa Oải hương) cây trồng vi nhân giống thường được sản xuất bằng phương pháp đầu tiên, vì sự ổn định di

truyền trong quá trình nhân giống in vitro được bảo đảm bằng cách tái sinh

từ các mô phân sinh có sẵn và sự hình thành chồi mới mà không xảy ra giai đoạn tạo mô sẹo [24]

1.2.1 Nhân giống cây Oải hương từ mô phân sinh

Sự thành công của nhân giống in vitro phụ thuộc vào thành phần của

môi trường dinh dưỡng, nồng độ và sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, môi trường nuôi cấy, kiểu gen và tình trạng sinh lý của cây giống,

và đặc biệt là mẫu cấy Trong quá trình phát triển mô phân sinh, chồi đỉnh hoặc các đoạn chứa chồi nách được nuôi cấy tạo nhiều chồi mới mà không xảy ra giai đoạn tạo mô sẹo [48] Nói chung nhân giống thông qua phát triển

mô phân sinh thường được chia làm 4 giai đoạn [24]: tạo vật liệu khởi đầu

in vitro (giai đoạn 1); nhân nhanh chồi (giai đoạn 2); ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh (giai đoạn 3) và cây thích nghi với điều kiện tự nhiên (giai đoạn 4)

a Tạo vật liệu khởi đầu in vitro

Việc lựa chọn các mẫu để bắt đầu nuôi cấy phụ thuộc vào loại/ kiểu nuôi cấy, mục đích của việc nuôi cấy và phụ thuộc vào loài được nghiên cứu Nhân giống thông qua sự phát triển của mô phân sinh thường gặp phát triển mô phân sinh đỉnh (meristem), chồi đỉnh (shoot tip) hoặc đốt thân (stem segments) Nuôi cấy từ đốt thân là rất phổ biến trong nhân giống

Lavandula spp bằng cấy mô

Việc nuôi cấy cây Oải hương in vitro liên quan đến việc khử trùng bề

mặt của mẫu cấy ban đầu Về cơ bản, khử trùng bề mặt bằng Etanol sau đó

là dung dịch Natri hypochlorite thường có hiệu quả khử trùng cao đối với hầu hết các loài thuộc chi Lavandula

Môi trường nuôi cấy bổ sung BAP hoặc BAP bổ sung auxin (IAA,

IBA, NAA) đã được sử dụng để tạo mẫu in vitro ở một số loài (L stoechas,

Lavandula viridis and L vera) [15], [31] Màu nâu của môi trường đôi khi

được quan sát, theo báo cáo của Nobre (1996) cho môi trường nuôi cấy in

vitro L stoechasand, Zuzarte và cộng sự (2010) cho môi trường nuôi cấy

của Lavandula pedunculata, nhưng điều này có thể được ngăn chặn bằng

axit ascorbic trong môi trường và thường xảy ra trao đổi [62]

b Nhân nhanh chồi

Hiệu quả nhân nhanh chồi được xác định chủ yếu bởi kiểu gen, các

yếu tố môi trường in vitro và thành phần môi trường Ngoài ra, nó còn phụ

thuộc vào các yếu tố vật lý, hóa học khác như độ ẩm tương đối, nồng độ Ethylen, độ thoáng khí của bình nuôi cấy [16]

Môi trường MS cơ bản được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu liên

quan đến Lavandula spp hoặc môi trường ½ MS [15], [41] Cytokinin là

chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết và gần như bắt buộc cho quá trình nhân nhanh chồi, đôi khi có thể kết hợp Cytokinin với nồng độ thấp

của Auxin Theo Zuzarte (2010), nhân nhanh chồi Lavandula spp được thực

hiện bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy BAP [62] Ngược lại, việc

bổ sung NAA kết hợp BAP làm giảm đáng kể số lượng chồi trong nuôi cấy

L vera và Lavandula dentata [21], [9] Việc sử dụng nước dừa mà trong đó

có chứa vitamin, axit amin và chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên thúc đẩy sự

nhân chồi ở loài L latifolia và L dentata [31]

Ở loài L latifolia và L dentata sự phát triển chồi bị ảnh hưởng bởi

loại và nồng độ Cytokinin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy [31]

Trong nuôi cấy in vitro cây Oải hương thường dẫn đến tình trạng thừa

nước (hay còn gọi là hiện tượng thủy tinh hóa, thủy tinh thể) [62] Bệnh sinh

lý này thường do các điều kiện in vitro nhân tạo, đặc biệt là độ ẩm, với sự có mặt của Cytokinin dư thừa như BAP [51] Ở loài L stoechas, việc thừa

nước có quan hệ với nồng độ BAP trong môi trường nuôi cấy và bị ức chế

khi có sự hiện diện của Ads [45] Thừa nước cũng quan sát thấy ở loài L

vera, L dentata và L pedunculata với BAP nồng độ cao [9], [21], [62]

c Ra rễ

Chồi hoa Oải hương nói chung có thể ra rễ ngay cả khi môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật – thuộc nhóm Auxin [62] Tuy nhiên, việc bổ sung NAA là cần thiết để đạt được hiệu quả cao trong cảm

ứng chồi ra rễ L stoechas, L vera, L viridis và L dentata [9], [21], [45] Ở nhiều loài Oải hương , để chồi cây tạo rễ in vitro, chồi phổ biến được nuôi

cấy thử trong môi trường ½ hoặc ¼ MS, Jordan và cộng sự (1998) sử dụng môi trường không chứa Auxin trong khi Echeverrigaray và cộng sự (2005)

sử dụng môi trường bổ sung NAA cho số rễ tăng đáng kể [9]

Theo tác giả Dias và cộng sự (2002) việc tăng nồng độ đường từ 58,4

lên 87,6 mM tăng tỷ lệ chồi tạo rễ in vitro ở loài L viridisshoots [15]

Mensuali-Sodi và cộng sự (1995) chỉ ra rằng cảm ứng ra rễ cho chồi ở loài

(Lavandula×intermedia Emeric ex Loiseleur) bị ức chế bởi tiền chất Ethylennội sinh 1-aminocyclopropane và bởi các chất ức chế tổng hợp Ethylen, từ nghiên cứu này đã dẫn đến giả thuyết là Ethylen nội sinh đóng vai trò cảm

ứng sự ra rễ in vitro [39]

d Rèn luyện

Giai đoạn cuối cùng của việc nhân giống in vitro đòi hỏi phải rèn

luyện/ huấn luyện hiệu quả từ môi trường nuôi cấy ra đất, thích nghi với

điều kiện sống tự nhiên [42] Cây in vitro sống trong điều kiện sống nhân

tạo có nồng độ cao các chất dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn cacbon xác định, độ ẩm cao, ánh sáng yếu và trao đổi khí sẽ gây ra những thay đổi về cấu trúc và sinh lý khiến cho thực vật không thể thích nghi ngay khi đưa ra môi trường tự nhiên Chúng cần được thích nghi với môi trường hoặc điều kiện nhà kính dần dần

Sự thích nghi của cây Oải hương in vitro nói chung cần đơn giản, với

sự ít thay đổi hình thái và quan trọng nữa là phải có tỷ lệ sống cao (70% ở L

latifolia, 85-90% ở loài L stoechas, 94% ở loài L veraand và 80% ở loài L viridis) Tuy nhiên, tỷ lệ sống cũng ngày được cải thiện ví dụ như ở loài hoa

Oải hương lá xẻ (L dentata), Echeverrigaray và cộng sự (2005) cho rằng tỷ

lệ sống đạt 87 trong khi trước đó theo Jordan và cộng sự (1998) thì tỷ lệ sống chỉ 50-55% bởi Jordan và cộng sự (1998) Chất lượng của hệ thống rễ

là rất quan trọng cho sự thích nghi với môi trường [21], [31]

1.2.2 Nhân giống cây Oải hương thông qua sự phát sinh cơ quan

Sự phát sinh cơ quan là con đường tái sinh phổ biến nhất trong nhân

giống in vitro

Tsuro và cộng sự (1999) đã quan sát ở loài L vera và thấy rằng

Cytokinin loại ure N-(chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea (CPPU) có thể tạo ra nhiều chồi, trong khi đó Cytokinin và BAP tạo ra chồi bình thường Môi trường hiệu quả nhất cho sự hình thành chồi là 0,4μM CPPU nhưng kết quả không hình thành rễ Việc này sau đó được khắc phục bằng cách sử dụng hệ thống nuôi cấy mở và một quy trình tái sinh cây hiệu quả cho hệ số nhân chồi gấp 7 lần bình thường [56] Sau đó cùng một nhóm nghiên cứu về hình

thái và giải phẫu tinh dầu của loài L veraphenotypic biến thể thu được khi

có BAP, cho rằng không có cây con tái sinh nào sản sinh ra nhiều tinh dầu như giống gốc [55]

để tạo ra các giống mới và một trong những cây tái sinh tạo ra tinh dầu nhiều hơn so với cây bố mẹ, cho thấy rằng cây Oải hương đột biến có thể có

ích cho việc tổng hợp monoterpene và sesquiterpene trong thực vật [22]

Ghiorghiţă và cộng sự (2009) nghiên cứu hình thái của L angustifolia

mô cấy (chồi đỉnh, lóng và lá) và quan sát thấy rằng các đốt thân cấy trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, trên môi trường

MS cơ bản có bổ sung NAA và trên môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác hình thành cây con mới [25] Dronne và cộng sự (1999a)

mô tả sự tái sinh chồi trong lavandin với kết quả tốt nhất đạt được ở 4 môi trường khác nhau Mô sẹo được hình thành trong môi trường MS có bổ sung 9μM BAP và 4,5μM NAA Sau 2 tuần nuôi cấy mô sẹo được chuyển vào môi trường MS bổ sung 18μM BAP để tái sinh chồi, sau đó, để kéo dài chồi cấy vào môi trường MS có bổ sung 1μM gibberellic acid (GA) và rễ được tạo ra với môi trường MS bổ sung 1μM IBA [19] Dronne và cộng sự (1999b) so sánh giống Lavandin về khả năng tái tạo trong ống nghiệm và chuyển gen thấy rằng cả hai quá trình đều phụ thuộc mạnh vào cây trồng Hiệu quả của việc hình thành chồi từ mô sẹo là 67% - 99% phụ thuộc vào cây trồng và biểu hiện thoáng qua của E Coli gen gusA (mã hóa enzyme β-glucuronidas) đã đạt được trong tất cả 5 giống, hiệu quả của vi khuẩn Agrobacterium trung gian ổn định, thể hiện qua việc sản xuất mô sẹo kanamycinresistant dao dộng từ 3- 89% [17]

Nebauer và cộng sự (2000) cho rằng chuyển gen dựa vào vi khuẩn

Agrobacterium cho hoa Oải hương tạo đột biến (L latifolia) bao gồm bước

tiền nuôi cấy trong 1 ngày cho các lá ( trên môi trường tái sinh ) và thời gian cấy ghép là 24 giờ, sau đó tái sinh bằng kanamycin [43] Cách này đã đạt được hiệu quả 6 cũng như biểu hiện gen chuyển trong tái sinh thực vật, mặc dù Mishiba và cộng sự (2000) đã mô tả hình thức chuyển đổi khác sử dụng mô sẹo thay vì cấy lá hiệu quả hơn [40] Gần đây, Tsuro and Ikedo(2011) đã mô tả tác dụng của Agrobacterium rhizogenesstrains tự nhiên trên

rễ lông lavandin hình thành, tái sinh cây trồng và nghiên cứu hình thái và cấu tạo dầu thiết yếu của cây tái sinh [55]

Sự tái sinh cây Oải hương nhờ sinh vật có thể sử dụng trong công nghệ sinh học để cải thiện cây trồng Biến đổi sinh dưỡng và biến đổi gen là

kĩ thuật chính trong chi này, đặc biệt là để tạo ra những thay đổi cần thiết của tinh dầu Trong tương lai phương pháp này có thể sử dụng trong phạm

vi rộng hơn các đặc tính cho nông học (ví dụ như trao đổi sâu bệnh và khả năng kháng bệnh) cũng như các mục đích y học

1.3 Phương pháp vi thủy canh

1.3.1 Sơ lược về phương pháp vi thủy canh

Vi thủy canh (microponic) là một phương pháp sản xuất cây giốngkết hợp vi nhân giống (micropropagation) và thủy canh (hydroponic).Trong đó, mô thực vật được cung cấp chất dinh dưỡng ở quy mô nhỏ.Phương pháp này bước đầu đã thể hiện những đặc tính ưu việt và có thể

khắc phục nhiều nhược điểm của các hệ thống vi nhân giống in vitro truyền

thống [27]

Thủy canh thường được định nghĩa như là ―trồng cây trong nước‖.Tuy nhiên, thật ra việc cung cấp nước và dung dịch dinh dưỡng cho cây cóthể trực tiếp qua tiếp xúc giữa rễ và dung dịch như định nghĩa ở trên nhưngcũng có thể gián tiếp qua các giá thể trơ nên chúng ta có thể mở rộng địnhnghĩa thuỷ canh là ―trồng cây không sử dụng đất‖ [36]

Thuật ngữ vi thủy canh (microponic) lần đầu tiên được mô tả bởiHahn và cs (1996) trên đối tượng cây hoa cúc để xem liệu nó có thể đơngiản hóa các giai đoạn tăng trưởng thực vật, ra rễ, thích nghi với môi trường

và nhân giống với kết quả tốt hơn so với hệ thống in vitro thông thường.

Kết quả cho thấy rằng, sự tăng trưởng của cây hoa cúc trong hệ thống vi

thủy canh cao hơn nhiều so với cây cúc trong hệ thống in vitro [28] Trong

hệ thống này, cây có thể tăng trưởng nhanh hơn và khỏe mạnh hơn màkhông có sự thoái hóa, cũng không đòi hỏi phải tiến hành những bước nuôi

cấy phức tạp như trong nuôi cấy in vitro Ngoài ra, nó còn tiết kiệm thời

gian và công lao động, vì các giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, nhân số lượng, rachồi và ra rễ được tiến hành liên tiếp [28]

Hệ thống này cũng được nghiên cứu trên đối tượng là cây hoa cúc

(Chrysanthemum grandiflorum ‗Bongwhang‘) nhằm mục đích làm giảm một số khó khăn trong nuôi cấy in vitro như hiện tượng thủy tinh thể, giúp

đơn giản hóa quá trình nuôi cấy

Trong các nghiên cứu trước đây của Nhut và cộng sự (2005b) hệthống vi thủy canh (Hình 1.2) đã áp dụng thành công trên các đối tượngcúc Trong nghiên cứu này, hệ thống vi thủy canh được thực hiện với giáthể film nylon ống và vật chứa là các hộp nhựa tròn Đại Đồng Tiến Cácchồi cây có thể tiền xử lý với Auxin [44]

Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic)

1.3.2 Ưu điểm của phương pháp vi thủy canh

Vi thủy canh lấy ý tưởng từ phương pháp thủy canh để ứng dụngcho giai đoạn cuối của quá trình nhân giống Đặc điểm của phương phápnày là điều kiện nuôi cấy không cần vô trùng, có thể khắc phục một sốthiệt hại do nhiễm nấm, khuẩn Vì thế, có thể giảm đáng kể chi phí đầu tưvào hộp vô trùng, các cơ sở hạ tầng khác và việc điều khiển môi trường

nuôi cấy cũng đơn giản hơn phương pháp quang tự dưỡng [44]

Do điều kiện môi trường của hệ thống vi thủy canh là gần với điềukiện tự nhiên nên việc rèn luyện cây con ngoài vườn ươm thuận lợi hơn

rất nhiều Trong hệ thống vi thuỷ canh, các chồi cây in vitro được rèn

luyện dần trong điều kiện gần điều kiện tự nhiên, cụ thể là môi trườngkhông vô trùng, độ thoáng khí cao, không có đường giúp cho cây có thể

tự quang hợp để lấy nguồn carbon từ CO2, thay vì từ đường như hệthống vi nhân giống truyền thống Vì vậy, khi đến giai đoạn ra vườnươm, cây hoàn toàn có thể thích ứng kịp thời với môi trường mới

Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp nhân giống in vitro

Nó có thể rút ngắn bớt giai đoạn trong quy trình nhân giống bằng việc kết

hợp giai đoạn ra rễ với giai đoạn thuần dưỡng ex vitro thành giai đoạn ra

rễ in vitro Do đó, sẽ rút ngắn được thời gian nhân giống, tiết kiệm được

chi phí sản xuất cũng như chi phí về điện năng, tiền công nhân viên vàcác chi phí phát sinh khác [27]

Phương pháp vi thủy canh không sử dụng đường, agar đây là mộttrong các nguyên nhân chính làm gia tăng giá thành sản phẩm nênphương pháp này sẽ làm giảm bớt được chi phí sản xuất Mặt khác, dokhông sử dụng đường trong quá trình nuôi cấy nên sẽ không cần vô trùng

và giảm được chi phí cho việc hấp vô trùng môi trường và công lao độngcho việc cấy chuyền, cũng như giảm được tỷ lệ nhiễm

1.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hương lá xẻ Lavandula

dentata L trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hương lá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới

Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất

mạnh mẽ, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang trở thành một công cụ

hiệu quả của công nghệ sinh học [49] Kỹ thuật nuôi cấy in vitro được ứng

dụng rộng rãi trong việc nhân giống vô tính cây trồng, trong cải thiện giống, bảo vệ nguồn gen, thu sinh khối, hoặc chất quý Với những thành công trong nhân giống các cây trồng khác nhau mà những khó khăn trong việc nhân giống các loài Oải hương ngoài tự nhiên cũng đã khắc phục được bằng

phương pháp nhân giống in vitro và được áp dụng từ sớm

Vật liệu nuôi cấy khởi đầu thường được sử dụng là hạt, đỉnh chồi, đoạn thân hay lá Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu đối với

Lavandula nói chung và loài Lavandula dentata nói riêng Ngoài ra còn

nhiều nghiên cứu tập trung đi sâu vào một số lĩnh vực như chọn tạo giống, nhân giống, các biện pháp kỹ thuật và các biện pháp phòng trừ sâu, bệnh hại, chiết suất tinh dầu…

Ngay từ năm 1989, Calvo và Segura đã tiến hành nuôi cấy mô loài L

latifolia trên môi trường MS + BAP 8,9 µM + IAA 0,6 µM Kết quả đã xuất

hiện 15,4 chồi/mẫu có kích thước trung bình lớn hơn 10 mm [11] Không dừng lại ở đó, vẫn là loài này đến năm 1996, Calvo cộng tác với Sánchez-Gras nghiên cứu trên môi trường đó nhưng giảm nồng độ BAP 8,88 µM và

IAA 0,57 µM thì thấy chiều cao chồi tăng lên (16 mm) còn số chồi giảm chỉ

còn 6,2 [52]

Cùng năm 1996, Nober đã công bố kết quả nghiên cứu trên loài L

stoechas với 5-6 chồi/mẫu có kích thước 15-20 mm trong môi trường M +

Ads [45]

Những thành công trước đó đã thôi thúc Jordan và cộng sự (1998) tiến

hành nuôi cấy L dentate bằng mô phân sinh, sử dụng chồi nách và không bổ

sung auxin Ông thấy rằng ở môi trường cơ bản 1/2 MS tỷ lệ chồi sống là 100% [31] Đến năm 2005, Echeverrigaray và cộng sự khi nghiên cứu nuôi

cấy Lavandula dentata L trên các loại môi trường và đã xác định được tỷ lệ

chồi sống đạt 100% ở môi trường MS + NAA 2,5 μM; số chồi trung bình/mẫu và chiều cao chồi (mm) có số lượng tốt nhất là 18,60; 35,3 tại môi trường MS + BAP 2,2 μM + IBA [21]

Năm 1999, Andrade và cộng sự có bước tiến hơn trong nghiên cứu

ảnh hưởng của MS + TDZ (2,25 µM) tới loài L vera Kết quả nhân nhanh

đạt được rất tốt với 10,78 chồi/mẫu, chồi cao 20,7 mm [9]

Tiến hành trên loài khác đến năm 2002, Dias và nhóm nghiên cứu đã

xác định được môi trường tối ưu cho nhân nhanh L viridis là ½ MS + BAP

0,67 µM cho số lượng 11,69 chồi/mẫu và có chiều cao chồi là 44,39 mm [15]

Ngoài ra phải kể đến công trình của Zuzarte và cộng sự năm 2010, nghiên cứu quy trình nhân nhanh của loài L pedunculata đã đi đến kết luận môi

trường MS + BAP 1,11 µM cho chồi tốt nhất là 4,07 chồi/mẫu, có kích thước

5 mm [62]

Machado và cộng sự (2011), trong nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới tái sinh chồi, đã đưa ra kết luận trên môi trường chứa 0,5 μM BAP + 2,5 μM IBA + 0,3 μM GA3 chồi có chiều cao lớn nhất là 2,7 cm Số lượng lá nhiều nhất trên mỗi chồi (± 8) trên môi trường có chứa 1,0 μM BAP + 2,5 μM IBA và tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (90 ) trên môi trường có chứa 10,0 μM BAP + 2,5 μM IBA + 0,3 μM GA3 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thúc đẩy sự phát triển của chồi và GA3 làm cho chồi dài hơn [35]

Từ các kết quả trên cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây Oải hương Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu và sản xuất cây Oải hương nước ta kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm được thời gian và kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và trồng cây Oải hương trong điều kiện Việt Nam

1.4.2 Tình hình nghiên cứu cây Oải hương lá xẻ ở Việt Nam

Cây Oải hương là đối tượng mới của phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta:

Lê Tiến Thành là người đầu tiên ở nước ta bằng việc đưa những chậu cây Oải hương vốn ưa khí hậu vùng ôn đới ra thị trường Tuy nhiên, gieo hạt

và giâm cành đã cho thấy không đạt hiệu quả cao, gieo bằng hạt thì chậm lớn, độ trưởng thành và ra hoa chậm [64]

Hiện nay mới chỉ có nghiên cứu nhân giống in vitro một số loài

Lavandula angustifolia của nhóm Đỗ Tiến Vinh, Mai Thị Phương Hoa, Lê

Bảo Ngọc (2016) sử dụng môi trường MS có bổ sung BAP (0,1 mg/l) và IAA (0,5 mg/l), [2] Trong đó chưa thấy có các công trình nghiên cứu về

Lavandula dentata Các kết quả nghiên cứu còn chưa nhiều, chưa hoàn thiện

và chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng phong phú của con người

Ngoài ra, đối với việc sản xuất cây Oải hương nước ta cũng còn nhiều hạn chế, phần đa là trồng ở Đà Nẵng và một số vườn nhỏ rải rác ở các nơi.Nguyên nhân một phần điều kiện khí hậu không hợp, nguồn cung cấp giống chưa nhiều Chủ yếu trồng bằng hạt hay giâm cành nhưng hiệu quả đạt được không cao, ngoài ra còn nhập ngoại nhưng giá thành lại khá cao [60], [63]

Do đó, việc triển khai xây dựng quy trình nghiên cứu Lavandula

dentata L là rất cần thiết vừa để đáp ứng nhu cầu thị trường sử dụng cây

Oải hương để lấy tinh dầu, vừa bổ sung thêm tài liệu nuôi cấy mô cây Oải hương ở Việt Nam

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) Vật liệu nghiên cứu là đốt thân cây Oải hương lá xẻ (Lavandula

dentata) trưởng thành được lấy từ vườn cây ươm giống ở Đà Lạt

2.2 Thời gian và điạ điểm nghiên cứu

2.3.2 Dụng cụ

Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịtcồn, vỉ xốp nuôi cấy,…

2.4 Môi trường nuôi cấy

- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh

dưỡng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) gồm các chất khoảng đalượng, vi lượng, vitamin bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Kinetin (KI), 6-Benzyl amino purine (BAP), α-Napththalen acetic acid (α-NAA), IAA (Indol-3-axit axetic) (Dulchefa, Hà Lan)

- pH môi trường: 5,8

- Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 oC trong 15 phút.

2.5 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo

- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng2000lux

- Quang kì: 16 giờ/ ngày

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

Cây hoa Oải hương lá xẻ

Cây hoa Oải hương in vitro

Nhân nhanh hoa Oải hương

Tạo cây in vitro

hoàn chỉnh

Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên

Tạo cây in vitro bằng phương pháp

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu

Nhân giống cây Oải hương lá xẻ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

a Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu

Tiến hành lấy cây Oải hương trưởng thành, loại bỏ hết lá tránh làm tổn thương đến chồi nách, sau đó xử lí sơ bộ bằng cách: rửa bằng xà phòng (ngâm, lắc trong 30 phút), rửa lại bằng nước cất khử trùng trong buồng cấy

vô trùng, lắc mẫu trong Etanol 70 (v/v)/ 5 phút + nước cất khử trùng 2-3 lần, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch Javen ở các nồng độ khác nhau trong

Tỷ lệ mẫu sạch sống % =

Tỷ lệ mẫu sạch chết % =

b Thí nghiệm 2: Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose, 7g/l agar có bổ sung Kinetin và BAP với nồng độ khác nhau tương ứng với các công thức được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến

sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây hoa Oải hương

Tổng mẫu sạch chếtTổng số mẫu cấy vào x100%

c Thí nghiệm 3: Ra rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose, 7g/l agar có bổ sung NAA và IAA với nồng độ khác nhau tương ứng với các công thức được liệt kê ở Bảng 2.3

Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IAA đến ra

rễ và tạo cây Oải hương hoàn chỉnh