Đề tài công trình nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền

PHẦN MỞ ĐẦU Người trồng hoa đồng tiền, toán lại ngả theo hướng hiệu kinh tế Cần biết rằng, trồng hoa đồng tiền sau tháng thu thu liên tục 4-5 năm phải trồng lại Nó lại cho hoa quanh năm Đồng tiền loài hoa đẹp, nhiều màu sắc Hoa lớn vừa phải mà cuống lại dài nên dễ bó dễ cắm Ta cắm loại hoa đồng tiền cắm xen với loại hoa khác Hầu hết lẵng hoa trang trí có dùng hoa đồng tiền Càng ngày, hoa đồng tiền ưa chuộng đòi hỏi với số lượng lớn Giá cao Vì vậy, ruộng hoa đồng tiền nguồn thu nhập nhiều gia đình nơng dân Ở Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hải Dương Đà Lạt, có nhiều gia đình chọn nghề cho trồng hoa đồng tiền Hàng loạt giống hoa đồng tiền nhà khoa học tạo với kiểu dáng màu sắc vượt trội Khả chống chịu sâu bệnh, thời tiết chúng nâng lên, phạm vi thích nghi ngày mở rộng Hoa đồng tiền dễ trồng không khắt khe loại đất Tuy nhiên, đất tơi xốp, nhiều mùn thống khí loại đất thích hợp Phải lưu ý, tránh trồng hoa đồng tiền vào chỗ bị ứ nước, tù đọng Hoa đồng tiền ưa khí hậu mát mẻ (từ 15-25oC) Tuy nhiên, có giống chịu nhiệt độ cao (từ 30-34oC) Nhưng tốt nên trồng vụ thu đơng để có hoa to đẹp Ta cần lưu ý giảm cường độ ánh sáng vào ngày nắng nóng cho (bằng cách dùng lưới đen căng luống) Hoa đồng tiền không chịu úng, lại đòi hỏi lượng nước lớn Độ ẩm đất cần giữ mức 60-70% Như vậy, ta phải lo tưới bổ sung thường xuyên cho chúng Nếu bố trí hệ thống tưới nhỏ giọt giàn phun mưa tốt Hoa đồng tiền đòi hỏi nhiều phân (cả phân hữu cơ, phân vô cơ, phân vi lượng) Sức sống chất lượng hoa phụ thuộc nhiều vào phân bón Ta phải lo từ 30-35 phân chuồng hoai mục khoảng 300kg NPK cho 1ha trồng hoa đồng tiền Cây hoa đồng tiền không chịu mưa nhiều, sương muối ánh sáng mạnh Vì vậy, ta phải lo giàn che mái lợp nylon cho chúng Trồng khoảng 60.000 cây/ha Chỉ sau 80-90 ngày bắt đầu cho hoa Cây sinh thêm nhiều nhánh Mỗi nhánh ta tỉa để lại để nuôi hoa Ta nên ngắt bỏ nụ xấu để tập trung sức cho nụ khỏe Nếu trồng tốt, năm ta thu 50-100 hoa/cây Hoa đồng tiền nhân giống hạt, tách phương pháp nuôi cấy mô Giống yếu tố định bà phải thận trọng Hiện có nhiều tài liệu viết trồng hoa đồng tiền, bà ta tìm đọc làm hết Chuyên gia Nguyễn Lân Hùng Nhân giống in vitro - gọi vi nhân giống việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật điều kiện vô trùng, bắt đầu mảnh cắt nhỏ nhiều phận khác thực vật Sau làm vi sinh vật, mảnh nuôi cấy vô trùng (trong ống nghiệm loại bình ni cấy khác) Trong thực tế, thuật ngữ nhân giống in vitro nuôi cấy mô sử dụng để phương thức nhân giống thực vật điều kiện vô trùng GS-TS Quang Thạch (Viện Sinh học nông nghiệp) Xuất phát từ hai thự tiển em tiến hành thu thập tài liệu nhằm củng cố mặt kiến thức để tiến hành nuôi cấy in vitro hoa đồng tiền PHẦN THỔNG QUAN TÀI LIỆU I.GIỚI THIỆU HOA ĐỒNG TIỀN Cây Đồng Tiền Chi hoa Đồng Tiền (Gerbera) chi số loài cảnh họ Cúc (Asteraceae) Tên gọi Gerbera đặt theo tên nhà tự nhiên học người Đức Traugott Gerber Chi có khoảng 30-100 loài sống hoang dã, phân bố Nam Mỹ, châu Phi đại lục, Madagascar vùng nhiệt đới châu Á Miêu tả khoa học dầu tiên vè chi Gerbera J.D Hooker thực tạp chí thực vật Curtis năm 1889 khioong miêu tả Gerbera Jamesonii, loài Nam Phi biết tên gọi cúc Transvaal hay cúc Barberton Ta biết đồng tiền có sơ đồ phân loại sau: - Giới (regnum): Plantae - Ngành (diviso): Magnoliophyta - Lớp (class): Magnoliopsoda - Bộ (ordo): Asterales - Họ (familia): Asteraceae - Phân họ (subfamilia): Mutisioideae - Tông (tribus): Mutisieae - Chi (genus): Gerbera Đặc điểm Các loài chi Gerbera có cụm hoa dạng đầu lớn với hoa tia hai mơi bật có màu vàng, da cam, trắng, hồng hay đỏ Cụm hoa dạng đầu có bề ngồi dường bơng hoa, thực tế tập hợp hàng tăm hoa nhỏ riêng biệt Hình thái hoa nhỏ phụ thuộc nhiều vào cị trí chúng cụm hoa Hoa đồng tiền (gerbera) thuộc thân thảo, thân khoảng 1,5-2 cm, mọc trồi lên mặt đất, dạng bẹ cao khoảng 15-30 c tùy giống điều kiện chăm sóc, mặt sau có lớp nhung màu trắng Hoa nở quanh năm nhiều vào mùa hè mùa thu Các giống trồng vườn chủ yếu lai ghép chéo Gerbera Jamesonii loài khác Nam Phi Gerbera Viridifolia Giống lai ghép chéo có tên khoa học Gerbera Hybrida Hiện tồn hàng trăm loại giống khác Chúng dao động mạnh hình dạng kích thước hoa Màu sắc trắng, vàng, da cam, đỏ hay hồng Ở phần trung tâm bơng hoa đơi có màu đen Thơng thường hoa có cánh hoa có vài màu khác II GIỚI THIỆU NUÔI CẤY MÔ Định nghĩa nuôi cấy mô Nuôi cấy mô phạm trù khái niệm chung cho tất loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện mơi trường Nhân gióng in vitro hay cịn gọi vi nhân giống sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu nhiều phận khác thực vật có kích thươc nhỏ, sinh trưởng điều kiện vô trùng ống nghiệm loại bình ni cấy khác Thực tế, nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro nuôi cấy mô thay đôi cho phương thức nhân giống thực vật điều kiện vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa nuôi cấy in vitro Cơ sở khoa học thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Năm 1838, nhà thực vật học Matthias Jacob Schleudeb năm 1839 nhà động vật học Theodor Schwann thức xây dựng học thuyết tế bào Schleiden Schwas khẳng định : Mỗi thể động thực vật bao gồm thể tồn hồn tồn độc lập, riêng lẽ tách biệt, tế bào Trên sở đó, Haberlandt người đề xướng r phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật năm 1902 đề chứng minh cho tính tồn thể tế bào Theo ơng tế bào thể sinh vật đa bào có tiềm tàng để phát triển nhanh thành cá thể sinh vật đa bào có tiềm tàng dể phát triển nhanh thành cá thể hoàn chỉnh môi trường dinh dưỡng nhân tạo Mặc dù ơng gặp thất bại thí nghiệm đối tượng: ni cấy tế bào đơn tách từ nhu mô lá, tượng tầng tầng biểu bì lơng hút nhiều thực vật Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rể cà chua (Lycopersicum esculentum) mơi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose, đầu rể sinh trưởng mạnh tạo nên hệ rể nhỏ có rể phụ Nhưng sinh trưởng xãy thời gian chậm dần ngường hẳn chuyển sang môi trường Cùng thời gian này, Kogl lần xã định xác định dược vai trò IAA, hoocmon thực vật thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trưởng phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian từ mô thượng tần cà rốt thuốc lá, mơ sẹo có khả sinh trưởng liên tục Năm 1941, Overbeek cs sữ dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Datura Năm 1955, Miller cs phát minh cấu trúc sinh tổng hợp kinetin – cytokinin đóng vai trị quan trọng phân bào phân hóa chồi mơ ni cấy Đến năm 1957, Skoog Miller khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất auxin: cytokinin môi trường phát sinh quan (rễ chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn lớn, mơ có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hóa chồi rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hóa chồi rễ, tạo hồn chỉnh Cơng trình (nguyễn thị nga, Nguyễn thị phương hoa…) Vật lieu nghiên cứu tập đoàn 14 mẫu giống hoa đồng tiền nhập nội từ Côn Minh (TQ) dạng cấy mô xuất vườn Đây giống trồng phổ biến sản xuất người dung ưa chuộng Trong đó, giống nhân giống chủ đạo giống hoa kép, màu đỏ nhung, nhị màu nâu Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hành sử dụng cho - nghiên cứu Phương pháp bố trí thí nghiệm tiêu theo dõi, điều tra tiến hành theo phương pháp nghiên cứu nông sinh học thơng dụng thí nghiệm đợc thự phịng thí nghiệm, vườn thực nghiệm cơng nghệ - sinh học- viện sinh học nông nghiệp trường đại học nông nghiệp hà nội Để có nguồn cho q trình ni cấy in vitro chọn lựa mẹ bệnh, sinh trưởng phát triển tốt để làm nguồn mẫu ban đầu vào mẫu Được dung HgCl2 để khử trùng mẫu Bảng 1: Ảnh hưởng thời gian khử trùng vị trs mẫu đến khả sống mẫu cấy Cơ quan nuôi Chỉ tiêu theo cấy dỏi Thân Tỷ lệ mẫu nhiểm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Cuống non Tỷ lệ mẫu nhiểm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Thời gian khử trùng phút phút 93.3 86.7 phút 73.3 6.7 13.3 26.7 0.0 0.0 0.0 93.3 46.7 13.3 0.0 33.3 86.7 Lá non Cuống hoa Hoa non Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiểm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiểm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiểm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) 6.7 20.0 0.0 86.7 66.7 3.3 0.0 26.7 96.7 13.3 6.6 0.0 80.0 46.8 6.7 6.7 20.0 93.3 13.3 33.2 0.0 66.7 33.3 13.3 0.0 26.7 86.7 33.3 40.0 0.0 Bảng Ảnh hưởng tổ hợp Benzyl adenine (BA) + Kinetin (K) + Indol acetic axit (IAA) đến phát triển hình thái mẫu cấy ( sau 16 tuần nuôi cấy) Công thức Đối chứng (ĐC) 0.3ppm BA+0.2ppmK+0.2ppmIA A 0.5ppm BA+0.2ppmK+0.2ppmIA A Sự phát sinh hình thái Lá non Cuống non Mẫu có chết sau màu xanh tuần chết sau tuần Mẫu có Chết màu xanh phồng chết sau tuần Sùi callus Sùi callus 15% sau 5% sau 10 10 tuần tuần nuôi nuôi cấy cấy Hoa non Cuống hoa chết sau chết sau tuần tuần Chết Chết Sùi callus Chết 17%sau tuần ni cấy, có 1.0ppm BA+0.2ppmK+0.2ppmIA A Sùi callus 23% sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 13% sau 10 tuần nuôi cấy 1.5ppm BA+0.2ppmK+0.2ppmIA A Sùi callus 10% sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 7% sau 10 tuần nuôi cấy 6.7%tạo thành chồi sau 16 tuần nuôi cấy Sùi callus Chết 25%sau tuần ni cấy, có 20%tạo thành chồi sau 16 tuần ni cấy Sùi callus Chết 9% sau 810 tuần nuôi cấy 2.0ppm BA+0.2ppmK+0.2ppmIA A Sùi callus 5% sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 3% sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus Chết 3% sau 810 tuần nuôi cấy Nhân nhanh Sauk hi có chồi non hình thành từ trình trên, tiến hành tách chồi non thành cụm nhỏ từ 2-3 chồi cụm đưa vào mơi trường ni cấy có bổ sung riêng rẽ BA,Kinetin, đường saccharoza với nồng độ khác nhằm tìm mơi trường thích hợp cho q trình nhân nhanh( kết thu trình bày bảng 3) Nồng độ đường môi rường nuôi cấy 2.5% tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh Bảng Ảnh hưởng Kinetin đến trình nhân nhanh (sau tuần nuôi cấy) Công thức Hệ số nhân Chiều cao(cm) Số lá/cây ĐC (MS) MS+0.3ppmK MS+0.3ppmK MS+0.3ppmK MS+0.3ppmK MS+0.3ppmK CV (%) LSD (5%) 1.44 2.45 3.09 5.78 2.67 2.22 1.60 0.08 1.67 1.60 2.27 2.85 2.02 2.26 1.00 0.04 3.44 2.78 3.36 3.67 3.33 2.56 0.60 0.03 Ra rể Bảng Ảnh hưởng αNAA đến trình rể Chỉ tiêu Tỷ lệ rể chồi theo dỏi Công thức Sau Sau tuần tuần ĐC(MS) 100 MS+0.1pp 20.0 100 m αNAA MS+0.1pp 40.0 100 m αNAA MS+0.1pp 20.0 100 m αNAA Số rể Chiều dài Chiều dài TB TB cây(cm) rễ(cm) Ban đàu Sau tuần 4.30 0.50 4.00 5.80 8.30 0.60 4.00 6.00 4.00 1.00 4.00 5.80 3.70 0.80 4.00 5.50 Ra vườn Bảng Ảnh hưởng trồng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng, phát triển nuôi cấy mô giai đoạn vườn ươm( sau tuần theo dõi) Chỉ tiêu theo dõi Tỹ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số ( lá/cây) Nền trồng Đất phù sa sông hồng Cát Trấu hun Mùn Đất +mùn(1:1) Cát + trấu hun (1:1) Mùn + trấu hun (1:1) 76.60 7.15 9.10 91.33 6.00 83.33 80.00 73.33 6.90 5.98 7.35 7.37 6.61 9.10 6.16 8.59 8.67 9.33 93.25 7.50 9.50 Bảng Ảnh hưởng thời vụ trồng đến sinh trưởng đồng tiền cấy mô vườn ươm (sau tuần) CT Thời vụ Vụ t2-t3 Vụ hè t6-t7 90 Vụ thu t9- 90 t10 Vụ đơng 90 t12-t1 Số thí Tỷ lệ sống Chiều cao Số nghiệm (%) lá(lá/cây) cây(cm/cây ) xuân 90 94.31 7.52 9.60 35.46 91.37 6.86 7.35 8.85 9.55 83.56 6.17 7.97 Kết cơng trình 5.1 Vào mẫu Từ bảng ta thấy Tỹ lệ mẫu nhiểm tỹ lệ nghịch với thời gian khử trùng mẫu Vị trí lấy mẫu khác cho kết khử trùng khác Mẫu nuôi cấy từ hoa non cho tỷ lệ mẫu cao đạt 33.3% phần non, cuống hoa Thời gian khử trùng phút cho tỷ lệ sống cao vị trí lấy mẫu Trên hầu hết môi trường bổ sung chất điều tiết sinh trưởng mẫu cấy phát sinh hình thái theo hướng hình thành callus Duy có cơng thứ bổ sung 1ppm BA+0.2ppmIAA+0.2ppmK cho 20%mẫu cấy tạo thành chồi mẫu cấy hoa non hướng mà người nghiên cứu mong muốn Thời gian để mẫu cấy tái sinh chồi 16 tuần, đặc điểm đặc trưng đồng tiền 5.2 Nhân nhanh Nhìn chung, bổ sung chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng kích thích đẻ chồi cao so với đối chứng Môi trường cho hiệu số nhân chồi nhanh mơi trường có bổ sung Kinetin nồng độ 1.0mg/l(hệ số nhân đạt 5.78 lần) đồng thời cho chất lượng chồi cao ( chiều cao đạt 2.58cm, số đạt 2.67 lá/cây) Kết luận Môi trường cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi tốt MS + 1ppm Kinetin +2.5%đường saccharazo 5.3 Tạo rể Chồi đồng tiền hồn tồn có khả rể sau tuần nuôi cấy ( tỉ lệ đạt 100%) tất môi trường Bổ sung 0.1ppm αNAA cho tỉ lệ đạt 100% củng chất lượng cao Mơi trường thích hợp để tạo hoàn chỉnh MS + 0.1ppm αNAA 5.4 Ra vườn Với trồng khác trồng trấu hun hồn tồn khơng thích hợp cho việc đồng tiền (tỷ lệ sống đạt 6%) Giá thể cát cho tỉ lệ sống tương đối cao sinh trưởng chậm Giá thể thích hợp mùn trấu hun(1:1) (tỉ lệ sống cao 93.5%, sinh trưởng mạnh nhất) Thời vụ đồng tiền cấy mô vụ xuân, thu, đông tránh vụ hè thời tiết nắng nóng, tỹ lệ chết cao Thời vụ tốt vụ xn Cơng trình 2.(Nguyễn Thị Diểm Chi trường đại học Kĩ thuật Công nghệ TPHCM) Vật liệu ban đầu Hoa đồng tiền nhân giống phương pháp là: phương pháp hữu tính (nhân giống hạt) phương pháp nhân giống vơ tính ( nhân giống tách cây, cắm cành, ni cấy mơ tế bào ) Cịn ni cấy in vitro, mẫu cấy cịn non vườn mẹ đế hoa non Trong nghiên cứu lần chọ khỏe mạnh chon vườn thường bẩn nhiểm loại nấm, khuẩn khác Khử trùng mẫu Mẫu chọn đem rửa đất, cát vịi nước máy chảy mạnh Sau ngâm dung dịch xà phòng loảng lắc máy lắc 10 phút, tốc độ 200 vòng/phút Rửa cho hết xà phòng tiến hành khử trùng dung dịch Calcium Hypochlorit nồng độ 15% 15 phút máy lắc( để chất khử trùng tác dụng lên mẫu) Sauk hi khử trùng đem mẫu vừa lắc cho vào tủ cấy vô trùng sửa nước cất lần Vào mẫu Đưa mẫu thấp cho khô nước, dùng pank, dao cắt bẹ phía ngồi, tách bẹ phía lấy đỉnh sinh trưởng ( tách đài hoa phía ngồi đế hoa, tách lấy đế hoa ) cấy vào môi trường MS + 0.3 mg/l BA + 30g/l đường +7 g/l agar Tại trung tâm nghiên cứu khoai tây, rau hoa ) Nhân nhanh Mẫu nhập tuần phát triển thành cụm chồi Tiến hành cấy chuyền qua môi trường nhân giống môi trường MS+0.5 mg/l BA +25 g/l đường + g/l agar( trung tâm nghiên cứu khoai tây, rau hoa ) Trong thời gian này, hệ số nhân đạt 4-5 lần Thời gian giai đoạn dài hay ngắn tùy thuộc vào lượng nhân Cứ khoảng 30 ngày tiến hành cấy chuyền lần, cấy 4-5 cụm vào bịch môi trường, cụm khoảng 5-6 đơn 5 Ra rể Cây đồng tiền sau nhân đủ số lượng mong muốn đưa vườn ươm, ta phải qua giai đoạn tạo rể Khi tách khỏe mạnh, cấy từ đơn sang môi trường tạo rể Khi chuyển tách khỏe mạnh, cấy đơn sang môi trường tạo rể với số lượng 10-15 cây/bịch Môi trường MS + 0.3mg/l NAA +30g/l đường +7 g/l agar + 0.2 g/l than hoạt tính Ra vườn Khi tạo rể, chuyển vỉ, luống ươm có chất dể nước, tơi xốp giử độ ẩm tronh ngày cần phủ ni long để giảm thoát nước Để tránh bị nước mau héo dẩn đến chết, vườn ươm phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao ... củng cố mặt kiến thức để tiến hành nuôi cấy in vitro hoa đồng tiền PHẦN THỔNG QUAN TÀI LIỆU I.GIỚI THIỆU HOA ĐỒNG TIỀN Cây Đồng Tiền Chi hoa Đồng Tiền (Gerbera) chi số loài cảnh họ Cúc (Asteraceae)... chuộng Trong đó, giống nhân giống chủ đạo giống hoa kép, màu đỏ nhung, nhị màu nâu Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hành sử dụng cho - nghiên cứu Phương pháp bố... Cơng trình 2.(Nguyễn Thị Diểm Chi trường đại học Kĩ thuật Công nghệ TPHCM) Vật liệu ban đầu Hoa đồng tiền nhân giống phương pháp là: phương pháp hữu tính (nhân giống hạt) phương pháp nhân giống