Nghiên cứu nhân giống cây oải hương lá xẻ (lavandula dentata l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy canh

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởiđầu...22Bảng 2.2: Các công thức nghiên cứu ảnhhưởng của BAP, Kinetinđến sựtái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây hoa Oải Bản

BỘ GIÁODỤC

VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNGĐẠI HỌC

SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN§THỊ THÚY MAI

OẢIHƯƠNGLÁ"XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)

BẰNGKỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ§

VÀVI THỦY§CANH

LUẬNVĂN/THẠC SĨ SINH0HỌC

BỘ GIÁODỤC

VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNGĐẠI HỌC

SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN§THỊ THÚY MAI

OẢIHƯƠNGLÁ"XẺ (LAVANDULA DENTATA L.)

BẰNGKỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ§

HÀ NỘI- 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết§ ơn chân thành và sâu sắc đến

TS La Việt Hồng đã!tậntình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi)điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường5Đại học Sư phạm

Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN;trường Đại học Sư phạm HàNội 2, đã!tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này.Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng góp

ýDkiếnđể tôi hoàn thành luận văn này, nhân đâyGtôi cũng xinchân

thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạnbèJđã!động viên, tạomọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập7cũngnhư hoànthành luận văn

Mặcdù đã!hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời)gian và trình

độ chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót,tôi rất mong nhậnđược sự góp ý của thầy cô?để luận văn của tôi có thểhoàn thiệnhơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2018

Học viên

NGUYỄN THỊ THÚY MAI

Tôi xincam1đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống

cây Oải hương2láQxẻ (Lavandula dentata L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô và vi thủy canh” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS La Việt

Hồng hướng dẫn Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọnđề tài 1

2 Mục đíchWnghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa1khoa1học vàýnghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 4

Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Oải)hươngláaxẻ 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây Oải hương lá xẻ. 5

1.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải)hươnglá xẻ 6

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây Oải hương lá xẻ 6

1.2 Giới thiệu-phương pháp nhân giống cây Oải hương5in vitro 8

1.2.1 Nhân giống cây Oải hương5từ mô phân sinh 9

1.2.2 Nhân giống cây Oải hương5thông qua1sự phát sinhcơ quan 12

1.3 Phươngpháp vi thủy canh 14

1.3.1 Sơ6lược về phương pháp vi thủy canh 14

1.3.2 Ưuiđiểm của phươngpháp vi thủy canh 15

1.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải)hươnglá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải) hương lá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu cây Oải hương lá xẻ ở Việt Nam 19 Chương2: ĐỐI TƯỢNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2 Thời)gian vàđiạ điểm nghiên cứu 20

2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 20

2.3.1 Thiết bị 20

2.3.2 Dụng cụ 20

2.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.5 Điều kiện nuôi cấy 21

2.6 Phươngpháp7nghiêncứu 21

2.6.1 Bố trí thí nghiệm 21

2.6.2 Phương5pháp nghiêncứu 22

2.7 Phươngpháp7xử lý số liệu 26

Chương3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu in vitro 27

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro 29

3.3 Ra rễ in vitro tạo cây hoàn chỉnh 31

3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 34

3.5 Thiết kế, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn luyện cây Oải hươnglá xẻ in vitro thích nghi với)điều kiện tự nhiên 36

3.5.1 Thiết kế hệ thống vi thủy canh,= xác định thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi thủy canh và môi trường 36

3.5.2 Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và dung dịchdinh dưỡng đến tỷ lệ ra rễ và sự sinhtrưởng của chồi cây Oải)hương 39

3.5.3 Chuyển và huấn luyện cây Oải hương5từ hệ thống vi thủy canh thích nghi với điều kiện tự nhiên 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 42DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN~ ĐẾN LUẬN

VĂN 43TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi)đầu 22Bảng 2.2: Các công thức nghiên cứu ảnhhưởng của BAP, Kinetinđến sự

tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây hoa Oải

Bảng 2.3: Các công thức nghiên cứu ảnhhưởng của NAA, IAA đến ra rễ

và tạo cây Oải)hương hoànchỉnh 24Bảng 2.4: Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây Oải hương 25

Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ đốt thân cây Oải

hương lá xẻ 27Bảng 3.2: Kết quả ảnhhưởng của BAP và KIN đến quá trình nhân nhanh

chồi cây Oải hương5in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 29Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnhhưởng của NAA vàIAAđến khả năng5

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và

dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chồi cây Oải

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây hoa Oải)hươnglá xẻ (Lavandula dentate L.) 5

Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic) 15

Hình2.1: SơSđồ nghiên cứu 21

Hình 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi)đầu in vitro từ đốt thân 28

Hình 3.2: Chồi cây hoa Oải hương 31

Hình 3.3: Rễ cây Oải)hươnglá xẻ in vitro 34

Hình 3.4: Rèn luyện cây Oải)hương lá xẻ in vitro 36

Hình 3.5: Thiết kế hệ thống vi thủy canh đơn giảnđể huấn luyện cây Oải hương lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. 37

Hình 3.6: Sơ đồ quy trình nhân giống cây hoa Oải) hương lá xẻ Lavandula dentata L bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và vi thủy canh 41

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn2đề tài

Cây hoa Oải hương lá xẻ hay còn gọi là Oải)hương5Pháp có

tênkhoa học là Lavandula dentata L là một loài thực vật có hoa thuộc họ

Hoa môi (Lamiaceae), có nguồn gốc từ Địa Trung Hải,=cáchòn đảo3ĐạiTây Dương vàbán đảo Ả-rập Đây là loài cây bụi thường niên,Xhoathường có màu tím đặc trưng và mùi thơm nồng, thích nghi vớinhững5nơi cóCkhí hậu ôn đới khô và lạnh

Lavandula là cây hương liệu có giá trị thương mại quan trọng và

thường5được trồng bằng hạt hay giâm cành bằng thân cây Tuy nhiên, cácphương pháp này thường tốn nhiều thời gian mà hiệu suất không cao vàtổng hợp các chất thứ cấp thấp, chưa kể đến các biến dị về kiểu gen và kiểu

hình Cây Lavandula có nguồn gốc từ sự nhân giống in vitro đã cho thấy

năng suất cao và chất lượng tinh dầu tốt, được coi như làmột giải pháptuyệt vời)để vượt qua các vấn đề như sự thoái hóa giống đã được quan sátthấy ở các giống Oải)hương trồng5theo phươngpháp truyền thống [17]

Kỹ thuật nuôi cấy mô (hay còn gọi là vi nhân giống, nhân giống in vitro)

đã!được nghiên cứu-và thươngmại hóa trên nhiều-đối tượng cây trồng khácnhau, kỹ thuật này có ưu- điểm có thể nhân nhanh với số lượng lớn trong thờigian ngắn, giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ [6] Phương pháp nhân giốngnày đáp7ứng5được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổnđịnhđápứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng và cho chất chuyển hoá có giá trị trongsuốt cả năm mà không? hạn chế theo mùa [62] Tuy nhiên, nuôi cấy mô theophương5 pháp7 truyền thống còn sử dụng quy trình phứctạp và kéo3dài.Việc nuôi cấy trong các điều kiện vô trùng5có ảnh hưởng5 lớn đến sự tăngtrưởng5và phát triển của cây consau khi chuyểnra vườn ươm (quátrìnhthuần hóa) Những5hạn chế kể trên làm cho3sản phẩm nuôi cấy mô

có giá thànhtương đối cao [67]

Hệ+thống vi thủy canh làsự kết hợp giữa1thủy canh vàvinhângiống, có nhiều-ưu-điểm vượt trội vàlà một kỹ thuật mớitrongnuôi cấy mô Các bước nuôi cấyPphức tạp'được rút ngắn; dođó,Ccông lao3động và thời gian được giảm bớt; các bướcnuôi)cấyPban đầu, nhân nhanh, tạo'chồi,ra rễ\được thực hiệnmột8cáchliên tục Trongđó,Cbước ra rễ\và thuầndưỡng có thể kếthợp7thànhmột bước

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây Oải) hương lá xẻbằng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, nhằm góp phầnđápứng cây cây giống phục vụ nhu cầu cho3con người

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi)đầu cho nuôi cấy in vitro từ đốt thân.

- Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi Oải)hươngin vitro.

- Nghiên cứu tạo cây Oải hương5in vitro hoàn chỉnh.

- Nghiên cứu rèn luyện cây Oải hươngin vitro thích nghi với)điều

kiện tự nhiên

- Nghiên cứu cải tiến, thử nghiệm hệ thống vi thủy canh để rèn

luyện cây Oải hương5in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.

Đề tài góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu nhân giống in

vitro và vi thủy canh trênđối tượng cây Oải hương5lá xẻ(Lavandula dentataL.).

5.2.Ý nghĩathực tiễn

Kết quả của đề tài làcơ sở cho nhân giống cây Oải hương lá xẻbằng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật vi thủy canh, cung cấp cây giốngsạch bệnh số lượng lớn

NỘI DUNG

Chương 1:>TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Oải1hương láQxẻ

Tên khoa học: Lavandula dentata L.

Tên Việt Nam: Cây Oải)hươnglá xẻ

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Oải hương lá xẻ hay còn gọi là Oải hương Pháp có tên khoa học

là Lavandula dentata L có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, cácahònđảo3Đại

TâyG Dương và bán đảo Ả-rập… [53] Chi Oải) hương cóC khoảng 39loài, nhiều giống lai và gần 400 giống cây trồng5đã có!đăng ký [58]

Lavandula là một chi nhỏ thuộc các loài cây nửa bụi hoặc cây bụi thuộc

họ Bạc hà (Lamiacae) [5] Thời kỳ ra1hoa thường từ tháng 6rđến tháng

8 [52] Rất nhiều trong số đóCcóCchất§thơm vàdược tínhđược sử dụng rộngrãi để chiết xuất tinh dầu Nhu cầu tinh dầu hoa Oải hương ngày càngnhiều, tinh dầu hoa Oải hương được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

mỹ phẩm, hương liệu, dược liệu, gia vị cho món ăn, ngoài ra1còncóCtác dụng trong trang trí [53]

Tên khoa học chi Lavendula (Lavandula) bắt nguồn từ tiếng Latinh

―Lavare‖,€ chúng phân bố chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, bán đảo Ả Rập,quần đảo Canary, Maderia, Bắc phi, Tây Nam Á và Ấn Độ Ở Việt Nam, cókhoảng 4 loài và một số giống lai được trồng chủ yếu ở ĐàLạt- nơi có

đẹp7hơn Lavandula dentata L.Ithuộc loạiláanhỏ.

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây Oảihương lá xẻ.

Hình 1.1: Cây hoa Oải1hương láQxẻ (Lavandula dentate L.) [66]

Thân: Cây Oải)hương láaxẻ có thân nhỏ, cao từ 0,2 - 1m, cây phân

thành nhiều nhánh và mọc thành bụi Toàn thân có lớp lông mỏng phủngoài

Lá: Cây có nhiều lá, lá nhỏ, hẹp, hình dải có mép hơi gập xuống,

không có cuống, màu xanh thẫm, mọc đối xứng Bề mặt§ lá cũng5cólông Đặc biệt, cây có mép lá xẻ nênđược gọi là cây Oải hương lá xẻ

Rễ: Rễ cây dạng chùm, ưa1sống ở những5nơi hơi kiềm,=đất§tơi

xốp, thoát nước tốt.

Hoa: Hoa mọc thành chùm ở đỉnh, đối xứng5hai bên, lưỡng tính,

mẫu 5, đài và tràng hợp thành ống có hai môi rõ Hoa Oải hương có

màu-tím hoa1cà, ống5hoa được sắp xếp liên tục vòng quanh cuống hoa.Cuống hoa dài, màu xám, có góc cạnh Thời kì ra hoa của cây là vàokhoảng5tháng 6 đến tháng 8 [63]

1.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh của cây Oải hương lá

hư hỏng,5sinh sản của sâu hại vàdịch bệnh.

- Ánh sáng: là cây ưa1sáng nên cầnrất nhiều)ánh sáng5mặt trời và môi

trườngđộ ẩm thíchWhợp.7NêncóCít nhất50 Pánh sáng5của1mặt trời che khuất§ trong mùaM hè,J tăng cường thông gió) đểF giảm nhiệt§ độ môi trường xung5

quanh

- Nhiệt độ: nhiệt độ sinhtrưởng5tốt nhất 15-25°C và từ 5-300C cóCthểphát triển)[65]

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây Oảihương lá xẻ

Hoa Oải)hương được sử dụng rộng5rãi để trang trí và tạo mật choong bướm đếnhút và cũng cóCthể trồng tái tạo cho các khu rừng bị cháy

do hỏa hoạn [53]

Trong y học cổ truyền,G lá và hoa tươi của1 cây Oải& hương5 được sử dụng để làm giảm đau đầu và đau-khớp, dùng lá và hoa để xông cho người

bị cảm lạnh`[7].

Tuy nhiên, giá trị kinh tế của Lavandula spp chủ yếu-liên quan đến

các đặc tính của các loại tinh dầu-thường được sử dụng trong ngànhthẩm mỹ và trị liệu Tinh dầu Oải)hươngđược sử dụng rộng rãi trong sảnxuất xà phòng,=nước hoa, phụ gia thực phẩm và các sản phẩm khác, nhưcác chất làm dễ chịu hay là tác nhân kháng khuẩn [10]

Bằng chứng cho việc sử dụng Lavandula spp trị liệu có thể được

bắt nguồn từ những5người La Mã cổ đại vàngười Hy Lạp [60]

Tinh dầu Oải)hương được sinh ra từ tuyến lông trên bề mặt của lá và

có thành phần chính là các nhóm hidrocacbon không no, có khoảng từ 50 đến

60 trong số đóC đã được xác [13] Linalool và linalool acetate là các nhómhidrocacbon không no phong phú nhất trong các giống hoa Oải hương [34].Thành phần của tinh dầu-được xácađịnh chủ yếu bởi kiểu gen, mặc dù điềukiệnmôi/trường và nuôi cấy cũng5có thể gây ảnh hưởng lớn Trong câythành phần tinh dầu-cũng cósự sai khác giữa các mô khác nhau [45]

Thành phần hoá học của các loại tinh dầu trong lá của câyOải)hương lá xẻ có chứa tám hợp chất Các thành phần hoá học chínhtrong tinh dầu thu từ cây Oải hương lá xẻ được xác định là α-terpinolen(51,13%) và camphor (13,43%) có khả năng chống lại ấu trùng của

Culiseta longiareolata Macquart và Culex pipiens L., mở ra tiềm năng của

sản phẩm tự nhiên này có thể thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp để kiểmsoát muỗi [21] Ngoài ra, tinh dầu từ Oải)hương5cũng gây độc với một sốloại côn trùng, từ đó gợi ý chúng có giá trị trong ngành công nghiệp hoáchất dùng trong nông nghiệp [29]

Gần đây, cácđặc tínhdược liệu của tinh dầu hoa Oải)hương đã!được nghiên cứu bởi Woronuk [60] Những loại dầu này có thể được cơthể người hấp thụ qua ba1đường: hệ hô hấp, tiếp xúc trực tiếp7qua da và đường tiêu hóa

[49] Tinh dầu được sử dụng rộng rãi)trong5hươngliệu và xoa bóp, cónhiều lợi ích đã được công bố [10] Dầu hoa Oải)hương được cho là cóthể kích thích giấc ngủ vàđược sử dụng rộng rãi)để giảm bớt âu lo [30],[33] Tinh dầu của cây Oải hương đã được đánh giá)để điều trị chứngmất trí [54] Chất chiết xuất từ hoa Oải)hương5cũng đã!được báo cáovới các đặc tính thích hợp cho việc quản lý các rối loạn hệ thần kinhtrung5ương (Alnamer R A K., 2012) [8], [11]

Tinh dầu được chiết suất từ cây Oải hương5cũng được sử dụng trongngành công nghiệp thực phẩm do có tác dụng5tăng cường sức khỏe và dinhdưỡng Kovatcheva-Apostolova và cộng sự (2008) còn nhận thấy rằng việc

bổ sung chiết suất Lavandula vera vào gàbăm nhỏ giảm quá trình oxy hóa

lipid và sự phá hủy α-tocopherol trong thịt nấu chín, chứng minh tác dụngchống sự oxy hóa thực phẩm [32]

1.2 Giới thiệuophương2pháp nhân giống cây Oải hương2in vitro

Theo tác giả George (2008), có 2< phương pháp7 chính trong nhân

giống in vitro: nhân giống từ nách hoặc chồi đỉnh và nhân giống thông qua sự

hình thành các chồi non hoặc phôi soma Phươngpháp7đầu tiên yêu cầu các

mô phân sinh tồn tại từ trước trong các mẫu cấy.ITrongkhiphươngpháp thứ

2 liênquan đến việc xảy ra ngẫu nhiên và tạo phôi trực tiếp từ mô cấy màkhông có mô sẹo3hình thànhtrước (phát sinh cơquan trực tiếp hoặc phôitrực tiếp) hoặc gián tiếp khi chồi hoặc phôi tái sinh trên mô sẹo3được hìnhthànhtrước đó hoặc trong nuôi cấy tế bào3(phát sinhcơquanhoặc phôigián tiếp) Trong hầu hết các loài (bao gồm cả hoa Oải)hương) câytrồng vinhân giống thường5được sản xuất bằng phương pháp7đầu tiên, vì sự

ổnđịnh di truyền trong quá trình nhân giống in vitro được bảo3đảm bằng cách

tái sinh từ các mô phân sinh có sẵn và sự hình thành chồi mới mà không xảy ragiai đoạn tạo mô sẹo [24]

1.2.1 Nhân giống cây Oảihương từ mô phân sinh

Sự thành công của nhân giống in vitro phụ thuộc vào thành phần của môi

trường dinh dưỡng, nồng độ và sự kết hợp các chất§điều-hòa sinh trưởngthực vật, môi trường nuôi cấy, kiểu gen và tình trạng sinh lý của cây giống,vàđặc biệt là mẫu cấy Trong quá trình phát triển mô phân sinh, chồi)đỉnh hoặccác đoạn chứa chồi)nách được nuôi cấy tạo nhiều chồi mới mà không xảyra1giai đoạn tạo mô sẹo [48] Nói chung nhân giống thông qua phát triển mô?

phân sinh thường được chia làm 4 giai đoạn [24]: tạo vật liệu khởi đầu in

vitro (giai đoạn 1); nhân nhanh chồi) (giai đoạn 2); ra rễ tạo cây hoàn chỉnh(giai

đoạn 3) và cây thích nghi với)điều kiện tự nhiên (giai đoạn 4)

a Tạo vật liệu khởi

đầu in vitro

Việc lựa chọn các mẫu-để bắt§đầu nuôi cấy phụ thuộc vào loại/kiểu nuôi cấy, mục đích của việc nuôi cấy và phụ thuộc vào loài đượcnghiên cứu Nhân giống thông qua sự phát triển của mô?phân sinhthường gặp phát triển mô phân sinh đỉnh (meristem), chồi đỉnh (shoot tip)hoặc đốt thân (stem segments) Nuôi cấy từ đốt thân là rất phổ biến trong

nhân giống Lavandula spp bằng cấy mô.

Việc nuôi cấy cây Oải)hương in vitro liên quan đến việc khử trùng

bề mặt của mẫu cấy banđầu Về cơbản, khử trùng bề mặt bằng Etanolsau1đó là dung dịch Natri hypochlorite thường có hiệu quả khửtrùng5cao1đối với hầu hết các loài thuộc chi Lavandula

Môi) trường nuôi cấy bổ sung BAP hoặc BAP bổ sung auxin (IAA,

IBA, NAA) đã!được sử dụng5để tạo mẫu in vitro ở một số loài (L stoechas,

Lavandula viridis and L vera) [15], [31] Màu nâu của môi trường đôi khi

được quan sát, theo báo cáo của Nobre (1996) cho môi?trường nuôi cấy in

vitro L stoechasand, Zuzarte và cộng sự (2010) cho3môi trường nuôi cấy

của Lavandula pedunculata, nhưng điều này có thể được ngăn chặn bằng

axit ascorbic trong môi trường và thường xảy ra1trao đổi [62]

b Nhân nhanh chồi

Hiệu quả nhân nhanh chồi)được xácađịnh chủ yếu bởi kiểu gen, các

yếu tố môi trường in vitro và thành phầnmôi trường Ngoài ra, nó còn phụ

thuộc vào các yếu tố vật lý, hóa học khác như độ ẩm tương đối, nồng độEthylen, độ thoáng khí của bình nuôi cấy [16]

Môi)trường5MS6cơ bản được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu

liên quan đến Lavandula spp hoặc môi trường ½ MS [15], [41] Cytokinin là

chất điều-hòaƒ sinh trưởng thực vật cần thiết và gầnnhư bắt buộc cho quátrình nhân nhanh chồi,=đôi khi cóCthể kết hợp Cytokinin với nồng5độ thấp

của Auxin Theo Zuzarte (2010), nhân nhanh chồi Lavandula spp được thực

hiện bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy BAP [62].INgược lại, việc

bổ sung NAA kết hợp BAP làm giảm đáng kể số lượng chồi trong nuôi cấy

L vera và Lavandula dentata [21], [9] Việc sử dụng nước dừa mà trong đó

có chứa vitamin, axit amin và chất điều hòa1sinhtrưởng tự nhiên thúcđẩy

sự nhân chồi ở loài L latifolia và L dentata [31].

Ở loài L latifolia và L dentata sự phát triển chồi bị ảnhhưởng bởi loại

và nồng5độ Cytokinin được sử dụng5trong5môi trường nuôi cấy [31]

Trong nuôi cấy in vitro cây Oải)hương thường dẫn đến tình trạng thừa

nước (hay còn gọi là hiệntượng thủy tinh hóa, thủy tinh thể) [62] Bệnh sinh

lý nàyGthường do các điều kiện in vitro nhân tạo, đặc biệt là độ ẩm, với

sự có mặt của Cytokinin dư thừa như BAP~ [51] Ở loài L stoechas, việc

thừa nước có quan hệ với nồng5độ BAPhtrong5môi trường nuôi cấy và bị

ức chế khi có sự hiện diện của Ads [45] Thừa nước cũng quan sát§thấy ở

loài L vera, L dentata và L pedunculata với BAP nồng5độ cao [9], [21], [62].

c Ra rễ

Chồi hoa Oải hương nóiCchung có thể ra rễ ngay cả khi môi trườngkhông có chất§điều-hòaƒsinh trưởng thực vật – thuộc nhóm Auxin [62] Tuynhiên, việc bổ sung NAA là cần thiết để đạt được hiệu quả cao trong cảm

ứng chồi ra rễ L stoechas, L vera, L viridis và L dentata [9], [21], [45] Ở nhiều loài Oải hương ,=để chồi cây tạo rễ in vitro, chồi phổ biến được nuôi

cấy thử trong môi trường ½ hoặc ¼ MS, Jordan và cộng sự (1998) sử dụngmôi trường không chứa Auxin trong khi Echeverrigaray và cộng sự (2005) sửdụng5môi trường bổ sung NAA cho số rễ tăng đáng5kể [9]

Theo tác giả Dias và cộng sự (2002) việc tăng nồng độ đường từ

58,4 lên 87,6 mMq tăng tỷ lệ chồi tạo rễ in vitro ở loài L viridisshoots

[15] Mensuali-Sodi và cộng sự (1995) chỉ ra rằng cảm ứng ra rễ cho chồi ở

loài (Lavandula×intermedia Emeric ex Loiseleur) bị ức chế bởi tiền chất

Ethylen nội sinh 1-aminocyclopropane và bởi các chất ức chế tổng hợpEthylen, từ nghiên cứu-này đã dẫnđến giả thuyết là Ethylen nội sinh

đóng5vai1tròcảm ứng sự ra rễ in vitro [39].

d Rèn luyện

Giai đoạn cuối cùng của việc nhân giống in vitro đòi hỏi phải rèn

luyện/ huấn luyện hiệu quả từ môi trường nuôi cấy ra đất, thích nghi với

điều kiện sống tự nhiên [42] Cây in vitro sống trong điều kiện sống nhân tạo

có nồng độ cao các chất dinh dưỡng hữu-cơ và vô cơcácchất điều hòa sinhtrưởng thực vật, nguồn cacbonxácđịnh, độ ẩm cao, ánh sáng yếu vàtrao3đổi khí sẽ gây ra những5thay đổi về cấu trúc và sinh lý khiến cho thựcvật không thể thích nghi)ngay khi đưa1ra môi trường tự nhiên Chúng cầnđược thích nghi với môi?trường hoặc điều kiện nhà kính dần dần

Sự thích nghi của cây Oải)hương in vitro nói chung cầnđơngiản, với

sự ít thay đổi hình thái và quan trọng nữa là phải có tỷ lệ sống cao (70% ở L.

latifolia, 85-90% ở loài L stoechas, 94% ở loài L veraand và 80% ở loài L viridis) Tuy nhiên, tỷ lệ sống5cũng ngàyGđược cải thiện ví dụ như ở loài

hoa Oải)hương lá xẻ (L dentata), Echeverrigaray và cộng sự (2005) cho rằng

tỷ lệ sống5đạt§87 trong khi)trước đó theo Jordan vàcộng sự (1998) thì tỷ

lệ sống chỉ 50-55% bởi Jordan và cộng sự (1998) Chất lượng của hệ thống rễ

là rất quan trọng cho sự thích nghi với)môi trường [21], [31]

1.2.2 Nhân giống cây Oảihương thông qua sự phát sinh cơ quan

Sự phátasinh cơ quanlà con đường tái sinh phổ biến nhất trong

nhân giống in vitro.

Tsuro và cộng sự (1999)™ đã! quan sát ở loài L vera và thấy rằng

Cytokinin loại ure N-(chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea (CPPU) có thể tạo ranhiều chồi, trong khi đó Cytokinin và BAP tạo ra chồi)bình thường Môitrường hiệu quả nhất cho sự hình thành chồi là 0,4μMqCPPU nhưng kếMqCPPU nhưng kếtquả không hình thành rễ Việc nàysau đóCđược khắc phục bằng cách sửdụng hệ thống nuôi cấy mở và một quy trình tái sinh cây hiệu quả cho hệ

số nhân chồi gấp 7 lầnbình thường [56].ISau đóCcùng5một nhóm nghiên

cứu về hình thái và giải phẫu tinh dầu của loài L veraphenotypic biến thể

thu được khi có BAP, cho rằng không có cây con tái sinh nào sản sinh ranhiều tinh dầu như giống gốc [55]

tinh dầu nhiều-hơnso với cây bố mẹ, cho thấy rằng cây Oải)hươngđột biến

có thể có

ích cho việc tổng hợp monoterpene và sesquiterpene trong thực vật [22].

Ghiorghiţă5và cộng sự (2009) nghiên cứu hình thái của L angustifolia

mô cấy (chồi)đỉnh, lóng và lá) và quan sát thấy rằng5các đốt thân cấy trênmôi trường MS không bổ sung chất điều-hòa sinh trưởng, trên môitrường MS cơbản có bổ sung NAA và trên môi trường có bổ sungchất§điều hòa sinhtrưởng khác hình thành cây con mới [25] Dronne vàcộng sự (1999a) mô tả sự tái sinh chồi trong lavandin với kết quả tốt nhấtđạt được ở 4 môi trường khác nhau Mô sẹo3được hìnhthànhtrong môitrường MS có bổ sung 9μMqCPPU nhưng kếM BAP và 4,5μMqCPPU nhưng kếM NAA Sau 2 tuần nuôi cấy môsẹo3được chuyển vào môi trường MS bổ sung 18μMqCPPU nhưng kếMqBAP để tái sinhchồi,=sau-đó, để kéo dài chồi cấy vào môi trường MS có bổ sung 1μMqCPPU nhưng kếMgibberellic acid (GA) và rễ được tạo ra với môi trường MS bổ sung 1μMqCPPU nhưng kếMIBA [19] Dronne và cộng sự (1999b) so sánh giống Lavandin về khả năngtái tạo trong ống nghiệm và chuyển gen thấy rằng cả hai quá trình đềuphụ thuộc mạnh vào cây trồng Hiệu quả của việc hình thành chồi từ môsẹo là 67% - 99% phụ thuộc vào cây trồng và biểu hiện thoáng qua của E.Coli gen gusA (mã hóa enzyme β-glucuronidas) đã đạt được trong tất cả 5giống, hiệu quả của vi khuẩn Agrobacterium trung gian ổn định, thể hiệnqua việc sản xuất mô sẹo kanamycinresistant dao dộng từ 3- 89% [17]

Nebauer và cộng sự (2000) cho rằng chuyển gen dựa vào vi khuẩn

Agrobacterium cho hoa Oải)hươngtạo đột biến (L latifolia) bao gồm bước tiền

nuôi cấy trong 1]ngày cho cácalá ( trên môi trường tái sinh ) và thời gian cấyghép là 24 giờ,=sau đóCtái sinh bằng kanamycin [43].ICách này đã đạt đượchiệu quả 6r cũng5như biểu hiện gen chuyển trong tái sinh thực vật, mặc dùMishiba và cộng sự (2000) đã mô tả hình thức chuyểnđổi khác sử dụng mô sẹothay vì cấy lá hiệu quả hơn [40] Gần đây, Tsuro3 and Ikedo (2011)‡đã mô tảtác dụng của Agrobacterium rhizogenesstrains tự nhiên trên

1.3 Phương2pháp vi thủy canh

1.3.1 Sơ lược về phương pháp2vi thủy canh

Vi thủy canh (microponic) là một phương pháp7 sản xuất câygiống kết hợpA vi nhân giống- (micropropagation) và thủy canh(hydroponic).‡ Trong đó,C mô? thực vật" được cung cấp chất dinhdưỡng ởj quy mô nhỏ Phương pháp này bước đầu- đã thểFhiệnnhững5đặc tính ưu- việt+ và có thểF khắc phục nhiều nhược điểm

của9cácahệ thống vi nhân giống-in vitro truyền thống [27].

Thủy canh thường được định nghĩa1như là ―trồng cây trong3nước‖.TuyGnhiên, thật ra việc cung5cấp nước vàdung dịchdinh dưỡngchocâycóC thể trựctiếp qua tiếp7xúcgiữa rễ\vàdung dịchnhư định nghĩaởjtrênnhưng cũng có thể giántiếpqua-cácagiáathểFtrơ nênchúng5ta cóthểmởjrộng định nghĩa[thuỷ canh là ―trồng5cây không sử dụng đất‖ [36]

Thuật ngữ vi thủy canh (microponic)3 lần đầu tiên được mô tả& bởij Hahn và cs (1996) trên đối tượng cây hoa1cúc đểFxem liệu nó có thể đơn giản hóa1cácgiai đoạntăng trưởng5thựcvật,=ra rễ, thích nghi với môi trường vànhân giống5với kết quả- tốt hơn so với hệ thống in vitro thông5thường Kết

hệ+ thống- này,= cây có thể tăng trưởng5 nhanh1 hơn và khỏe mạnhhơn mà không cóCsự thoáiahóa, cũng5không đòi hỏi phải)tiếnhành

những bước nuôi) cấy phức tạp như trong nuôi cấy in vitro Ngoài ra,=nó

cònƒ tiết kiệm thời4 gian và công lao1động, vì các giai đoạn nuôi cấysơcấp,7nhân số lượng,=ra1 chồi và ra1rễ được tiếnhành liêntiếp [28]

Hệ thống này cũng được nghiên cứu- trên đối tượng là cây hoa cúc

(Chrysanthemum grandiflorum ‗Bongwhang‘) nhằm mục đích làm giảm một số khó khăn trong5nuôi cấy in vitro như hiệntượng thủy tinh thể, giúp

đơngiản hóa quá trình nuôi cấy

Trong các nghiên) cứu- trước đây của Nhut- và cộng sự (2005b)‘

hệ thống vi thủy canh (Hình 1.2) đã áp7dụng thành công trên các đốitượng cúc Trong nghiênXcứu- này,=hệ thống-vi)thủy canh được thựchiện với giá) thểfilm/nylon ống5và vật chứa1làcácahộp7nhựa1trònĐại'Đồng Tiến Các chồi cây cóthểtiền xử lý vớiAuxin[44]

Hình 1.2: Hệ thống vi thủy canh (microponic).

1.3.2 Ưuđiểm củaphương pháp2vi thủy canh

Vi) thủy canh lấy ý tưởng từ phương pháp thủy canh để ứng dụng5cho giai đoạncuối của quá-trình#nhângiống Đặc điểm của phương phápnày làđiều kiện nuôi cấyGkhông cầnQvô trùng, có thể khắc phục một sốthiệt§hại doLnhiễm nấm,=khuẩn Vì thế,có thể giảm đáng kể chi phí đầu

16nuôi cấyGcũng đơn giản hơn phương pháp quang5tự dưỡng[44].Do3điều kiện môi trường5của1hệ thống vi thủy canh làgầnQvớiđiềukiện tự nhiên nênviệc rènJluyệncây con ngoài vườn ươm thuận-lợi hơn

rất nhiều Trong hệ thống vi thuỷ canh, các chồi câyG in vitro được rèn

luyện dần trong5điều- kiện gần điều kiện tự nhiên, cụ thể là môi trườngkhông vô trùng,=độ thoáng khí cao, không5cóCđường Igiúp cho3cây cóthể tự quang5 hợp đểF lấyP nguồn carbon từ CO2, thay vì từ đường như

hệ thống vi nhân giống- truyền thống.I Vì vậy,= khi đến giai đoạn ra1vườn ươm,=cây hoàn toàn có thểthích ứng kịp thời4với môi trường mới

Phương pháp7này đơn giản hơn phương pháp nhân giống in vitro.

NóCcó thểrút ngắnbớt giai)đoạn trong quy trình nhângiống bằng việckết

hợp7giai đoạn ra rễ\với giai đoạn thuần dưỡng ex vitro thành giai đoạnra rễ

in vitro Do đó,Csẽ rút ngắn được thời)gian nhân giống, tiết kiệm được chi

phí sản xuấtPcũng như chi phí về điện năng,=tiền công nhânviênvà

các chi phí phát sinh khác [27]

Phương pháp7vi thủy canh không5sử dụng đường, agar đây là mộttrong các nguyên nhân chính làm gia tăng giá) thành sản& phẩm nênphươngpháp này sẽ làmgiảm bớt được chiphí sản xuất MặtKkhác, dokhông sử dụng5đườngtrong§quá trình nuôi?cấyPnên sẽ không5cầnvôtrùng vàgiảm được chiphíchoviệc hấp vô trùngMmôi)trường5vàcônglao3động cho việccấyGchuyền,-cũng như giảm đượctỷylệ nhiễm

1.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải1hương2lá xẻ

Lavandula dentata L trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Oải hương lá xẻ Lavandula dentata L trên thế giới

Trong những năm/gần đây, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất

mạnh mẽ, nuôi cấy mô tế bào thực vật§ đã! và đang trở thành một công cụ

hiệu quả của công nghệ sinh học [49] Kỹ thuật nuôi cấy in vitro được ứng

dụng rộng rãi trong việc nhân giống vô tính cây trồng, trong cải thiệngiống, bảo vệ nguồn gen, thu sinh khối, hoặc chất quý Với những thànhcông trong nhân giống các cây trồng khác nhau mà những5khó khăn trongviệc nhân giống các loài Oải)hương ngoài tự nhiêncũng đã khắc phục

được bằng phươngpháp nhân giống in vitro và được áp dụng từ sớm.

Vật liệu nuôi cấy khởi đầu thường5 được sử dụng là hạt, đỉnhchồi, đoạn thân hay lá Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiêncứu-đối với Lavandula nói chung và loài Lavandula dentata nói riêng.Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu tập trung đi sâu-vào một số lĩnhvực nhưchọn tạo giống, nhân giống, các biện pháp kỹ thuật và các biện pháp phòngtrừ sâu, bệnh hại, chiết suất tinh dầu…

Ngay từ năm 1989, Calvo và Segura đã tiến hành nuôi)cấyPmô loài L.

latifolia trênmôi trường MS + BAP 8,9 µM + IAA 0,6 µM.IKết quả đã&xuất hiện

15,4 chồi/mẫu có kích thước trung bình lớnhơn10 mm [11] Không dừng lại ở đó,Cvẫn là loài này đếnnăm 1996, Calvo cộng tácavớiSánchez-Gras nghiênXcứu-trênmôi?trường đó nhưng5giảm nồng5độ BAP 8,88 µM và IAA 0,57 µM thì thấy chiều cao3chồi)tăng5lên (16rmm)‡cònsố chồi giảm chỉ

còn 6,2 [52]

Cùng năm 1996, Nober đã công5 bố kết quả& nghiên cứu- trên

loài L stoechas với 5-6rchồi/mẫu cóCkích thước 15-20 mm trong môi trườngM + Ads [45].

Những thành công trước đó đã thôi thúcJordan vàcộng sự (1998)

tiến hành nuôi cấy L dentate bằng mô phân sinh, sử dụng chồi nách và không

bổ sung auxin Ông thấy rằng ở môi trường5cơbản 1/2 MS tỷ lệ chồi sống là100% [31] Đếnnăm 2005,‘Echeverrigaray vàcộng sự khi nghiên cứu nuôi

cấy Lavandula dentata L trên các loại)môi/trường5và đã!xác địnhđược tỷ lệ

chồi sống đạt 100% ở môi trường MS + NAA 2,5 μMqCPPU nhưng kếM; số chồi trung bình/mẫu và chiều cao chồi (mm) có số lượng tốt nhất là 18,60; 35,3 tại môitrường MS + BAP 2,2 μMqCPPU nhưng kếM + IBA [21]

Năm 1999, Andrade và cộng sự có bước tiến hơn trong

nghiênXcứu-ảnh hưởngcủa MS + TDZ(2,25 µM) tới loài L vera.IKếtquả&nhân nhanh đạt

được rất tốt với 10,78•chồi/mẫu,-chồi cao 20,7smm [9]

Tiến hành trên loài)khác đếnnăm 2002, Diasvànhóm nghiên cứu đã xác địnhđượcmôi trường5tối ưu-cho nhân nhanhL viridis là ½ MS + BAP 0,67 µMqcho số lượng 11,69 chồi/mẫu và cóCchiều-cao3chồi là 44,39 mm [15] Ngoài ra phải kể đến công trình của Zuzarte và cộng sự năm 2010,=nghiên cứu- quy trình nhân nhanh của1 loài L pedunculata đã! đi đến kết luận môi trườngMS + BAP 1,11 µM cho chồi tốt nhất§là 4,07schồi/mẫu, cókích thước

5 mm [62]

Machado và cộng sự (2011), trong nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng củacác chất điều-hòa sinh trưởng tới tái sinh chồi, đã đưa1ra kết luận trên môitrường chứa 0,5 μMqCPPU nhưng kếM BAP + 2,5 μMqCPPU nhưng kếM IBA + 0,3 μMqCPPU nhưng kếM GA3 chồi có chiều cao lớnnhất là 2,7 cm Số lượng lá nhiều nhất trên mỗi chồi (± 8) trên môi trường cóchứa 1,0 μMqCPPU nhưng kếM BAP + 2,5 μMqCPPU nhưng kếM IBA và tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (90‘)’trên môitrường có chứa 10,0 μMqCPPU nhưng kếM BAP + 2,5 μMqCPPU nhưng kếM IBA + 0,3 μMqCPPU nhưng kếM GA3 Kết quả nghiêncứu cho thấy, sự kết hợp các chất§điều-hòa sinh trưởng thực vật§thúcBđẩy

sự phát triển của chồi và GA3 làm cho chồi)dài hơn [35]

Từ các kết quả trên cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiêncứu về cây Oải hương5 Các kết quả này có ý nghĩa1quan trọng trong việcgiúp các nhà nghiên cứu và sản xuất cây Oải)hương5nước ta kế thừa kinhnghiệm, tiết kiệm được thời)gian và kinh phíWđể đem lại hiệu quả cao trongviệc nhân giống và trồng cây Oải hươngtrongđiều kiện Việt Nam

1.4.2 Tình hình nghiên cứu cây Oải hương lá

Hiện nay mới chỉ có nghiên cứu nhân giống in vitro một số loài

Lavandula angustifolia của nhóm Đỗ Tiến Vinh, Mai Thị PhươngHoa, Lê

Bảo Ngọc (2016) sử dụng5 môi trường MS có bổ sung BAP (0,1 mg/l) vàIAA (0,5 mg/l), [2] Trong5đó chưa1thấy có các công trình nghiên cứu về

Lavandula dentata Các kết quả nghiên cứu-cònchưa nhiều, chưa hoàn

thiện vàchưa1đáp ứng5được nhu cầu ngày càng phong phú của con người.

Ngoài ra, đối với việc sản xuất cây Oải hương nước ta cũng5cònnhiều hạn chế, phần đa làtrồng ở ĐàNẵng và một số vườn nhỏ rải rác ở cácnơi Nguyên nhân một phần điều kiện khí hậu không hợp, nguồn cung cấp giốngchưa1nhiều Chủ yếu trồng bằng hạt hayGgiâm cành nhưng5hiệu quả đạtđược không cao, ngoài ra còn nhập ngoại nhưng giá thànhlại khá cao [60], [63]

Do3 đó, việc triển khai xây dựng quy trình nghiên cứu Lavandula

dentata L là rất cần thiết vừa để đáp ứng nhu cầu thị trường sử dụng cây

Oải)hương5để lấy tinh dầu, vừa bổ sung thêm tài liệu nuôi cấy mô cây Oảihương ở Việt Nam

Chương22: ĐỐI TƯỢNG VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối1tượng nghiên cứu

Đối)tượng nghiên cứu là cây Oải)hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) Vật liệu nghiên cứu là đốt thân cây Oải) hương lá xẻ (Lavandula dentata) trưởng5thànhđược lấy từ vườncây ươm giống ở ĐàLạt.

2.2 Thời1gian và điạ điểm nghiên cứu

2.3.2 Dụng cụ

Dao cấy, khayG cấy, kéo,= túi nilon, bình tam giác, đènJ cồn,bình xịt cồn,vỉ xốp nuôi-cấy,…

2.4 Môi trường nuôi cấy

- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng5 môi trường dinh

dưỡng5 cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) gồm các chất khoảng đalượng, vi lượng, vitamin bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar

- Các chất§ điều- hòaƒ sinh trưởng thực vật: Kinetin (KI), 6-Benzylamino purine (BAP), α-Napththalen acetic acid (α-NAA), IAA (Indol-3-axitaxetic) (Dulchefa, Hà Lan)

- pH môi trường: 5,8