Nghiên cứu xác định mã vạch ADN cho loài dó quả nhăn aquilaria rugosa kiet kessler ở việt nam

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chuyên đề này, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Hà Văn Huân, Th.S Nguyễn Thị Thơ tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn TS Khuất Thị Hải Ninh Bộ môn Chọn tạo giống cố vấn học tập tận tình giúp đỡ để em hồn thành tốt khóa học Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy, cô anh chị làm việc công tác Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập Khóa luận đƣợc hỗ trợ kinh phí đề tài Nghị Định thƣ với Đức “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất trầm hƣơng theo hƣớng bền vững Việt Nam” Em xin chân thành cảm ơn Cuối tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ln động viên tinh thần để tơi hồn thành báo cáo Hà nội, tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Ngọc Công i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Dó nhăn 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Dó nhăn 1.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng Dó nhăn 1.1.3 Giá trị kinh tế sinh thái dó nhăn 1.1.4 Thực trạng trồng khai thác dó nhăn nƣớc giới 1.1.5 Các nhân tố ảnh hƣởng tới khả tạo trầm nhân tạo .11 1.2 Tổng quan ADN barcode (ADN mã vạch) 12 1.2.1 Các đặc điểm trình tự barcode 14 1.2.2 Một số locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp ADN barcode thực vật 16 1.2.3 Ứng dụng ADN mã vạch 20 1.2.4 Ứng dụng ADN mã vạch nhằm nhận biết dƣợc liệu 22 1.2.5 Tình hình nghiên cứu ADN barcode thực vật 23 1.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN Dó nhăn (A rugosa) 24 PHẦN 2: MỤC TIÊU, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27 2.2 Nội dung nghiên cứu tách chiết 27 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 27 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.5.1 Tách chiết ADN tổng số 28 ii 2.5.2 Kỹ thuật PCR 29 2.5.3 Tinh sản phẩm PCR 30 2.5.4 Giải trình tự gen 31 2.5.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 32 3.2 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 33 3.2.1 Kết nhân gen matK 33 3.2.2 Kết nhân gen rbcL 33 3.2.3 Kết nhân gen trnH-psbA 34 3.3 Phân tích kết 35 3.3.2 Kết so sánh đoạn gene rcbL 37 3.3.3 Kết so sánh trình tự trnH-psbA 38 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại 40 PHẦN IV KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Tồn 41 4.3 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid RAPD RADNom Amplyfied Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate STS Sequence-Tagged Site TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taqpolymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid v/p vòng/phút NCBI National Centre for Biotechnology Information iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Mẫu kí hiệu mẫu nghiên cứu 27 Bảng 2.2: Trình tự thơng tin cặp mồi 29 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 30 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1: Dó nhăn (A rugosa) Hình Quả hạt Dó nhăn Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dó nhăn: SP01 SP02 32 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR gen matK 33 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR gen rcbL 34 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR gen trnH-psbA 35 Hình 3.5 Cây phân loại dựa đoạn gen rbcl xây dựng bằng trang web https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle 40 v ĐẶT VẤN ĐỀ Các lồi dó có khả sinh trầm thân thƣờng đƣợc gọi Dó trầm Trầm hƣơng, số địa phƣơng cịn gọi Tóc Tên thƣơng mại gọi Agarwood Agarwood oil Hiện nƣớc ta phát có lồi dó có khả sinh trầm, gồm: Dó bầu (Aquilaria crassna), Dó gạch (Aquilaria bailloni), Dó bà nà (Aquilaria banaensis), thổ trầm hƣơng (Aquilaria sinensis), dó nhỏ (Aquilaria yunnanensis) Dó nhăn (Aquilaria rugosa) Trong lồi dó xác định Dó bầu Dó nhăn có suất trầm tinh dầu trầm cao Vì thế, phần lớn diện tích rừng trồng thống kê đƣợc phạm vi nƣớc chủ yếu lồi Dó bầu, số diện tích trồng lồi Dó nhăn Kon Tum, Hịa Bình, Bắc Giang Quảng Ninh Tuy nhiên, vấn đề tác động tạo trầm nhƣ nào, thị trƣờng tiêu thụ sản phẩm từ Dó bầu nói riêng Dó trầm nói chung nhƣ câu hỏi lớn Để góp phần làm sở định hƣớng phát triển bền vững loài thời gian tới, việc đánh giá thực trạng tình hình phát triển Dó trầm, Trầm hƣơng tinh dầu Trầm hƣơng nƣớc ta cần thiết Trong công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu nay, phƣơng pháp đƣợc áp dụng chủ yếu dựa phân tích hình thái mẫu vật Tuy nhiên, phƣơng pháp cịn gặp nhiều hạn chế nhiều trƣờng hợp: mẫu vật chƣa phát triển tồn diện hình thái bị hƣ hỏng phận, chí chết, hay lồi dƣợc liệu qua chế biến, khiến q trình nhận diện khó khăn Mặt khác, nhầm lẫn lồi gần giống hình thái gần tƣơng đƣơng gây cản trở q trình phân tích, khó khăn nghiên cứu nhân giống nhƣ ảnh hƣởng đến sản xuất.Hiện công cụ đƣợc nhà phân loại học phân tử sử dụng giúp định danh lồi xác, nhanh chóng bằng cách sử dụng vùng ADN đặc trƣng hay gọi chỉ thị ADN nhƣ mã vạch để nhận biết mẫu sinh học kể chúng đƣợc sơ chế bảo quản lâu dài Đó phƣơng pháp ADN mã vạch Ngồi ra, mã vạch ADN cịn giúp q trình phân tích tiến hóa sinh học loài tự nhiên nhƣ đánh giá nhanh đa dạng di truyền loài Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành chuyên đề nghiên cứu khoa học: "Nghiên cứu xác định mã vạch ADN cho lồi Dó nhăn (Aquilaria rugosa L.C.Kiet & PJ.A.Kessler ) Việt Nam" nhằm góp phần cung cấp thông tin sở liệu cho việc định danh lồi Dó trầm cấp độ phân tử PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Dó nhăn 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Dó nhăn Cây Dó nhăn (A rugosa) lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều tỉnh miền Trung Cây dó bầu có nhiều tên gọi tùy theo địa phƣơng nhƣ: Trầm Hƣơng, Dó Bầu, Dó nhăn, Dó Bầu Hƣơng, Tóc [43] Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, Thymelaeales, lớp gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42] Hình 1: Dó nhăn (A rugosa) Chi Trầm Aquilaria gồm 24 lồi khác nhau, nhiên chỉ có 15 lồi có khả cho trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis A chinesis; A borneensis; A.Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata; A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa; A grADNiflora; A bancana; A rugosa Trong lồi A rugosa đƣợc TS Lê Công Kiệt TS Paul Kessler ngƣời Hà Lan phát năm 2005 [17] Trên giới, chi trầm phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á miền Nam Trung Quốc Ở nƣớc ta, dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc [42] Trong số lồi có khả tạo trầm Aquilaria crassna lồi tiếng có khả tạo loại trầm kỳ tốt giới [9] 1.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng Dó nhăn Dó nhăn loại gỗ thƣờng xanh, cao 20 - 30 m, đƣờng kính thân đạt 60 - 80 cm, thân thƣờng thẳng, đơi có rãnh dạng lịng máng, vỏ ngồi nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc tƣớc ngƣợc từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lơng nhẵn, tán thƣa Lá đơn, mọc cách (so le), cuống dài - mm, phiến hình trứng, bầu dục thn đến mác thn, kích thƣớc - 15 x 2,5 - cm, mặt màu lục bóng, mặt dƣới nhạt có lơng mịn, gốc thon nhọn dần hay tù; chóp nhọn, thn nhọn, tận có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thƣờng, rõ mặt dƣới Cụm hoa hình tán chùm tán, mọc nách đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài - cm Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp phần dƣới, hình chng, màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám, phía ngồi có lơng thƣa; mặt gần nhƣ nhẵn, có 10 đƣờng gân rõ, tồn quả, thùy dài hình trứng thn, dài 12 - 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật Quả nang ngắn, gần trịn, có rãnh, kích thƣớc 2,5 - cm, có lơng mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khơ nứt làm mảnh, thƣờng chỉ có hạt Mùa hoa vào tháng - 8, chín vào tháng - 10 [4], [42] Dó nhăn sinh trƣởng rải rác rừng thƣờng xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh thứ sinh, sƣờn núi đất bằng độ cao 50 - 1.000 m có lên tới 1.200 m so với mặt biển Ở nƣớc ta, dó bầu thƣờng phân bố rải rác sƣờn núi có độ dốc nhỏ, nƣớc Trong quần xã dó bầu thƣờng gặp gỗ lớn: Táu, Huỳnh , Gụ mật … Đơi gặp dó bầu mọc rừng thứ sinh loài Thánh thất, Mị lƣng bạc, Bƣởi bung, Mít nài Ràng ràng Dó nhăn ƣa đất feralit điển hình, feralit núi phong hóa từ đá kết, đá phiến hay đá granit Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, ẩm, chua gần trung tính (pH vào khoảng từ – 6) Tại Malaysia vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (A malaccensis) phân bố rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể hecta Ở Đơng Bắc Ấn Độ, lồi dó bầu thƣờng mọc rải rác độ cao từ 200 - 700 m, đơi lên tới 1.000 m Dó bầu sinh trƣởng khu vực có lƣợng mƣa hàng năm thay đổi từ 1.500 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28oC Những kết quan sát vùng Đơng Bắc Ấn Độ cịn cho biết, loài phân bố chủ yếu rừng ẩm thƣờng xanh rừng thƣờng xanh, gặp rừng nửa rụng Tuy nhiên, thực tế, dó bầu trƣớc sau tái tạo trầm sinh trƣởng tốt nơi có độ cao dƣới 40 m so với mực nƣớc biển A malaccensis thích ứng với loại đất phong hóa nham thạch, loại đá biến tính, nhƣng sinh trƣởng tốt đất phong hóa từ sa thạch [42] Tại Malaysia, từ lâu đƣa dó bầu vào trồng trọt, quần thể rừng trầm A malaccensis 67 năm tuổi có chiều cao trung bình 27 m, đƣờng kính thân trung bình 38 cm Những dó bầu có độ trƣởng thành 80 năm tuổi miền Đơng Bắc Ấn Độ, có chiều cao 25 - 30 m, thân to có đƣờng kính 55 - 70 cm Ở miền Tây Bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh), quần thể trầm năm tuổi có chiều cao gần m, đƣờng kính thân gần 30 cm Cũng Tây Bắc Ấn Độ, chúng thƣờng bắt đầu hoa, kết thời kỳ đạt - năm tuổi Những cá thể có kích thƣớc trung bình cho suất hạt tốt, 1,5 kg hạt [42] Các khối trầm thƣờng đƣợc tạo thành thân cành lớn, chúng kết trình chuyển hố hoạt động bệnh lý nơi bị bệnh, bị thƣơng… Nấm thành phần có tác dụng hoạt động đó, ngồi trùng đục thân có mối liên hệ Có giả thuyết cho rằng, trƣớc tiên bị nấm gây bệnh chỗ bị thƣơng làm PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số Tách chiết ADN bƣớc bƣớc khởi đầu quan trọng, định thành cơng cho phản ứng PCR sau Để tách chiết ADN đạt hiệu suất độ tinh việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu quan trọng Quy trình tách chiết ADN đƣợc thực theo hóa chất từ Kit "DNA mini kit Qiagen" Đức Với phƣơng pháp này, ADN đƣợc tách chiết dễ dàng, nhanh chóng với độ tinh cao Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dó nhăn: SP01 SP02 Kết điện di cho thấy băng vạch ADN sáng, rõ nét, khơng bị đứt gãy, khơng có băng phụ, chứng tỏ ADN tách có chất lƣợng tốt, nồng độ cao độ tinh tốt 32 3.2 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 3.2.1 Kết nhân gen matK ADN tổng số dƣợc tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen matK lục lạp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi có tên : mP1F - mP1R (trình tự mồi bảng 2.2) Kết thu đƣợc nhƣ sau: gen đƣợc khuyếch đại tốt mẫu Trầm, tất băng sáng rõ, kích thƣớc 450bp, phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen matK Kết điện di (Hình 3.2) cho thấy băng vạch rõ nét, không xuất băng phụ Kết sử dụng cho bƣớc M Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR gen matK 3.2.2 Kết nhân gen rbcL rbcL trình tự gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều loài thực vật Ở loài khác kích thƣớc gen khác nhau, gen rbcL có kích thƣớc khoảng 750 bp Mồi sử dụng: rP1F - rP1R (trình tự mồi 33 bảng 2.2) Kết kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL gel agarose 1% (hình 3.3) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt tất mẫu nghiên cứu, băng thu đƣợc sáng rõ chỉ có băng vạch với kích thƣớc 550bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 1kb) M Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR gen rcbL 3.2.3 Kết nhân gen trnH-psbA Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp theo lý thuyết, nhƣng thay đổi từ 296 đến 1120 bp trnH-psbA có khả xác định lồi cao Kết cho thấy với mẫu nghiên cứu gen psbA-trnH có kích thƣớc vào khoảng 450 bp, khơng có băng phụ Đây kết tốt có thê tiến hành bƣớc nghiên cứu 34 M Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR gen trnH-psbA Chú thích : M : marker 1000bp; 1: SP01; 2: SP02 3.3 Phân tích kết Kết tinh ADN đƣợc gửi giải trình tự malaysia Sau nhận đƣợc trình tự xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit đối chiếu với thông tin ngân hàng GenBank, so sánh bằng MUSCLE, thấy độ tƣơng đồng mẫu nghiên cứu với lồi Aquilaria cao (99-100%), từ tơi chọn lồi có độ tƣơng đồng cao Aquilaria crassna KU244215.1, Aquilatia yunnanensis KU244235.1 35 Kết so sánh đoạn gene MatK SP01 SP02 crassna GAAATCTTGGTTCAAGCCTTTCGCTGCTGGTTAAAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTA GAAATCTTGGTTCAAGCCTTTCGCTGCTGGTTAAAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTA GAAATCTTGGTTCAAGCCTTTCGCTGCTGGTTAAAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTA ************************************************************ SP01 SP02 crassna CGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATT CGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATT CGGTTTTTTTTCTACGAGTATTTGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATT ************************************************************ SP01 SP02 crassna TCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAG TCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAG TCTATTTTGAATTTGAATCCAAGATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAG ************************************************************ SP01 SP02 crassna TGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCT TGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCT TGCGAATTCATTTTCCTTTTTCTCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCT ************************************************************ SP01 SP02 crassna GCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTCTTT GCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTCTTT GCAATCTTTCTTGAACGGATCTATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTCTTT ************************************************************ SP01 SP02 crassna TCTAATGATTTTCAGAACAACCTATGCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGA TCTAATGATTTTCAGAACAACCTATGCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGA TCTAATGATTTTCAGAACAACCTATGCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGA ************************************************************ SP01 SP02 crassna TATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATACGCCTCTTCTGATGAATAAGTGGAAA TATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATACGCCTCTTCTGATGAATAAGTGGAAA TATCAAGGAAAATCTATTCTTGCTTCAAACGATACGCCTCTTCTGATGAATAAGTGGAAA ************************************************************ SP01 SP02 crassna TATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTC TATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTC TATTACTTTATCAATTTATGGCAATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTC ************************************************************ SP01 SP02 crassna CGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGA CGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGA CGTATAAACCAATTATGCAAATATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGA ************************************************************ SP01 SP02 crassna TTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACT TTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACT TTAAATCCTTCAGTGGTACGCAGTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACT ************************************************************ SP01 SP02 crassna ATTAAAAAGCTAGATACAAAAATTCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCG ATTAAAAAGCTAGATACAAAAATTCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCG ATTAAAAAGCTAGATACAAAAATTCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCG ************************************************************ SP01 SP02 AATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGAT AATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGAT 36 crassna AATTTTTGTAACGCATCGTGTCATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGAT ************************************************************ SP01 SP02 crassna TCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGA TCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGA TCTGATATTATCGACCGATTTTTGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGA ************************************************************ SP01 SP02 crassna TCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAA TCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAA TCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGTATCGAATAAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTCTTAAA ************************************************************ SP01 SP02 crassna ACTTTGGCTCGTAAACAC ACTTTGGCTCGTAAACAC ACTTTGGCTCGTAAACAC ****************** Đoạn gen có trình tự 900bp phù hợp để so sánh trình tự mẫu nghiên cứu với lồi A.crassna Ngân hàng gen cho kết có độ tƣơng đồng 100% Điều cho thấy hệ lục lạp chi Dó bầu có tính bảo thủ cao cá thể hệ gen có biến động cá thể thuộc loài gần 3.3.2 Kết so sánh đoạn gene rcbL SP01 SP02 yunanensis yunanensis ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAGGCTGGTGTTAAAGAGTA ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAGGCTGGTGTTAAAGAGTA ****** ** ******************************** ***************** SP01 SP02 yunanensis yunanensis TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA ************************************************************ 37 SP01 SP02 yunanensis yunanensis TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT ************************************************************ SP01 SP02 yunanensis yunanensis ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTAC ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTAC ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTACT ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTAC****************************************** ****** * ** **** Đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 609bp phù hợp để so sánh trình tự mẫu nghiên cứu với lồi A yunanensis ngân hàng gen kết phân tích trình tự thấy có sai khác trình tự mẫu SP01, SP02 nghiên cứu (mức độ tƣơng đồng 99%) Những sai khác mẫu nghiên cứu với lồi đối chứng NCBI Bên cạnh sai khác vị trí 7, 10, 42, 583, 590, 594, 596, 601, 602 có ý nghĩa q trình phân loại lồi 3.3.3 Kết so sánh trình tự trnH-psbA yunanensis yunanensis SP01 SP02 GGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCAC GGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCAC CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCAC CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTAATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCAC *********************************************************** yunanensis yunanensis SP01 SP02 TTTTATGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAAC TTTTATGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAAC TTTTATGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAAC TTTTATGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGAAC ************************************************************ yunanensis TTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGAC 38 yunanensis SP01 SP02 TTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGAC TTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGAC TTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAGAC ************************************************************ yunnanensis yunnanensis SP01 SP02 CACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGA CACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGA CACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGA CACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGA ******************************** yunanensis yunanensis SP01 SP02 GTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAA GTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAA GTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAA GTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGTAAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAA ***************************************************** yunanensis yunanensis SP01 SP02 GGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACT GGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACT GGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACT GGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAACAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACT ************************************************************ yunnanensis yunnanensis SP01 SP02 TTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGA TTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGA TTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGA TTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACACTAAGACAAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGA ************************************************************ yunnanensis yunnanensis SP01 SP02 GCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC GCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC GCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC GCTTCAATAGCAGCTAGGTCTAGGGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC ******************************************************** Trình tự đoạn gen phân tích đƣợc có kích thƣớc 441 bp phù hợp có sai khác mẫu Trầm nghiên cứu mẫu có Ngân hàng gen 1nucleotid Tại vị trí SP01 SP02 có sai khác so với lồi A yunnanensis (Điều cho thấy hệ gen lục lạp chi Dó bầu có tính bảo thủ cao cá thể khu vực cách xa mặt địa lý (Kontum, Malaysia) Hơn nữa, theo chất hệ gen lục lạp hệ gen có biến động cá thể thuộc loài gần 39 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại Dựa kết phân tích đoạn gene rbcl kết luận sơ trên,em xây dựng quan hệ mẫu nghiên cứu loài Aquilaria ngân hàng gen NCBI Aquilatia Crassna KU244215.1, Aquilatia sinensis KY927263.1, Aquilaria hirta KU244217.1, Aquilaria yunnanensis KU244235.1), Hình 3.5 Cây phân loại dựa đoạn gen rbcl xây dựng bằng trang web https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle Kết Hình 3.5 cho thấy mẫu Dó nhăn SP01 SP02 có mức độ tƣơng đồng di truyền cao với loài A.sinensis (KY927263.1) ngân hàng gen 40 PHẦN IV KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tách chiết tinh đƣợc ADN tổng số mẫu Dó nhăn thu Kontum - Đã nhân thành công đoạn gen matK, trnH-psbA, rbcL bằng phƣơng pháp PCR - Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, trnH-psbA, rbcL mẫu nghiên cứu - Dựa vào kết luận sơ tìm đƣợc điểm sai khác mẫu SP01 SP02 so với loài Aquilaria ngân hàng gen 4.2 Tồn Do thời gian kinh phí có hạn nên chúng tơi chƣa có điều kiện làm lặp lại nhiều lần với gen nghiên cứu nhƣ số lƣợng gen nghiên cứu chƣa nhiều 4.3 Kiến nghị - Với gen nghiên cứu trên, tiếp tục lặp lại trình nhân gen đọc trình tự để có đƣợc trình tự xác dùng công bố Ngân hàng gen giới - Nghiên cứu tiếp chuỗi ADN lục lạp khác, kết hợp với số gen nhân để có kết luận đầy đủ mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu phân loại, định danh loài rugosa Việt Nam 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu xác định phƣơng pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang Bùi Cơng Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu chất tạo trầm nhân tạo dó bầu Aquilaria crassna Việt Nam, Nha Trang Đặng Ngọc Châu, Lƣu Văn Phƣợng, Trần Nhiều, Bùi Công Khánh, Nguyễn Văn Tuấn (2002), Nghiên cứu xác định phương pháp tạo trầm tác nhân vi sinh dó bầu Aquilaria crassna, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trƣờng, NXB Nông nghiệp Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, Báo cáo kết ánh giá sơ tiềm sản xuất bột giấy dó bầu, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Cơng nghiệp giấy Cenlulose Hồng Cảnh (2006), Trầm hương loại tạo trầm hương, lợi ích, thách thức triển vọng Hội trầm hƣơng Việt Nam Hoàng Đăng Hiếu (2012), Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định dạng tập đồn Dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh, Luận Văn Thạc sỹ Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử , Nhà xuất Đại học Huế, Huế Thái Thành Lƣợm (2000), Bảo vệ nguồn gen khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trầm hƣơng, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518 42 10 Trung tâm nghiên cứu Tài ngun Mơi trƣờng ĐHQGHN, Danh lục lồi thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng anh 11.Anton L (2007), Investigation of seed longevity DNA viability DNA cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine DNA Tropical Biology James Cook University, Cairns 12.Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M (2000),Heart of the matter: agarwood use DNA trade DNA CITES implementation for Aquilaria malaccensis 13.Borsch T., Hilu K.W., QuDNAt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms, J Evol Biol, (6), pp 558-576 14.Hakrabarty K., Kumar A., Menon V (1994) Trade in Agarwood TRAFFICIndia Publications, New Delhi, published by Avenash Dutta 15.Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., DNA Vincent S (2005), LDNA plants DNA DNA barcodes: short-term DNA long-term goals, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 16.CITES (2004), Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties Amendments to Appendices I DNA II of CITES Bangkok, ThailDNA, 3-14 October 2004 unpublished 17 Kiet L., Kessler PJA DNA Eurlings M (2005), A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam, Blumea, (50), pp 135-141 18.Kress W J., Erickson D L (2008), DNA barcodes: Genes, genomics, DNA bioinformatics, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 19.Lichao Jiao, Yafang Yin, Yeming Cheng DNA Xiaomei Jiang (2013),DNA barcoding for identification of the endangered species Aquilaria sinensis: 43 comparison of data from heated or aged wood samples Holzforschung; aop.DOI 10.1515/hf-2013- 0129 20.M Ishihara, T Tsuneya, & K Uneyama, (1993), Fragrant sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry 33: 1147-1155 21.M.C.M Eurlings DNA B Gravendeel (2005), TrnL-trnF sequence data imply paraphyly of Aquilaria DNA Gyrinops (Thymelaeaceae) DNA provide new perspectives for agarwood identification Plant Systematics DNA Evolution DOI 10.1007/s00606-005- 0312-x 22.Michiho I., Ken I O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S (2005) ,Induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture, Journal of Essential Oil Research, 17(2), pp 175-180 23.Nurita T M., Dewi R., Anidah (2009), Genetic variations among aquilaria species DNA gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers, Biotropia,Vol 16 (No.2), pp 88 - 95 24.Ole S DNA Gitte P (2009), How many loci does it take to DNA barcode a crocus?, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 25.Phialophora parasitica Crous, P W et al (1996), Phaeoacremonium gen nov associated with wilt DNA decline diseases of woody hosts DNA human infections Mycologia 88(5): pp 786–796 26.Qi S H., He M L., Lin D L., Zhang C H., Hu L J., DNA Zhang H Z (2005).Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of Aquilaria sinensis Biomedical DNA Life Science , 83(2), pp.217-221 27.Savolainen V., DNA Chase M W (2003), A decade of progress in plant molecular phylogenetics, Trends Genet, (19), pp 717-724 28.Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007), Comparison of whole 44 chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms, The tortoise DNA the hare III Amer J Bot, (94), pp 275288 29 Shiou Y L., Jean W., Rozi M (2011), Genetic variation DNA molecular authentication of slected Aquilaria species from natural population in Malaysia using RAPD DNA SCAR markers, Asian journal of Plant Sciences, 10(3), pp 204 210 30 Steinke, D., T S Zemlak, J A Boutillier & P D N Hebert 2009 , DNA barcoding of pacific Canada’s fishes Marine Biology, 156: 2641-2647 31.Storchova H., M S Olson (2007), The architecture of the chloroplast psbAtrnH non coding region in angiosperms, Plant systematic DNA evolution Biomedical DNA life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 32.Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., DNA Eske W (2007), Power DNA limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 33.Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 34.Vijayan K DNA Tsou C H (2010), DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 35.Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010), DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots, BMC Plant Biology (10), pp.205 36.Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), Combining bioinformatics DNA phylogenetics to identify large sets of single-copy 45 orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary DNA systematic studies: A test case in the euasterid plant clade, Genetics (174), pp 1407-1420 37.Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants DNA animals, PLoS ONE (5), pp.13102 38 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L DNA Hui Y (18 December, 2010), Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu Internet 39.TRPAgarwood ProjectinformationADN conference http://wwwtherainforestproject.net – 2007 40.http://www.vncreatures.net/chitiet.php?page=1&loai=2&ID=3017 41.http://nonglamdong.com/dobau.htm 42.http://www.ioop.org.vn/vn/NCTK/Thanh-Tuu-Cua-Vien/Ban-Tin-Khoa-HocCon Nghe/Cay-Do-Bau/ 43.http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/ky-thuat-trong-cay-do-bau-tao-tram huong 44.http://www.tramhuongvietnam.com 45.http://www.barcoding.si.eu) 46.http://www.tramhuongvietnam.com/thongtinbaochip1.php 46 ... di truyền loài Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành chuyên đề nghiên cứu khoa học: "Nghiên cứu xác định mã vạch ADN cho lồi Dó nhăn (Aquilaria rugosa L.C .Kiet & PJ.A .Kessler ) Việt Nam" nhằm... crassna), Dó gạch (Aquilaria bailloni), Dó bà nà (Aquilaria banaensis), thổ trầm hƣơng (Aquilaria sinensis), dó nhỏ (Aquilaria yunnanensis) Dó nhăn (Aquilaria rugosa) Trong lồi dó xác định Dó bầu Dó nhăn. .. khoa học có nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài thực vật, mở triển vọng cho cho công tác đánh giá, phân loại bảo tồn đa dạng sinh học 1.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN Dó nhăn (A rugosa)