Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho loài dây thìa canh gymnema sylvestre retz ở việt nam phục vụ giám định loài

LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khóa luận xin chân thành cám ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam giúp đỡ bảo tận tình suốt q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô công tác Bộ môn Gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp Tơi xin tỏ lịng biết ơn PGS.TS Nguyễn Văn Việt ThS Nguyễn Thị Huyền tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình thực khóa luận với kỹ kiến thức quý báu Cám ơn tất thầy cô giáo cán Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam giảng dạy truyền đạt với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy không giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản quý báu theo giúp sau Cuối xin bày tỏ lời cám ơn tới gia đình bạn bè cổ vũ tinh thần để hồn thành báo cáo Trong q trình hồn thành khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Do vậy, tơi mong nhận đƣợc góp ý thầy bạn bè để kiến thức hồn thành Tôi xin chân thành cám ơn Hà Nội, ngày 24 tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị An MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Cây Dây thìa canh 1.1.2 Sự phân bố đặc điểm sinh học lồi Dây thìa canh 1.1.3 Giá trị sử dụng Dây thìa canh 1.2 Tổng quan ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch 1.2.2 Một số mã vạch ADN thƣờng đƣợc sử dụng 1.2.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN thực vật 14 CHƢƠNG MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.2 Hóa chất, Dụng cụ sử dụng 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phƣơng pháp tách ADN tổng số 20 2.4.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 20 2.4.3 Phƣơng pháp nhân gen đích kĩ thuật PCR 21 2.4.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 24 3.2 Kết PCR đoạn mã vạch ADN 25 3.2.1 Kết nhân gen psbA-trnH kĩ thuật PCR 25 3.2.2 Kết nhân gen trnL kĩ thuật PCR 26 3.2.3 Kết nhân gen ITS1 kĩ thuật PCR 26 3.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN với đoạn mồi khác 28 3.3.1 Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gen psbA-trnH 29 3.3.2 Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gen trnL 30 3.3.3 Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gen ITS1 30 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại 32 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP BME Bp BOLD CBOL CITES cpDNA CTAB 10 DNA dNTP 11 EDTA 12 13 14 15 IGS Kb mtDNA NAD(P)H 16 NCBI 17 18 19 20 21 22 ORF PCR RNA rRNA SDS TAE Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna Flora Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide Axit deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate Ethylenediamine tetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic intergenic Vùng liên kết gen Kilobase (1000 base) 1000 cặp base Mitochondrial DNA DNA ty thể Nicontinamide adenine Trung tâm Quốc gia Thông dinucleotide phosphate tin Công nghệ sinh học National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ Information sinh học Hoa Kỳ Open Reading Frame khung đọc mở Polymerase Chain Reaction phản ứng chuỗi polymerase Ribonucleic acid Axit ribonucleic Ribosomal RNA ARN ribosome Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate Tris – Acetic acide – EDTA Tris – Acetic acide – EDTA 23 24 tRNA UV Transfer RNA Untraviolet TT Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt Adenosin triphosphat ß-mereaptoethanol Base pair Barcode of Life Data Systems Consortium for the Barcode of Life Adenosin triphosphat ß-mereaptoethanol Cặp base Cơ sở liệu mã vạch ADN Consortium for the Barcode of Life Công ƣớc bn bán quốc tế lồi nguy cấp ARN vận chuyển Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG ảng 2.1: Trình tự thơng tin cặp mồi đặc hiệu 19 ảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 21 ảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P10 22 ảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P11 22 ảng 2.5 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P12 22 Bảng 3.1 Đánh giá ba vùng ADN đề xuất 28 Bảng 3.2 Hệ số khác biệt di truyền đoạn psbA-trnH 32 Bảng 3.3 Hệ số khác biệt di truyền đoạn ITS1 33 Bảng 3.4 Hệ số khác biệt di truyền đoạn trnL 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Dây thìa Canh (Nguồn ảnh: Caythuoc.org) Hình 1.2 Tác dụng dây thìa canh (Nguồn ảnh: Caythuoc.org) Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dây thìa canh 24 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Dây thìa canh thu đƣợc dùng mồi P10 25 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Dây thìa canh thu đƣợc dùng mồi P11 26 Hình 3.4 Kết nhân đoạn gen ITS1 từ mẫu Dây thìa canh dùng mồi P12 27 Hình 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng psbA-trnH 29 Hình 3.6 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng trnL 30 Hình 3.7 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng ITS1 31 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự đoạn psbA-trnH 32 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự đoạn ITS1 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên đa dạng phong phú với nhiều lồi động vật, thực vật nấm có giá trị kinh tế cao Trong đó, giới thực vật có tính đa dạng cao lồi Đến có 350.000 loài thực vật đƣợc định dạng Trƣớc đây, phƣơng pháp định danh phân loại thực vật chủ yếu dựa vào hình thái sinh học Tuy nhiên việc dựa vào hình thái để phân loại gặp nhiều khó khăn nhƣ: Các giai đoạn phát triển thực vật khác nhau, thu mẫu rời rạc hay mẫu vật khơng ngun vẹn dẫn đến khó khăn định công tác phân loại đặc biệt tốn mặt thời gian nhƣ công sức, kinh tế Gần việc ứng dụng gen mã vạch xác định đoạn ADN mã vạch phƣơng pháp định danh, sử dụng đoạn ADN chuẩn ngắn nằm genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phƣơng pháp xác định đoạn ADN mã vạch đƣợc áp dụng phổ biến cho lồi thực vật có giá trị cao Việt Nam quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc trƣng nóng ẩm mƣa nhiều, có số lƣợng đa dạng loại thuốc Trong đó, Dây thìa canh thuốc có giá trị kinh tế cao, dây thìa canh đƣợc dùng y dƣợc có tác dụng giảm cholesterol, hạ lipid, hạ đƣờng huyết máu; phòng chống xơ vữa động mạch tai biến nguy hại tiểu đƣờng gây [5] Tuy nhiên, với nhu cầu sử dụng dƣợc liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày cao việc định danh xác định nguồn gốc dƣợc liệu ngày cấp thiết, đặc biệt loài dƣợc liệu quý, có giá trị sử dụng lớn nhƣ Dây thìa canh Do đó, tơi thực đề tài: Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho lồi Dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz) Việt Nam phục vụ giám định loài CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Cây Dây thìa canh Giới thiệu Dây thìa canh Tên khoa học Gymnema sylvestre (Retz.) Ngành (Division) Magnoliophyta Lớp (Classis) Magnoliopsida Bộ (Ordo) Gentianales Họ (Familia) Apocynaceae Chi (Genus) Gymnema Trong dân gian gọi dây thìa canh với nhiều tên khác nhau: Cây thìa canh, thìa canh, lừa ty rừng, dây muôi 1.1.2 Sự phân bố đặc điểm sinh học lồi Dây thìa canh Dây thìa canh có nguồn gốc từ đất nƣớc Ấn Độ Trong dƣợc điển Ấn Độ có ghi lại loại Gumar dây thìa canh Chúng đƣợc sử dụng từ 2000 năm trƣớc Ấn Độ để chữa trị bệnh “nƣớc tiểu nhƣ mật” – bệnh tiểu đƣờng Năm 2006, dây thìa canh đƣợc tìm thấy Việt Nam Ngƣời phát nghiên cứu loại TS Trần Văn Ơn (Đại học Dƣợc Hà Nội) Hiện Việt Nam, dây thìa canh có khu vực miền Bắc Đặc biệt tỉnh Nam Định Thái Ngun có quy hoạch trồng thìa canh để thu hái quanh năm Cây thìa canh thƣờng mọc khu vực có bờ bụi, hàng rào để dễ phát triển Cây có hoa vào tháng có vào tháng Cây dây leo cao 3-5 m, nhựa mủ màu trắng Thân màu non xanh, lông phủ mịn, thân già màu nâu có lỗ vỏ, đƣờng kính lỗ từ 0,1- 1mm Lá có phiến bầu dục, trứng ngƣợc, dài 6–7 cm, rộng 2,5–5 cm, đầu nhọn, có mũi, gân phụ 4-6 cặp, rõ mặt dƣới, nhăn lúc khô; cuống dài 5–8 mm Hoa nhỏ, màu vàng, xếp thành xim dạng tán nách lá, cao mm, rộng 12–15 mm; đài có lơng mịn rìa lơng; tràng khơng lơng mặt ngồi, tràng phụ Quả đại dài 5,5 cm, rộng nửa dƣới; hạt dẹp, lông mào dài cm Cây hoa vào tháng đậu vào tháng Khi chín rụng xuống tách đơi giống thìa, nên dân gian gọi Dây thìa canh hay mi [5] Hình 1.1 Cây Dây thìa Canh (Nguồn ảnh: Caythuoc.org) 1.1.3 Giá trị sử dụng Dây thìa canh Trong dây thìa canh có chứa chất nhƣ: axit gymnemic, anthraquinone, flavone, hentri-acontane…Ngồi ra, dịch chiết thìa canh cho thấy có thành phần ancaloid Đơng y sử dụng thìa canh nhƣ vị dƣợc liệu có nhiều tác dụng điều trị số bệnh lý khác Dây thìa canh đƣợc ghi nhận tác dụng gián tiếp lên tiết insulin tụy tạng, làm giảm glucoza-niệu, làm vị đƣờng vị đắng thuốc đắng vài giờ, nhờ giúp giảm đƣờng huyết điều trị bệnh đái tháo đƣờng (Anti-diabetes) Ngồi ra, Dây thìa canh cịn đƣợc ghi nhận làm giảm nồng độ LDL-cholesterol, triglicerid máu, tăng HDL-cholesterol nên giảm lipid máu toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa mạch máu Trên lâm sàng, cho thấy hiệu giảm huyết áp bệnh nhân có cao huyết áp Điều đáng ý nghiên cứu lâm sàng ngƣời bình thƣờng, đƣờng huyết không cao, không cho hiệu giảm đƣờng huyết hay huyết áp Thƣờng dùng trị đái đƣờng, với liều 4g khô đủ để làm ngƣng glucoza-niệu Lá dùng làm thuốc dễ tiêu hố, cịn dùng tán thành bột để chống độc, ngƣời ta dùng đắp lên vết cắn dùng sắc uống để trị rắn độc cắn Hoặc ngƣời ta dùng bỏ rễ làm thuốc trị phong thấp tê bại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ vết thƣơng dao, đạn; dùng diệt chấy rận Hình 1.2 Tác dụng dây thìa canh (Nguồn ảnh: Caythuoc.org) Trong Dây thìa canh có thành phần hoạt chất GS4 Khi ngƣời bệnh tiểu đƣờng sử dụng thìa canh, hoạt chất vào thể tác động tới trình: + Quá trình hấp thu glucose ruột: ị hạn chế + Quá trình sản xuất hoạt tính insulin đƣợc kích thích + Tăng men để sử dụng đƣờng mơ Vì vậy, dây thìa canh có tác dụng: Hạ đƣờng huyết ngƣời có mức đƣờng huyết vƣợt quy định, ổn định đƣờng huyết, hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng, phòng ngừa biến chứng bệnh tiểu đƣờng ên cạnh tác dụng ổn định đƣờng huyết, chữa tiểu đƣờng dây thìa canh cịn có tác dụng nhƣ tăng tiết cholesterol dƣ thừa qua đƣờng phân, giảm cholesterol xấu triglycerid máu, gan [2] 1.2 Tổng quan ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời xây dựng đƣợc hệ thống phân loại nói chung thực vật nói riêng tƣơng đối đầy đủ tồn diện Phƣơng pháp phân loại chủ yếu dựa vào khác biệt CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ết uả tách chiết N tổ g ố Tách chiết ADN bƣớc khởi đầu quan trọng, định thành cơng cho phản ứng PCR sau Để tách chiết ADN đạt hiệu suất độ tinh cao cần lựa chọn phƣơng pháp tách chiết phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu đƣợc tách theo phƣơng pháp tách chiết ADN Shagai Maroof cs (1984) có cải tiến cho phù hợp với tách chiết ADN Dây thìa canh Sau tiến hành tách chiết, ADN tổng số đƣợc điện di gel agarose 1% để kiểm tra thu đƣợc kết nhƣ hình 3.1 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dây thìa canh Ghi chú: giếng từ – : mẫu TC1 – TC5 Kết điện di cho thấy băng vạch ADN sáng nét, khơng có băng phụ, chứng tỏ ADN tổng số tách chiết đƣợc từ mẫu Dây thìa canh tƣơng đối tốt ăng có độ sáng tƣơng tự nhau, chứng tỏ hàm lƣợng ADN tổng số tách chiết đƣợc từ mẫu tƣơng đối đồng Các mẫu ADN tổng số sau tách chiết đƣợc đo kiểm tra hàm lƣợng độ phƣơng pháp quang phổ kế (đo máy Nanodrop 2000), kết cho thấy tỷ lệ OD260/280 nm mẫu ADN tách chiết nằm khoảng 1,8 – 2,0; điều chứng tỏ mẫu ADN đảm bảo độ tinh để thực phản ứng PCR với mồi đặc hiệu Hàm lƣợng ADN mẫu đƣợc pha lỗng nồng độ 50 ng/µl để thực PCR 24 3.2 Kết PC đoạn mã vạch ADN Từ mẫu ADN tổng số tách đƣợc, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho đoạn để tiến hành PCR nhân đoạn ADN Mẫu ADN tổng số đƣợc pha loãng 10 lần (điều chỉnh nồng độ ADN đạt 50 ng/µl) Sau điều chỉnh nồng độ ADN phù hợp, tiến hành nhân đoạn gen psbA-trnH, trnL ITS1 từ ADN tổng số mẫu Dây thìa canh phản ứng PCR với cặp mồi tƣơng ứng lần lƣợt là: psbA-trnHP10F psbA-trnH P10R; trnLP11F trnLP11R; ITS1P12F ITS1P12R Thực phản ứng PCR lặp lại lần mẫu thí nghiệm Sản phẩm PCR tất mẫu thí nghiệm đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết điện di sản phẩm PCR từ mẫu Dây thìa canh đƣợc thể hình 3.2, 3.3 3.4 3.2.1 K t nhân gen psbA-trnH bằ kĩ thuật PCR Hình 3.2 Kết hâ đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Dây thìa canh thu đƣợc dùng m i P10 Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ – : mẫu TC1 – TC5 Đoạn psbA-trnH có kích thƣớc trung bình khoảng 450bp theo lý thuyết, nhƣng thực tế thay đổi từ 296 – 1120bp tùy thuộc lồi psbA-trnH có khả xác định loài cao Locus psbA-trnH đƣợc khuếch đại thành cơng nhiều thực vật hạt kín hạt trần Tuy nhiên, nhiều thực vật hạt kín psbA-trnH lại có kích thƣớc ngắn Kích thƣớc gen lớn có mặt gen RPS19 gen giả nằm gen hai gen psbA trnH Trong thí nghiệm này, ADN tách chiết đƣợc làm khuôn để nhân 25 đoạn gen psbA-trnH phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu với trình tự mồi đƣợc nêu bảng 2.1 Kết PCR cho thấy đoạn băng sáng rõ đồng đều, khơng xuất băng phụ Kích thƣớc khoảng 500bp, đủ điều kiện để tiến hành xác định trình tự nucleotide 3.2.2 K t nhân gen trnL bằ kĩ thuật PCR Hình 3.3 Kết hâ đoạn gen trnL từ mẫu Dây thìa canh thu đƣợc dùng m i P11 Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ – : mẫu TC1 – TC5 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen trnL khuếch đại thành công tất mẫu Ở mẫu thu đƣợc băng ADN sáng rõ nét, khơng có băng ADN phụ xuất hiện, kích thƣớc khoảng 500 – 550bp phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen trnL dự kiến nhân Kết lần khẳng định chất lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ không lẫn tạp chất (polysacarit, phenol) gây ảnh hƣởng đến nhân dòng PCR, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.2.3 K t nhân gen ITS1 bằ kĩ thuật PCR Hình 3.4 thể kết nhân gen ITS1 kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhƣ mơ tả bảng 2.1 Qua hình 3.4 cho thấy đoạn gen ITS1 khuếch đại thành công tất mẫu Ở mẫu thu đƣợc băng ADN sáng rõ nét, khơng có băng ADN phụ xuất hiện, kích thƣớc khoảng 700 – 750bp phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen ITS1 dự kiến nhân 26 Kết lần khẳng định chất lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ không lẫn tạp chất (polysacarit, phenol) gây ảnh hƣởng đến nhân dịng PCR, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS1 đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide Hình 3.4 Kết hâ đoạn gen ITS1 từ mẫu Dây thìa canh dùng m i P12 Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ – : mẫu TC1 – TC5 Thành công khuyếch đại PCR xác định đƣợc trình tự tiêu chí quan trọng để đánh giá tính hữu ích mã vạch ADN Trong nghiên cứu này, ba đoạn mã vạch đề xuất psbA-trnH, trnL ITS1 đƣợc khuyếch đại việc sử dụng cặp mồi phổ quát thành phần quy trình PCR đƣợc tối ƣu hóa cho đoạn mã vạch Tất đoạn mã vạch ADN thuộc vùng ADN lục lạp đƣợc khuyếch đại thành công tất 05 mẫu nghiên cứu (hình 3.2, 3.3 3.4) Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch 100% Tỷ lệ thành cơng trình tự hai chiều đạt đƣợc từ sản phẩm PCR 100% cho ba đoạn mã vạch ADN Kết lần khẳng định chất lƣợng ADN đƣợc tách chiết, hàm lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ không lẫn tạp chất (polysaccharide, phenol) gây ảnh hƣởng đến nhân dòng PCR Hơn nữa, sản phẩm PCR đặc hiệu ba đoạn mã vạch tất mẫu nghiên cứu chứng tỏ hiệu tối ƣu hóa thiết kế mồi quy trình PCR 27 Bảng 3.1 Đá h giá ba vù g N đề xuất Các mã số trình TT Chỉ tiêu phân tích psbAtrnH t nucleotide trnL ITS1 Ge a đƣợc l a chọ để so sánh Tỷ lệ PCR thành cơng (%) Tỷ lệ đọc trình tự thành công (%) 100 100 100 100 100 100 Chiều dài trình tự (bp) 565 567 767 Vị trí sai khác 319 201 376 Số nucleotide sai khác 1 0,18 0,18 0,13 Sự phân biệt mức độ lồi (%) MF064898.1; KF953920.1; MG730191.1 3.3 Phân tích trình t đoạn mã vạch ADN với đoạn m i khác Với cách lựa chọn ba mẫu Dây thìa canh ba lần lặp lại mẫu, tổng cộng thu đƣợc 15 trình tự nucleotide cho đoạn mã vạch ADN đề xuất Chất lƣợng trình tự nucleotide cao tất mẫu, tỷ lệ đọc thành cơng 100% Các trình tự sau đƣợc chỉnh sửa ghép nối tay phần mềm Bioedit version 7.2.5 Kết trình tự nucleotide phân tích thuộc vùng ADN 565bp, 567bp 767bp cho gen psbA-trnH, trnL ITS1 (Bảng 3.1) Tiếp theo, trình tự nucleotide đoạn mã vạch đƣợc so sánh trực tiếp với loại mã vạch ADN lồi Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) chi Gymnema Cơ sở liệu mã vạch ADN (BOLD- Barcode of Life Data Systems), Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Hoa Kỳ (NCBI-National Center for Biotechnology Information) cơng cụ BLAST (có sẵn tài địa 28 website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) phần mềm ClustalW2 (có sẵn địa website:http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) 3.3.1 K t phân tích trình tự nucleotide củ đ ạn gen psbA-trnH Với đoạn mã vạch psbA-trnH, chi Gymnema có 03 trình tự NCBI: MF064898.1; MF064896.1; MF064897.1; Bằng phần mềm Bioedit, trình tự nucleotide psbA-trnH từ lồi Dây thìa canh đƣợc so sánh với loại mã vạch psbA-trnH mã số MF064898.1 từ 01 loài thuộc chi Gymnema Điểm bắt đầu so sánh vị trí nucleotide thứ 1, kết 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.5) Trong 01 vị trí (nucleotide thứ 319 thay A T) Hình 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng psbA-trnH Ghi chú: vị trí sai khác vị trí khoanh trịn 29 3.3.2 K t phân tích trình tự nucleotide củ đ ạn gen trnL Với đoạn mã vạch trnL, có 06 trình tự NCBI: HE805512.1, HG530575.1, AJ402142.2, KF953920.1, AJ402137.1, AJ431750.1 So sánh trình tự nucleotide trnL Dây thìa canh đƣợc so sánh với mã vạch trnL mã số KE953920.1 loài thuộc chi Gymnema, kết 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.6), 01 vị trí (nucleotide thứ 201 thay T A) Hình 3.6 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng trnL Ghi chú: vị trí sai khác vị trí khoanh trịn 3.3.3 K t phân tích trình tự nucleotide củ đ ạn gen ITS1 Cũng nhƣ thế, với đoạn mã vạch ITS1, có 07 trình tự NCBI: MF409652.1, MG730191.1, MG730189.1, MG730190.1, MG818139.1, MF063778.1, MF063777.1 So sánh trình tự nucleotide ITS1 Dây thìa 30 canh đƣợc so sánh với mã vạch ITS1 mã số MG730191.1 loài thuộc chi Gymnema, kết 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.7), 01 vị trí (nucleotide thứ 376 thay C G) Hình 3.7 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng ITS1 Ghi chú: vị trí sai khác vị trí khoanh tròn Nhƣ vậy, với ba vùng ADN đƣợc lựa chọn psbA-trnH, trnL ITS1 đại diện cho tiến hóa dẫn đến sai khác nucleotide đủ để đảm bảo cho phân định lồi Kết phân tích từ ba vùng cho khác biệt nucleotide hai hệ gen nghiên cứu không nhiều nên sử dụng trình tự thuộc ba vùng gen làm sở cho giám định loài 31 3.4 Xây d ng phát sinh chủng loại Dựa vào kết trên, xây dựng phát sinh thể mối quan hệ lồi Dây thìa canh nghiên cứu với số loài Gymnema ngân hàng gen NCBI Đối với trình tự gen psbA-trnH phát sinh đƣợc xây dựng với chi Gymnema ngân hàng gen NCBI có trình tự: MF064898.1, MF064896.1, MF064897.1 Ta thấy mã vạch psbA-trnH có tƣơng đồng đến 99,99% (bảng 3.2) với mã số MF064898.1 Điều cho thấy hai trình tự có quan hệ họ hàng gần gũi với Bảng 3.2 Hệ số khác biệt di truyền đoạn psbA-trnH Từ kết hệ số khác biệt di truyền thu đƣợc nhƣ bảng 3.2, dùng phần mềm MEGA phƣơng pháp Neighbor-joining vẽ phát sinh chủng loại nhƣ hình 3.8 0.00 0.23 0.00 0.00 0.00 0.23 MF064898 psbA-trnH MF064896 MF064897 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại d a vào trình t t ê đoạn psbA-trnH Từ hình 3.9 dựa vào bảng 3.3 so sánh trình tự gen ITS1 Dây thìa canh có mã gen ITS1 có độ tƣơng đồng cao 99,97% với mã vạch MF409652.1 Điều cho thấy hai trình tự có quan hệ họ hàng gần gũi với 32 Bảng 3.3 Hệ số khác biệt di truyền đoạn ITS1 0.04 0.01 -0.01 0.02 -0.01 0.06 MG730189.1 -0.07 0.16 MG730190.1 -0.11 MG818139.1 0.00 0.00 0.36 ITS MG730191.1 -0.03 0.07 MF409652.1 MF063778.1 MF063777.1 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại d a vào trình t t ê đoạn ITS1 Tiếp tục so sánh trình tự gen trnL số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ LAST, thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại nhờ NCBI (ngân hàng gen) So sánh trình tự mã gen ITS1 Dây thìa canh có mã gen trnL có độ tƣơng đồng cao 99,27% với mã vạch KF953920.1 33 Bảng 3.4 Hệ số khác biệt di truyền đoạn trnL 0.00 0.00 0.00 0.01 0.00 0.35 0.00 0.00 0.00 0.36 HG530575.1 AJ402142.2 0.00 0.01 HE805512.1 KF953920.1 trnL AJ402137.1 AJ431750.1 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại d a vào trình t t ê đoạn trnL 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã thu thập đƣợc mẫu ADN tổng số Dây thìa canh; Tách chiết đƣợc ADN tổng số 5/5 mẫu Dây thìa canh; Nhân gen thành công đoạn gen gen psbA-trnH, trnL ITS1 từ ADN tổng số lồi Dây thìa canh kỹ thuật PCR; Xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen psbA-trnH, ITS1, trnL loài dây thìa canh Tƣơng ứng mã code: MF064898.1, MF409652.1, KF953920.1 4.2 Kiến nghị Đƣa trình tự gen psbA-trnH, trnL ITS1 lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau này; Tiếp tục thu thập mẫu Dây thìa canh nghiên cứu thêm để đánh giá tồn diện tính đa dạng di truyền lồi này; Nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN để xây dựng sở liệu ADN barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng kết hợp đoạn gen psbA-trnH, trnL ITS1 vào việc giám định lồi Dây thìa canh Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Hà Văn Huân (2015) Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN (mã vạch DNA) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam Đình Hùng (2016) Sách cẩm nang chăm sóc sức khỏe cho nhà hƣớng dẫn sử dụng thuốc vị thuốc việt nam NXB xuất Hồng Hà Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thắng (2008) Cơ sở di truyền học phân tử tế bào NX Đại học Quốc Gia Hà Nội Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn thị Phƣơng Trang, Lê thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn (2014) Mối quan hệ di truyền mẫu sâm thu Lai Châu sở phân tích di truyền trình tự nucleotide vùng matk ITS-rDNA Tạp chí cơng nghệ sài gòn, 2: 327-337 Đỗ Tất Lợi ( 2012) Những thuốc vị thuốc việt Nam NXB Y Học Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004) Kỹ thuật Di truyền ứng dụng NX Đại Học Quôc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng (2002) Công Nghệ Gen NX Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Anh CBOL Plant Working Group (2009) A DNA barcode for land plants 106: 12794 -12797 Chen S (1), Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PLoS ONE 5: e8613 10 Gao T.Y.H., Song J., Mori S.A., Pe Tronelli P Et Al (2009), Indentyficiation of medicinal plants in the family fabaceae using a potential DNA barcode ITS2 Journal of Ethnopharmacology, 130, pp.116-121 11 Hamilton M.B (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation Molecular Ecology, 8: 513-525 12 Hamilton M.B (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation Molecular Ecology, 8: 513-525 13 Hebert P.D, Ball C.A Et Al (2003), Biological identification through DNA barcodes Bio Sci, 270,pp 313-321 14 Hebert P.D.N., C.A Ball S.L., De Waard J.R Et Al (2003), Biological indentification through DNA barcodes Proc R Soc Land B Biol Biol Sci, 270:313-321 15 Hilu K.W.L.H (1997) The matk gene: Secuence variation and amplification in plant systematic American journal of Botany 84: 830-839 16 Kress, J.W., K.J , Zimmer, E.A., Weight, L.A & Janzen, D,H (2005), Use of DNA barcodes to identyfy flowering plants, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 8369-8374 17 Ren B.Q.X.X.R., Chen Z.D (2010) Species identification of Alnus using nrDNA and cpDNA genetics makers Mol.Eco.Res, 10: 594-605 18 Shaw J.L.E.B., Schiling E.E., Small R.L (2007) Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III Amer Jour.Bota, 94: 275-288 19 Srimara R.S.U., Sreejayn., Et Al (2010) Assesing species admixtures in raw drug trade of phyllanthus, a hepatoprotective plant using molecular tools Journal of Eth , 130: 208-215 20 Tautz, D Arctander., P Minelli., A Thomas., R.H Vogler (2003) A plea for DNA taxanomy Trends Ecol, 18:70-74 21 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana, 15: 96114 22 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, (Hydrocotyle Molecular Ecology Resources, 9: 1086-1091 23 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540 24 Von Crautlein M.K.H., Et Al (2011) DNA barcoding: A tool for improved taxon identificaton and detection of species diversity Biodiversity and conservation, 20: 373-389 25 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, MC Plant Biology, 10: 205 26 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics, 174: 1407-1420 27 Yao H, Song J, Liu C, Luo K, Han J (2010) Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals PLoS ONE, 5: 13102 28 Yong H L, Jinlan R, Shilin C, Jingyuan S, Kun L, Dong L and Hui Y (2010) Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique Journal of Medicinal Plants Research, (24): 2706 - 2709 ... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Mục tiêu chung: Xác định đƣợc số trình tự đoạn mã vạch ADN cho lồi Dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz. ) nhằm xây dựng sở liệu ADN mã vạch, phục vụ cho. .. lồi Dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz) Việt Nam phục vụ giám định loài CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Cây Dây thìa. .. kinh tế Gần việc ứng dụng gen mã vạch xác định đoạn ADN mã vạch phƣơng pháp định danh, sử dụng đoạn ADN chuẩn ngắn nằm genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời