Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng phương pháp mới Mã vạch ADN để xác định dòng Bạch đàn lai UG24. ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu lá của UG24 và được sử dụng để nhân bản các đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS và ITS2 bằng kỹ thuật PCR. Mời các bạn cùng tham khảo!
Công nghệ sinh học & Giống trồng XÁC ĐỊNH ADN MÃ VẠCH GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI UG24 (Eucalyptus urophylla x E grandis) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH GIỐNG CÂY Bùi Thị Mai Hương1, Bùi Thị Hoàng Yến2, Hà Văn Huân1, Nguyễn Thị Hồng Gấm1 Trường Đại học Lâm nghiệp Trường Trung học Phổ thơng Đồng Hịa - Hải Phịng TĨM TẮT Giống bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x E grandis) giống có giá trị kinh tế cao công nhận giống theo định 3893/QĐ-BNN-TCLN ngày 20/9/2016 Tuy nhiên, người nông dân việc xác định giống hình thái khó khăn Do đó, mục đích nghiên cứu sử dụng phương pháp Mã vạch ADN để xác định dòng Bạch đàn lai UG24 ADN tổng số tách chiết từ mẫu UG24 sử dụng để nhân đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR Các kết băng sản phẩm PCR với kích thước dự kiến 687 bp, 449 bp, 336 bp, 564 bp, 178 bp cho rbcL, matK, trnH-psbA, ITS, ITS2, tương ứng Các trình tự sau so sánh với trình tự Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) Kết giống Bạch đàn lai UG24 (E urophylla x E grandis) thuộc loài E urophylla với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen rbcL matK, 98,76% đoạn gen ITS, 98,31% đoạn gen ITS2, 97,92% đoạn gen trnH-psbA, E grandis với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen rbcL, 99,55% đoạn gen matK, 98,23% đoạn gen ITS, 98,31% đoạn gen ITS2, 87,43% đoạn gen trnH-psbA Kết cho thấy sử dụng thị trnH-psbA làm mã vạch ADN để giám định giống Bạch đàn lai UG24 Việt Nam tốt Từ khóa: Bạch đàn lai UG24, giám định loài, mã vạch ADN, nhân gen ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn hay Khuynh diệp thuộc chi thực vật có hoa Eucalyptus họ Sim (Myrtaceae) (Boland D.J et al., 2006) Hiện giới có 700 lồi bạch đàn tìm thấy Australia, châu Mỹ, châu Âu, châu Phi Việt Nam (Boland D.J et al., 2006; Brooker M.I.H et al., 2006) Bạch đàn lồi gỗ có giá trị kinh tế cao làm gỗ xây dựng, làm nguyên liệu chế biến bột giấy ván ép công nghiệp, tinh dầu bạch đàn điều trị đau đầu, nhức xương y học (https://caythuocdangian.com) Bạch đàn lai UG24 (E urophylla x E grandis) tạo từ hai loài Bạch đàn E urophylla E grandis công nhận giống quốc gia (3893/QĐ/BNN-TCLN, ngày 20 tháng 09 năm 2016) với mã số BĐL.TVT.16.03, giống có giá trị kinh tế cao trồng rừng sản xuất Hiện thị trường có nhiều giống bạch đàn bạch đàn lai khác mà phân biệt hình thái khó để phân loại Do vậy, việc nghiên cứu xác định đoạn mã vạch ADN cho giống Bạch đàn lai UG24 phục vụ giám định dòng cần thiết cấp bách cho việc định danh phát triển vùng 12 trồng cho giống lai UG24 Việt Nam Xác định đoạn mã vạch ADN phương pháp định danh, sử dụng đoạn ADN chuẩn, ngắn nằm hệ gen sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới (Mark W Chase et al., 2005) Phương pháp xác định đoạn mã vạch ADN công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái (Aron et al., 2008) Một số gen lục lạp matK, rbcL ; gen vùng nhân ITS, ITS2; vùng xen trnH-psbA, psbK-psbI sử dụng kết hợp để giám định loài thực vật (Chase et al., 2005; Chen et al., 2010; Ford et al., 2009; Kress et al., 2005; Von Crautlein et al., 2011) Thêm vào đó, số loài Bạch đàn định danh thành công mã vạch ITS matK, rbcL, psbA-matK, trnG-psbK (Fladung et al., 2015) Trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn năm đoạn trình tự để sử dụng làm mã vạch ADN là: matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 Các đoạn trình tự có tính đặc trưng cao cho lồi, đem lại kết khả quan TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng nhằm phân loại, giám định xác định mối quan hệ di truyền, từ góp phần nâng cao hiệu bảo tồn phát triển giống Bạch đàn lai UG24 Việt Nam PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất Đối tượng nghiên cứu: Bạch đàn lai UG24 (E urophylla x E grandis) thu thập Tân Mai - Đồng Mai - Quảng Yên - Quảng Ninh Vật liệu nghiên cứu: 03 mẫu bánh tẻ lấy từ 03 Bạch đàn lai UG24 khác Mẫu bảo quản túi nilon có chứa hạt silicagel hút ẩm, sau bảo quản 20oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu Kí hiệu mẫu Bạch đàn lai UG24 lấy UG24.1; UG24.2; UG24.3 Trình tự cặp mồi rbcL (rP1F: TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC; rP1R: GTAAAATCAAGTCCACCTCG) với nhiệt độ gắn mồi 52oC, kích thước đoạn gen dự kiến khoảng 750 bp); mồi trnH-psbA (trnPF1: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC; psbPR1: GTTATGCATGACGTAATGCTC) với nhiệt độ gắn mồi 50oC, kích thước đoạn gen dự kiến khoảng 600 bp); mồi matK (mP3F: TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC; mP3R: TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT), kích thước đoạn gen dự kiến khoảng 700 bp); mồi ITS (IsP2F: ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG; IsP2R: TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC), kích thước đoạn gen dự kiến khoảng 600 bp; mồi ITS2 (IsP1F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT; IsP1R: TCCTCCGCTTATTGATATGC) với nhiệt độ gắn mồi 48oC, kích thước đoạn gen dự kiến khoảng 300 bp Các cặp mồi sử dụng cho đoạn gen cần nhân cung cấp từ Hà Văn Huân (Ha Van Huan, 2018) Hóa chất: Kit tách chiết ADN tổng số (Plant ADN Isolation Kit) hãng Norgen, Canada; hóa chất cho phản ứng PCR nhân đoạn mã vạch ADN: Master mix hãng Intron Biotechnology, Hàn Quốc; Kit tinh sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) Norgen, Canada; Hóa chất cho điện di gel Agarose: Agarose Đức, ADN marker, Redsafe Hàn Quốc 2.2 Phương pháp nghiên cứu ADN tổng số từ mẫu Bạch đàn lai UG24 tách kit (Plant ADN Isolation Kit) Đức Các mẫu ADN tổng số dùng để nhân đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR máy PCR 9700 Mỗi phản ứng PCR thực tổng thể tích 20 μl, bao gồm: H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/µl mồi xi (1,0 µl), 10 pmol/µl mồi ngược (1,0 µl) 50 ng/µl ADN khn (1 µl) Chương trình phản ứng PCR: 95oC phút; (95oC: 30 giây, 4852oC: 30 giây, 72oC: phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC phút; 4oC Nhiệt độ gắn mồi phản ứng phụ thuộc vào cặp mồi sử dụng Mỗi phản ứng PCR lặp lại lần mẫu thí nghiệm Sản phẩm PCR tinh Kit (PCR Purification Kit) Canada Sau tinh sản phẩm PCR đọc trình tự cơng ty 1st Base (Malaysia) Trình tự nucleotide đoạn ADN xử lý, phân tích phần mềm chuyên dụng Bioedit, ADNClub, Biohit, MegaX Trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 so sánh Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) để tìm lồi tương đồng Xây dựng phát sinh chủng loại đoạn gen phương pháp Maximum Likelihood (ML), tính khoảng cách di truyền phần mềm megaX KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ Bạch đàn lai ADN tổng số sau tách chiết từ mẫu Bạch đàn lai UG24 pha loãng để xác định nồng độ độ tinh Kết xác định nồng độ độ tinh dung dịch ADN tổng số cho thấy, dung dịch ADN tổng số có nồng độ dao động từ 100 - 200 ng/µl; Tỷ số OD260nm/OD280nm khoảng từ 1,7 - 2,05, kết khẳng định tách chiết TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 13 Công nghệ sinh học & Giống trồng ADN với nồng độ cao đảm bảo độ tinh Sản phẩm tách chiết ADN tổng số đảm bảo làm khuôn cho nhân đoạn ADN quan tâm kỹ thuật PCR 3.2 Kết nhân đoạn mã vạch ADN kỹ thuật PCR ADN tổng số tách chiết từ mẫu Bạch đàn lai UG24 sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết minh họa hình Hình Ảnh điện di đoạn gen trnH-psbA, matK, rbcL, ITS2, ITS UG24 Kết PCR sau kiểm tra điện di gel agarose 1% (hình 1) cho thấy xuất băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước đoạn mã vạch ADN dự kiến Sản phẩm PCR đoạn mã vạch ADN hình 01 cho thấy khơng có băng ADN phụ xuất hiện, sản phẩn PCR đặc hiệu, sau tinh sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.3 Kết xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN 3.3.1 Trình tự ADN gen rcbL Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen rbcL cho thấy mẫu UG24.1; UG24.2; UG24.3 cho kết trình tự giống Sau xử lý đoạn ADN bị nhiễu đoạn gen rbcL có kích thước 687 bp hình GGTGTTAAAGATTATAAACTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCT CAACCTGGAGTTCCTCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGG CTTACCAGCCTTGATCGTTATAAAGGAAGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATATGTTATGTAGCT TACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAATATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCG CTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATCCCTCCTTCCTATACGAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATA AATTGAACAAATATGGGCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCGAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAACTACGGTAGAGCAGTTT ATGAATGTCTTCGTGGTGGACTTGATTTTACGAAAGATGATGAGAACGTGAACTCACAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCT TATTTTGTGCCGAAGCCATTTTTAAATCACAGGCTGAAACAGGTGAAATCAAAGGGCATTACTTGAATGCTACTGCA Hình Trình tự DNA đoạn gen rbcL Các trình tự sau so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với giống Bạch đàn lai trình bày bảng Bảng Một số lồi có trình tự đoạn rbcL tương đồng với giống Bạch đàn lai NCBI Hệ số tương đồng TT Tên loài Mã số (%) Eucalyptus grandis MG925369.1 100 Eucalyptus urophylla KJ440000.1 100 Eucalyptus baxteri KC180773.1 99,42 UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 100 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 100 Sau chúng tơi xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai nghiên cứu với loài khác 14 bảng khoảng cách di truyền chúng (hình 3) TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo ML Khoảng cách di truyền (p-distance) giống Bạch đàn lai với loài khác thu bảng Bảng Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn rbcL UP95 UP35 E.grandis E.urophylla E.baxteri UG24 UP95 UP35 0,0000 E.grandis 0,0000 0,0000 E.urophylla 0,0000 0,0000 0,0000 E.baxteri 0,0058 0,0058 0,0058 0,0058 _UG24 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0058 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen rbcL kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai mà nghiên cứu có trình tự gen giống 100% với đoạn gen loài E urophylla, E grandis, UP35 UP95 với khoảng cách di truyền 0,0000 (hệ số tương đồng 100%) có quan hệ xa với lồi E baxteri với khoảng cách di truyền 0,0058 (hệ số tương đồng 99,42%) 3.3.2 Trình tự đoạn gen matK Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen matK cho thấy mẫu cho kết trình tự giống Sau xử lý đoạn gen matK có kích thước 449 bp hình TGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATTACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCCTGGTTTCA ACCAGGAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCTTTACTTTTTGGGCTATCGTTCAAGCGTGCGACTAAATTCTTCAGTG GTACGAAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAAATAATGCTATGAAGAAGTTCGAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATT GGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTGACACATTAGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGCTGATTCATCAGATTCTGATATT ATCGACCGTTTTTTGCGTATATCCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAGTAAAATAT ATACTTCGACTTTCTTGTGTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAAGACTGTACGTACTTTTTTAAAAAGATTAGGTTCGGAATTTT TGGAAGAATTCCTTACGGAGGAAGAAGTTGTTCTTTCTTTGATCTTCCCAAGAACTTATTCTACTTCACGAAGGTTATATAGAGGGCG GATTTGGTATTTGGATATTACTTCTATCAA Hình Trình tự DNA đoạn gen matK Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi Một số lồi có trình tự gen tương đồng với giống Bạch đàn lai trình bày bảng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 15 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Bảng Một số lồi có trình tự đoạn matK tương đồng với giống Bạch đàn lai NCBI Hệ số tương đồng TT Tên loài Mã số (%) Eucalyptus grandis MG925369.1 99,55 Eucalyptus urophylla KJ510901.1 100 Eucalyptus marginata KC180781.1 98,89 UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 100 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 100 Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng (hình 5) Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo ML Khoảng cách di truyền (p-distance) giống Bạch đàn lai với loài khác bảng Bảng Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn matK UP95 UP35 E grandis E urophylla E marginata UG24 UP95 UP35 E.grandis E.urophylla E.marginata _UG24 0,0000 0,0045 0,0000 0,0112 0,0000 0,0045 0,0000 0,0112 0,0000 0,0045 0,0112 0,0045 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen matK kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai mà chúng tơi nghiên cứu có trình tự gen giống 100% với đoạn gen loài E urophylla, UP35 UP95 với khoảng cách di truyền 0,0000 có quan hệ xa với lồi 0,0112 0,0000 0,0112 E marginata với khoảng cách di truyền 0,0112 (hệ số tương đồng 98,89%) 3.3.3 Trình tự DNA gen trnH-psbA Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA cho thấy mẫu cho kết trình tự giống Sau xử lý đoạn gen trnH-psbA có kích thước 383 bp hình ATATTTTTTTTTTCTTTTTAATCCATTTAAAAATTAAAAAAAGAATATTCCATTTTTAATGAAATCAAAAAAAGAAATTCATAATGGA AAATATTTCATTCGATTGTTAATTTTTAACATTTTTCTATACTTAATTATGAGTAACATTTTTCTATCTTAATTATGAGATAGAAGAAG CAGAAAATTATAACCTTTCCATTTTATTTGAAAAAAAAAACTAGAAGATAATAATCTCACAAAGCCTTACAAAGGGTTGAAAAGAA TGTATATAAATTCATATCTAAGGAAAAAAGTATGATAAGCAATCATAAAGCAATCCCTAAGACTAGAATACTTTTTCTTATGTTGAA GTAAAGAAAAACTTATGTAAAGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAATAACCAATTTCTTTTTCTATCAAGAGTGTTGGTTATTGCT CCTTTCCAATCAAAAACTCGGCTAGACTTATACTAAGACCAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGAACTTCGACAGCAGCTAGGTCTA GAGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC Hình Trình tự DNA đoạn gen TrnH-psbA 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ loài loài Một số loài có trình tự gen tương đồng với giống Bạch đàn lai trình bày bảng Bảng Một số lồi có trình tự đoạn trnH-psbA tương đồng với loài Bạch đàn lai NCBI Hệ số tương đồng TT Tên loài Mã số (%) Eucalyptus grandis HM347959.1 87,43 Eucalyptus urophylla EF507887.1 97,92 Eucalyptus extrica FJ654343.1 84,59 UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 96,74 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 97,92 Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng (hình 7) Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo ML Khoảng cách di truyền (p-distance) giống Bạch đàn lai với loài khác bảng Bảng Khoảng cách di truyền giống UG24 với loài khác đoạn trnH-psbA UP95 UP35 E.grandis E.extrica E.urophylla UG24 UP95 UP35 E.grandis E.extrica E.urophylla UG24 0,0151 1,2406 1,6827 0,0000 0,4665 1,2770 1,7277 0,0151 0,4781 1,6015 1,2406 1,0368 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen trnH-psbA kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai UG24 có trình tự gen giống 97,92% với đoạn gen loài E urophylla UP95 với khoảng cách di truyền 0,4665, giống 87,43% với đoạn gen loài E grandis với khoảng 1,6827 2,0949 0,4665 cách di truyền 1,0368 có quan hệ xa với loài E extrica với khoảng cách di truyền 2,0949 (hệ số tương đồng 84,59%) Ngoài ra, với thị phân biệt hai dòng UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) có khoảng cách di truyền 0,0151 hệ số tương đồng 98,81% TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 17 Công nghệ sinh học & Giống trồng 3.3.4 Trình tự DNA đoạn ITS Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen ITS cho thấy mẫu cho kết trình tự giống Sau xử lý đoạn gen ITS có kích thước 564 bp hình CCCGACGTCCCTCTCGACGCGGAGGATCGGGGCTCGGGCACCTCAGGGCGCTCGGCCTTTGTCCTCGGCGGCGCAACGAACCCCGG CGCGGAATGCGCCAAGGAACTTTAACAAGAGTGCGATGCTCCCGCCGCCCCATACACGGTGCGCGCGCGGGATGCCATGCAATCTC ATATTACTCATAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATT GCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCTTTGGTCGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACAT GGCGTTGCCCCCAATCCCCTCCGCCCTCTGAACGGGGCGAGCGGGACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCC GGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTGATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCGCGTGCC GCTCATCGCACGCTCCGCGAATCTGCTCCTTACCAACGCGACCCCA Hình Trình tự DNA đoạn gen ITS Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ loài loài Một số lồi có trình tự gen tương đồng với giống Bạch đàn lai trình bày bảng Bảng Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai NCBI Hệ số tương đồng TT Tên loài Mã số (%) Eucalyptus urophylla HM596068.1 98,76 Eucalyptus grandis AF058475.1 98,23 Eucalyptus viminalis KM064970.1 97,16 UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 98,93 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 99,47 Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng (hình 9) Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS tạo ML Khoảng cách di truyền (p-distance) giống Bạch đàn lai với loài khác thể bảng Bảng Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS UP95 UP95 UP35 E.viminalis E.urophylla UG24 E.grandis 18 0,0126 0,0275 0,0108 0,0054 0,0181 UP35 0,0237 0,0036 0,0108 0,0144 E.viminalis E.urophylla UG24 0,0200 0,0219 0,0238 0,0090 0,0090 E.grandis 0,0126 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai mà chúng tơi nghiên cứu có trình tự gen giống 99,47% với đoạn gen loài UP95 với khoảng cách di truyền 0,0054 có quan hệ xa với lồi E viminalis với khoảng cách di truyền 0,0219 (hệ số tương đồng 97,16%) Với thị phân biệt hai dòng UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) có khoảng cách di truyền 0,0126 3.3.5 Trình tự DNA đoạn ITS2 Kết xác định trình tự nucleotide ITS2 cho thấy mẫu cho kết trình tự giống Sau xử lý đoạn gen ITS có kích thước 178 bp hình 10 AATCCCCTCCGCCCTCTGAACGGGGCGAGCGGGACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCCGGT TGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTGATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCG CGTGCCGCTCATCGCACGCTCCGC Hình 10 Trình tự DNA đoạn gen ITS2 Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ loài loài Một số lồi có trình tự gen tương đồng với giống Bạch đàn lai trình bày bảng Bảng Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS2 Hệ số tương đồng TT Tên loài Mã số (%) Eucalyptus urophylla AF390492.1 98,31 Eucalyptus grandis HM596050.1 98,31 Eucalyptus viminalis KM064970.1 97,19 UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 98,31 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 98,88 Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng Hình 11 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS2 tạo ML Khoảng cách di truyền (p-distance) giống Bạch đàn lai với lồi khác bảng 10 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 19 Công nghệ sinh học & Giống trồng Bảng 10 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai với loài khác đoạn ITS2 UP95 UP35 E.viminalis E.grandis UG24 E.urophylla UP95 UP35 0,0229 E.viminalis 0,0173 0,0174 E.grandis 0,0056 0,0287 0,0232 UG24 0,0114 0,0171 0,0174 0,0171 E.urophylla 0,0229 0,0000 0,0174 0,0287 0,0171 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS2 kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai mà chúng tơi nghiên cứu có trình tự gen giống 98,88% với đoạn gen loài UP95 với khoảng cách di truyền 0,0114 có quan hệ xa với loài E viminalis với khoảng cách di truyền 0,0174 (hệ số tương đồng 97,19%) Chỉ thị phân biệt hai dòng UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) với khoảng cách di truyền 0,0229 THẢO LUẬN Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 Bạch đàn lai UG24 với trình tự gen lồi E urophylla công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI ta lập bảng so sánh đoạn trình tự bảng 11 Bảng 11 So sánh trình tự đoạn gen Bạch đàn lai UG24 E urophylla Tên đoạn gen rbcL matK trnH-psbA ITS ITS2 Số điểm sai khác 0 7 Kích thước trình tự 687 449 336 564 178 Tỷ lệ sai khác (%) 0 3,08 2,24 2,69 Kết cho thấy: trình tự đoạn gen rbcL, matK có tỷ lệ sai khác 0%, trình tự đoạn gen ITS có tỷ lệ sai khác 2,24%, trình tự đoạn gen ITS2 có tỷ lệ sai khác 2,69% trình tự đoạn gen trnH-psbA có tỷ lệ sai khác cao 3,08% Như vậy, tỉ lệ sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA cao (3,08%) khả phân biệt loài đoạn gen trnHpsbA tốt Hơn nữa, kết cho thấy tỉ lệ sai khác trình tự đoạn gen rbcL, matK thấp (0%) đồng nghĩa với khả định danh loài tốt so sánh giống Bạch đàn lai (E urophylla x E grandis) với loài E urophylla Kết hợp phân tích cho thị với kết so sánh thị với loài E urophylla bảng 11 cho thấy: Tỉ lệ sai khác, khoảng cách di truyền trình tự đoạn gen rbcL thấp (0%) hệ số tương đồng cao 100% Vì vậy, đoạn gen rbcL 20 có khả sử dụng để định danh loài tốt cho giống Bạch đàn lai UG24 Tỉ lệ sai khác, khoảng cách di truyền đoạn gen trnH-psbA cao (3,08%) hệ số tương đồng thấp 97,92% Thêm vào đó, với đoạn gen trnH-psbA phân biệt hai dòng UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) có khoảng cách di truyền 0,0151 hệ số tương đồng 98,81% Vì vậy, đoạn gen trnH-psbA có khả sử dụng để phân biệt dịng tốt nhất cho giống Bạch đàn lai UG24 Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 để xác định xác lồi cần định danh Trước năm 1999 thị đoạn gen ITS sử dụng để phân loại cho 35 loài Bạch đàn khác (Steane D.A et al., 1999) Flagdung vào năm 2015 sử dụng đoạn TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 Công nghệ sinh học & Giống trồng gen nhân ITS đoạn gen lục lạp (rbcL, matK, matK-trnK, trnG-psbK, psbK-psbl, psbA-matK) phân loại thành cơng lồi Bạch đàn (Eucalyptus) sinh trưởng Mexico (Fladung M et al., 2015) Như vậy, lồi Bạch đàn thị ADN mã vạch đoạn gen nhân ITS đoạn thị lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA hoàn tồn tin cậy có độ phân loại cao KẾT LUẬN Đã nhân gen thành công đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR Trình tự nucleotide đoạn mã vạch xác định: Đoạn matK có kích thước 449 bp, rbcL 687 bp, trnH-psbA 336 bp, ITS 564 bp, đoạn ITS2 178 bp Các trình tự sau xử lý Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) Giống bạch đàn lai UG24 (E urophylla x E grandis) có thuộc loài E urophylla với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen rbcL matK, 98,76% đoạn gen ITS, 98,31% đoạn gen ITS2, 97,92% đoạn gen trnH-psbA, E grandis với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen rbcL, 99,55% đoạn gen matK, 98,23% đoạn gen ITS, 98,31% đoạn gen ITS2, 87,43% đoạn gen trnH-psbA Bằng cơng cụ BLAST NCBI so sánh trình tự đoạn matK, rbcL, trnHpsbA, ITS ITS2 giống Bạch đàn lai UG24 (E urophylla x E grandis) với lồi E urophylla tìm tỉ lệ sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA cao với 3,08% tỉ lệ sai khác trình tự đoạn gen rbcL thấp (0%) Đoạn gen trnH-psbA phân biệt hai dòng UP35 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) có khoảng cách di truyền 0,0151 hệ số tương đồng 98,81% Vì vậy, Sử dụng thị trnH-psbA tốt làm mã vạch ADN để giám định giống bạch đàn lai UG24 Việt Nam Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 để xác định xác lồi cần định danh TÀI LIỆU THAM KHẢO Anders R (2012) DNA barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case study on medicinal roots traded in the medina of Marrakech M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure Alvarez I.W.J.F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K , Sean W G., Steven G N., Brian C H., Diana M P., Mehrdad H., Spencer C.H.B (2008) Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well PLos one 3(7): e2802 Boland D J.; Brooker, M I H., McDonald, M W., Chippendale, G M., Hall, N., Hyland, B P M., Kleinig, D A (2006) Forest Trees of Australia Collingwood, Victoria: CSIRO Publishing 5th edition ISBN 0-643-06969-0 Brooker M I H.; Kleinig, D A (2006) Field Guide to Eucalyptus Melbourne: Bloomings Third edition ISBN 1-876473-52-5 vol South-eastern Australia Chen S.Y.H, Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcodes for identifying medicinal plant species Plos one 5: e8613 Ford C.S, Ayres K L, Toomey N., Haider N., Stahl J V A., Kelly L J., Wikstrom N., Hollingsworth P.M., Duff R.J., Hoot S.B., Cowan R.S., Chase M.W., Wilkinson M.J (2009) Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on DNA plants Botanical Journal of the Linnean Society 159 (1): 1-11 Ha Van Huan, Hoang Minh Trang and Nguyen Van Toan (2018) Identification of DNA Barcode Sequence and Genetic Relationship among Some Species of Magnolia Family Asian Journal of Plant Sciences 17(1): 56-64 ISSN 1682-3974 DOI: 10.3923/ajps.2018 Kress J W, Wurdack K J, Zimmer E A, Weigt L A, Janzen D H (2005) Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (23): 8369 - 74 10 Mark W Chase , Nicolas Salamin, Mike Wilkinson, James M Dunwell, Rao Prasad Kesanakurthi, Nadia Haider, Vincent Savolainen (2005) Land plants and ADN barcodes: Short-term and long-term goals Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 360:1889-1895 11 Maria V C., Helena K., Maria P., Jouko R (2011) DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity Biodiversity and conservation 20: 373-389 12 Steane, D A., G E Mckinnon, R E Vaillancourt and M M Potts (1999) ITS sequence data resolve higher level relationships among the eucalypts Molecular Phylogenetics and Evolution 12: 215–223 13 http://iftib.vn/signseed/view/vi/92 3893-QĐ-BNN-TCLN 2016_IFTIB_65691 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 21 Công nghệ sinh học & Giống trồng IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE OF HYBRID EUCALYPTUS UG24 (E urophylla x E grandis) TO IDENTIFY PLANT SPECIES Bui Thi Mai Huong1, Bui Thi Hoang Yen2, Ha Van Huan1, Nguyen Thi Hong Gam1 Vietnam National University of Forestry High school Dong Hoa, Hai Phong SUMMARY Hybrid Eucalyptus UG24 (E urophylla x E grandis) has been recognized as a high economic value species according to Decision 3893/QĐ-BNN-TCLN dated 20/9/2016 However, it is very hard for the famer in identifying this species by observation Therefore, this study aimed to develop a new method using DNA barcode fragments to identify the hybrid Eucalyptus UG24 The total genomic DNA was extracted from leaf samples of UG24 and was used to amplify the DNA barcodes (matK, rbcL, trnH-psbA, ITS and ITS2) by PCR technique The results showed that the bands of PCR products have the expected size, which is 687 bp, 449 bp, 336 bp, 564 bp and 178 bp for rbcL, matK, trnH-psbA, ITS, and ITS2 fragment, respectively After that, these sequences were aligned with the sequence of those genes of E urophylla and E grandis species in NCBI: The results indicated that UG24 belongs to E urophylla with matK and rbcL gene fragments are 100% similar to E urophylla, ITS gene fragment is 98.76% similar to E urophylla, ITS2 gene fragment is 98.31% similar to E urophylla, trnH-psbA gene fragment is 97.92% similar to E urophylla UG24 also belongs to E grandis with rbcL gene fragment is 100% similar to E grandis, matK gene fragment is 99.55% similar to E grandis, ITS gene fragment is 98.23% similar to E grandis, ITS2 gene fragment is 98.31% similar to E grandis, trnH-psbA gene fragment is 87.43% similar to E grandis These results suggest it is best for using trnH-psbA molecular marker as a DNA barcode to identify Hybrid Eucalyptus UG24 (E urophylla x E grandis) in Vietnam Keywords: DNA barcoding, identify species, PCR, UG24 Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng 22 : 09/4/2021 : 12/5/2021 : 25/5/2021 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2021 ... tốt làm mã vạch ADN để giám định giống bạch đàn lai UG24 Việt Nam Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 để x? ?c định x? ?c loài cần định danh TÀI... băng ADN phụ xuất hiện, sản phẩn PCR đặc hiệu, sau tinh sử dụng trực tiếp sản phẩm để x? ?c định trình tự nucleotide 3.3 Kết x? ?c định phân tích trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN 3.3.1 Trình tự ADN. .. đoạn rbcL UP95 UP35 E.grandis E .urophylla E.baxteri UG24 UP95 UP35 0,0000 E.grandis 0,0000 0,0000 E .urophylla 0,0000 0,0000 0,0000 E.baxteri 0,0058 0,0058 0,0058 0,0058 _UG24 0,0000 0,0000 0,0000