Đề tài này nghiên cứu về việc xác định các đoạn mã vạch ADN cho loài Áo cộc phục vụ giám định loài là cần thiết. ADN tổng số được phân lập từ lá cây Áo cộc. Các đoạn DNA barcode (rbcL, matK và trnH-psbA) được nhân bản từ ADN tổng số của cây bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR chỉ ra rằng các băng thu được có kích thước giống với kích thước dự kiến, sau đó sản phẩm PCR được xác định trình tự nucleotide. Mời các bạn cùng tham khảo!
Công nghệ sinh học & Giống trồng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐOẠN MÃ VẠCH ADN (DNA BARCODE) CHO LOÀI ÁO CỘC (Liriodendron chinense) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LOÀI Bùi Thị Mai Hương1, Nguyễn Văn Phong1 Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Áo cộc (Liriodendron chinense) lồi đánh giá có giá trị kinh tế với làm cảnh, gỗ tốt Hiện loài bị đe dọa liệt kê danh sách lồi thực vật có nguy tuyệt chủng hiệu sinh sản thấp Vì vậy, việc xác định đoạn mã vạch ADN cho loài Áo cộc phục vụ giám định loài cần thiết ADN tổng số phân lập từ Áo cộc Các đoạn DNA barcode (rbcL, matK trnH-psbA) nhân từ ADN tổng số kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR băng thu có kích thước giống với kích thước dự kiến, sau sản phẩm PCR xác định trình tự nucleotide Kết phân tích trình tự ra, đoạn rbcL có 658 nucleotide, đoạn matK có 543 nucleotide đoạn trnH-psbA có 382 nucleotide Các trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI tìm khác biệt với loài Áo cộc khác: đoạn gen matK tương đồng 100% với loài Liriodendron chinense, đoạn gen rbcL tương đồng 99,1% với loài Liriodendron chinense, đoạn gen trnH-psbA tương đồng 92,4% với loài Liriodendron chinenses Với đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, nghiên cứu cho thấy sử dụng đoạn gen trnH-psbA làm mã vạch ADN để giám định loài Áo cộc Việt Nam tốt Từ khóa: Áo cộc, phát sinh, giám định loài, mã vạch ADN ĐẶT VẤN ĐỀ Áo cộc (L chinense) phân bố vùng núi có độ cao 450 m đến 1800 m miền Nam Trung Quốc miền Bắc Việt Nam Là số có bóng mát lớn, có hình dạng áo phông, mùa thu sắc chuyển từ xanh sang vàng, hoa màu vàng có hình dạng giống hoa tulip Áo cộc mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị loài tạo khác biệt cộng đồng sinh thái khơng cịn có giá trị nguồn mật hoa để sản xuất mật ong, nguồn thực phẩm tự nhiên, loài cảnh cho bóng mát lớn thị (AGM Plants - Ornamental; Xia Nianhe et.al., 2012) Gỗ loài sử dụng loạt sản phẩm thiết yếu như: nội thất, pallet, khung xây dựng (Xia Nianhe et.al., 2012) Ngồi ra, chiết xuất hóa học từ gỗ chứng minh hữu ích có tác dụng chống khối u, chống đơng máu cho lồi động vật ăn cỏ alcaloid kháng khuẩn (Xia Nianhe et.al., 2012) Áo cộc bị đe dọa liệt kê danh sách loài thực vật có nguy tuyệt chủng hiệu sinh sản thấp, tỷ lệ nảy mầm hạt thấp, điều ảnh hưởng lớn tới việc nhân giống 12 phổ biến nhanh chóng lồi (Phan, K.L., 2015) Do đó, việc nghiên cứu xác định đoạn mã vạch ADN cho loài Áo cộc phục vụ giám định loài cần thiết cấp bách cho việc định danh bảo tồn loài Áo cộc Việt Nam Xác định đoạn mã vạch ADN phương pháp định danh, sử dụng đoạn ADN chuẩn ngắn nằm hệ gen sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phương pháp xác định đoạn mã vạch ADN công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái (Aron J.F et.al.,2008) Ở động vật, đoạn mã vạch ADN sử dụng cho phần lớn loài đoạn gen ty thể cytochrome C oxidase (CO1) (Anders R., 2012; Alvarez I.W.J.F., 2003) Ở thực vật, tốc độ tiến hóa đoạn gen ty thể không nhanh động vật đoạn CO1 khơng sử dụng Thay vào đó, số gen lục lạp matK, rbcL; gen vùng nhân ITS, ITS2; vùng xen TrnH-psbA, psbK-psbI sử dụng kết hợp để giám định loài thực vật (Chase M.W et al., 2005; Chen S.Y.H et al., 2010; Ford C.S et al., 2009; Kress J.W et al.,2005; TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng Von Crautlein M.K.H et al., 2011) Trong nghiên cứu này, tiến hành lựa chọn ba đoạn trình tự ADN để sử dụng làm mã vạch ADN là: rbcL, matK TrnH-psbA Trong số đó, đoạn rbcL, TrnH-psbA matK đoạn ADN nằm hệ gen lục lạp Các đoạn trình tự có tính đặc trưng cao cho lồi, đem lại kết khả quan nhằm phân loại, giám định xác định mối quan hệ di truyền, từ góp phần nâng cao hiệu bảo tồn phát triển loài Áo cộc Việt Nam PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất Đối tượng nghiên cứu: Loài Áo cộc thu thập núi Luốt Trường Đại học Lâm nghiệp - Xuân Mai - Chương Mỹ - Hà Nội (hình 1) Hình Ảnh lá, hoa Áo cộc Vật liệu nghiên cứu: Mẫu bánh tẻ Áo cộc, lấy mẫu từ khác Sau thu, mẫu bảo quản túi nilon có chứa hạt silica gel hút ẩm, sau bảo quản -20oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu Kí hiệu mẫu Áo cộc lấy: Ac.1; Ac.2; Ac.3 Trình tự cặp mồi rbcL (rP1F: TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC; rP1R: GTAAAATCAAGTCCACCTCG) với nhiệt độ gắn mồi 52oC; mồi TrnH-psbA (trnPF1: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC; psbPR1: GTTATGCATGACGTAATGCTC) với nhiệt độ gắn mồi 50oC; mồi matK (mP3F: TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC; mP3R: TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT) với nhiệt độ gắn mồi 48oC Cả trình tự mồi rbcL, TrnH-psbA, matK xây dựng dựa đoạn gen thuộc hệ gen lục lạp Hóa chất: Kit tách chiết ADN tổng số (Plant ADN Isolation Kit) hãng Norgen, Canada; hóa chất cho phản ứng PCR nhân đoạn mã vạch ADN: Master mix hãng Intron Biotechnology, Hàn Quốc; Kit tinh sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) Norgen, Canada; Hóa chất cho điện di gel Agarose: Agarose, ADN marker, Redsafe… 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu Áo cộc theo hướng dẫn sử dụng Kit (Plant ADN Isolation Kit) hãng Norgen Nhân đoạn gen rbcL, matK, TrnH-psbA từ mẫu ADN tổng số bẵng kỹ thuật PCR máy PCR 9700, phản ứng PCR thực tổng thể tích 20 μl, bao gồm: H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/µl mồi xi (1,0 µl), 10 pmol/µl mồi ngược (1,0 µl) 50 ng/µl ADN khn (1 µl) Chương trình phản ứng PCR: 95oC phút; (95oC: 30 giây, 48 52oC : 30 giây, 72oC : phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC phút; 4oC Nhiệt độ gắn mồi phản ứng phụ thuộc vào cặp mồi sử dụng Mỗi phản ứng PCR lặp lại lần mẫu thí nghiệm Sản phẩm PCR tinh Kit (PCR Purification Kit) Canada Sau tinh sản phẩm PCR gửi cho phịng thí nghiệm 1st Base Malaysia để giải trình tự Trình tự nucleotide đoạn ADN xử lý, phân tích phần mềm chuyên dụng Bioedit, ADNClub, Biohit, Mega10 Trình tự nucleotide đoạn TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 13 Công nghệ sinh học & Giống trồng gen rbcL, matK TrnH-psbA so sánh Ngân hàng Gen Quốc tế (NCBI) để tìm lồi tương đồng Xây dựng phát sinh chủng loại đoạn gen sử dụng công cụ NCBI KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ Áo cộc ADN tổng số sau tách chiết từ mẫu Áo cộc Kit tách chiết hãng Norgen pha loãng để xác định nồng độ độ tinh Kết xác định nồng độ độ tinh dung dịch ADN tổng số cho thấy, dung dịch ADN tổng số có nồng độ dao động từ - µg/µl; Tỷ số OD260nm/OD280nm khoảng từ 1,7 - 2,05, kết khẳng định tách chiết ADN với nồng độ cao đảm bảo độ tinh Sau đó, tiến hành điện di để kiểm tra nguyên vẹn sản phẩm Kết điện di cho thấy băng ADN sắc nét, khơng có sản phẩm phụ, điều khẳng định ADN tổng số nguyên vẹn, đứt gãy Sản phẩm tách chiết ADN tổng số đảm bảo yêu cầu kỹ thuật làm khuôn cho nhân đoạn ADN quan tâm kỹ thuật PCR Hình Ảnh điện di ADN tổng số mẫu Áo cộc (Ac.1: Áo cộc 1; Ac.2: Áo cộc 2; Ac.3: Áo cộc 3) 3.2 Kết nhân đoạn mã vạch ADN kỹ thuật PCR ADN tổng số tách chiết từ mẫu Áo cộc sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen rbcL, TrnH-psbAvà matK kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Hình Kết PCR đoạn gen trnH-psbA, matK, rbcL Áo cộc Kết PCR sau kiểm tra điện di gel agarose 1% (hình 3) cho thấy, xuất băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước đoạn mã vạch ADN dự kiến Sản phẩm PCR đoạn mã vạch ADN hình cho thấy, khơng có băng ADN phụ xuất hiện, sản phẩn PCR đặc hiệu, sau tinh sử dụng trực tiếp 14 sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.3 Kết xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN 3.3.1 Trình tự ADN đoạn gen matK Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen matK nhân có kích thước 543 bp Kết giải trình tự đoạn gen matK mẫu Áo cộc hình TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng GAAAGAACTTGTTCTTCCTCTGTAAGGAATTCCTCCAAGAATTCTGAACCTAATCGTTT CAAAAAAGCGCGTACCGTACTTTTATGTTTACGAGCCAAAGTTCTAGCACACGAAAGT CGAAGTATATACTTTATTCGATACAAAGTCTGTTTTTTTGAGGATCCACTGTGATAATG AGAAAGATTTCTGTATATCTGCCCAAATCGATTTATAATATCAGAATCTGACGAATCG GCCCGGACCGACTTACTAATGGGATGCCCTGATACGTTACAAAATTTCGCTTTAACCA CTGATCCAATCAGAGAAATAATTGGGACTAGGGTCTCGAATTTATTAATAGAAGTATC TATTAGAAATGAATTCTCTAGCATTTGAATCCTTACCACCGAAGTGTTTAGTCGTACA CTTGAAAGATAGCCCAGAAAATAGAAGGAATGATTGTATAATTGGTTTATATGGATCC TGTCCGGTCGAGACCACAAGTAAAAATGACATTGCCAAAAATTGACAAGGTGAGATT TCCATTTCTTCATCAGAAGA Hình Trình tự ADN đoạn gen matK Trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng với đoạn gen matK loài Áo cộc cách sử dụng cơng cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng với lồi Áo cộc trình bày bảng Bảng Một số lồi có trình tự đoạn gen matK tương đồng với lồi Áo cộc ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Hệ số tương đồng (%) Lirodendron chinense KU170535.1 100,00 Lirodenron tulipifera DQ899947.1 99,26 Magnolia gilbertoi MN990627.1 98,34 Magnolia amazonica MN990631.1 98,16 Sau sử dụng phần mềm Mega X để xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ lồi Áo cộc chúng tơi nghiên cứu với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo phần mềm MegaX TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 15 Công nghệ sinh học & Giống trồng Bằng phần mềm Mega X, nghiên cứu nhận khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác bảng Bảng Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa đoạn trình tự matK Magnolia Magnolia Liriodendron Liriodendron Tên loài Ao coc gilbertoi amazonica tulipifera chinense Magnolia gilbertoi Magnolia amazonica 0,0018 Liriodendron tulipifera 0,0189 0,0209 Liriodendron chinense 0,0170 0,0189 0,0018 Ao coc 0,0170 0,0189 0,0018 0,0000 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen matK kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng loài Áo cộc với loài khác ta thấy: loài Áo cộc nghiên cứu có trình tự gen giống 100% với đoạn gen loài Liriodendron chinense Trung Quốc với khoảng cách di truyền 0.00 (hệ số tương đồng 100%) có quan hệ xa với loài Magnolia amazonica với khoảng cách di truyền 0,0189 (hệ số tương đồng 98,16%) với giá trị bootstrap 100% nói lên độ tin cậy gần gũi thành viên nhóm cao 3.3.2 Trình tự ADN đoạn gen rcbL Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen rbcL nhân có kích thước 676 bp Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu Áo cộc hình GGTGTTTAAGATTATAAACTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTG ATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACTCGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGG GGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGA CTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAACCCGTTGCTGGGG AGACCGATCAATATATTGTTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCT GTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGC TCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCTCCTGCTTATATCAAAACTTTCCAAGGCCCG CCCCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGG GATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCCGCCAAGAACTACGGTAGGGCGGTTTA TGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTACCAAGGATGATGAGAACGTGAACTCCCAA CCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTTATTTTGTGCCGAAGCACTTTATAAAGCGC AGGCCGAAACAGGTGAAATCAAAGGGCATTACTTGA Hình Trình tự ADN đoạn gen rcbL Trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen rbcL lồi Áo cộc cách sử dụng cơng cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với lồi Áo cộc trình bày bảng Bảng Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng với lồi Áo cộc ngân hàng gen NCBI STT 16 Tên loài Liriodendron chinense Liriodendron tulipifera Degeneria vitiensis Magnolia decidua Mã số Hệ số tương đồng (%) KU170538.1 MK477550.1 L12643.1 MN990591.1 99,11 99,11 97,04 96,90 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng Nghiên cứu sử dụng phần mềm Mega X để xây dựng phát sinh chủng loại (hình 7) tìm mối quan hệ loài Áo cộc với loài khác bảng khoảng cách di truyền chúng bảng Bảng Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa đoạn trình tự rbcL Magnolia Liriodendron Liriodendron Degeneria Tên loài Ao coc decidua tulipifera chinense vitiensis Magnolia decidua Liriodendron tulipifera 0,02713 Liriodendron chinense 0,02713 0,00297 Degeneria vitiensis 0,01195 0,02409 0,02409 Ao coc 0,03331 0,00894 0,00894 Bằng phần mềm Mega X nghiên cứu nhận khoảng cách di truyền loài Áo cộc 0,03025 với lồi khác hình Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo phần mềm MegaX Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự đoạn gen rbcL kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng loài Áo cộc với loài khác ta thấy: lồi Áo cộc có quan hệ gen gần với loài Liriodendron chinense, Liriodendron tulipifera với khoảng cách di truyền 0.0084 (hệ số tương đồng 99.11%) xa với loài Magnolia decidua với khoảng cách di truyền 0.03331 (hệ số tương đồng 96,90%) với giá trị bootstrap cao 100% nói lên độ tin cậy gần gũi thành viên nhóm cao 3.3.3 Trình tự DNA đoạn gen TrnH-psbA Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen TrnH-psbA nhân có kích thước 382 bp (kích thước nhỏ so TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 17 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng với kích thước gel PCR sau đọc trình tự nghiên cứu tiến hành xử lý cắt bỏ số đoạn trình tự bị nhiễu đầu đoạn chiều xi chiều ngược trình tự để thu trình tự chuẩn) Kết giải trình tự đoạn gen TrnH-psbA mẫu Áo cộc hình TATTTAAAGGATTCAATTTTCCCCCTTCATGATTTTTTTATTGGGTTTTTTTTTCTTTTTG GGATACAGATTTTGAACATAAAATGCCAATACTGTAAATTGTAAAAGTTCAAAAAAA AATTCCTTTTTGAAAAAAAAAAAAAAGAAAACAATTTTGAGGAACGTACAGAAATTA CAGTACAGATCGGCACAGAACAAAAAAAAAAATAGGATGTTCGATCATGACCCACCC AACAATAATATTTTCTTAATTTGAAAAAAAAAAATGAAAAGGGCAAAAATGTTTATG TGAGTAAAACCCTACGGAATCAAACAAATCAATACCCAACTTCTTCATAAAACAAAA ATTGGGGTATTGATCTGATCCTTCACCGACTCATAT Hình Trình tự ADN đoạn gen TrnH-psbA Trình tự sau xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen TrnH-psbA lồi Áo cộc cách sử dụng cơng cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với lồi Áo cộc trình bày bảng Bảng Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa đoạn trình tự TrnH-psbA STT Tên lồi Liriodendron chinenes Liriodendron tulipifera Ocotea puberula Bằng phần mềm Mega X, nghiên cứu xây dựng phát sinh chủng loại (hình 9) tìm mối quan hệ lồi Áo cộc với loài khác Mã số KU170538.1 MK477550.1 GQ982304.1 Hệ số tương đồng (%) 91,88 89,30 66,00 bảng khoảng cách di truyền chúng bảng Bảng Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự TrnH-psbA Ocotea Liriodendron Liriodendron Tên loài Ao coc puberula tulipifera chinense Ocotea puberula Liriodendron tulipifera 1,0396 Liriodendron chinense 1,0718 0,0242 Ao coc 1,0727 0,1133 0,0876 Bằng phần mềm Mega X chúng tơi nhận khoảng cách di truyền lồi Áo cộc với lồi khác hình Từ phát sinh chủng loại kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng dựa số liệu trình tự đoạn gen TrnH-psbA ta thấy: lồi Áo cộc có quan hệ gen gần với lồi Liriodendron chinense với khoảng cách di truyền 0,0876 (hệ số tương đồng 91,88%) 18 với giá trị bootstrap 77% xa với loài Ocotea puberula với khoảng cách di truyền 1,0727 (hệ số tương đồng 66%) Như vậy, dựa vào phân loại đoạn gen rbcL, matK trnH-psbA cho thấy loài Áo cộc thuộc loài Liriodendron chinense với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen matK, 99,1% đoạn gen rbcL, 92,4% đoạn gen trnH-psbA TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn TrnH-psbA tạo phần mềm MegaX Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcLvà trnH-psbA Áo cộc với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1, ta lập bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA bảng Bảng Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA Tên đoạn gen matK rbcL Số điểm sai khác Kích thước trình tự 543 658 Tỷ lệ sai khác 0% 0,9% Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL trnH-psbA lồi Áo cộc với trình tự gen lồi Liriodendron chinenes cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KU170535.1 : trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA có 29 điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự trnH-psbA cao (7,6%) khả phân biệt loài gen trnH-psbA tốt tỉ lệ sai khác trình tự matK thấp (0%) đồng nghĩa với khả phân biệt loài gen Như vậy, đoạn trnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK rbcL so sánh loài Áo cộc với loài Liriodondren chinense Mặc dù vậy, trnH-psbA 29 382 7,6% cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA để xác định xác lồi cần định danh 3.4 Thảo luận Với thị matK thu kết lồi Áo cộc chúng tơi nghiên cứu giống 100% với lồi Áo cộc Trung Quốc cơng bố ngân hàng gen NCBI có sai khác nhỏ với loài Liriodendron tulipifera Tuy nhiên lại sai khác nhiều so với loài Magnolia pacifica Điều phù hợp với phân loại hình thái thực Yongda Zhong cộng (2018) loài Liriodendron tulipifera, ta thấy lồi có đặc điểm hình thái hoa giống nhau, nhiên lồi L chinense có kích thước lớn hơn, nét cắt TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 19 Công nghệ sinh học & Giống trồng thùy sâu so với lồi Áo cộc hoa lồi Áo cộc có màu cam lồi L.chinense có màu xanh lục vàng nhạt Với thị phân tử rbcL trnHpsbA chúng tơi nhận lồi Áo cộc có quan hệ gần với loài Liriodendron chinense, với khoảng cách di truyền 0,00894 0,0876 Như với thị cho thấy loài Áo cộc nghiên cứu lấy Việt Nam có sai khác với loài Áo cộc nhận ngân hàng gen quốc tế NCBI Dựa vào kết so sánh đặc điểm hình thái với so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA loài Áo cộc, ta thấy rằng: Để định danh cho lồi Áo cộc chúng tơi sử dụng đoạn gen matK với tỷ lệ tương đồng 100% với L chinense Để phân biệt loài nghiên cứu sử dụng đoạn gen trnH-psbA với tỷ lệ sai tương đồng 92,4% với L chinense KẾT LUẬN Các vùng gen rbcL, matK, trnH-pbsA giải trình tự nucleotide với kích thước sau: đoạn rbcL có kích thước 658 bp, đoạn matK có 543 bp đoạn TrnH-psbA có 382 bp So sánh trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN (rbcL, matK, TrnHpsbA) loài Áo cộc với trình tự nucleotide đoạn mã vạch tương ứng loài khác NCBI ra: loài Áo cộc thuộc loài L.chinense với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen matK, 99,1% đoạn gen rbcL, 92,4% đoạn gen trnH-psbA với giá trị bootstrap cao 100% Như vậy, kết so sánh đoạn (rbcL, matK TrnHpsbA) với lồi L chinense chúng tơi tìm được: Để định danh cho lồi Áo cộc chúng tơi sử dụng đoạn gen matK, để phân biệt loài chúng tơi sử dụng đoạn gen trnH-psbA đoạn TrnH-psbA có khả phân biệt loài cao so với đoạn rbcLvà matK Tuy nhiên, xác nên sử dụng thị để định danh loài Áo cộc Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Anders R., (2012) ADN barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case 20 study on medicinal roots traded in the medina of Marrakech M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure Alvarez I.W.J.F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K, Kevin S Burgess, Prasad R Kesanakurti, Sean W Graham, Steven G Newmaster, Brian C Husband, Diana M Percy, Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H Barrett (2008) Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well PLoS ONE 3(7): e2802 "AGM Plants - Ornamental" (PDF) Royal Horticultural Society July 2017 p 60 Retrieved 25 March 2018 Xia Nianhe; Liu Yuhu; Liu Yuhu; Hans P Nooteboom "Liriodendron chinense" Flora of China Missouri Botanical Garden, St Louis, MO & Harvard University Herbaria, Cambridge, MA Retrieved 25 May 2012 Chase M.W, Salamin N., Wilkinson M., Dunwell J.M., Kesanakurthi R.P., Haider N., Savolainen V (2005) Land plants and DNA barcodes: Short-term and long-term goals Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360:1889-1895 Chen S.Y.H, Han J., Liu C., Song J., shi L., Zhu Y., Ma X., Gao X., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcodes for identifying medicinal plant species Plos one 5: e8613 Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N.,Haider N., Stahl J.V.A., Kelly L.J., Wikström N., Hollingsworth P.M., Duff R.J., Hoot S.B., Cowan R.S., Chase M.W., Wilkinson M.J (2009) Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on ADN plants Botanical Journal of the Linnean Society 159 (1): 1-11 Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H (2005) Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci U.S.A 102 (23): 8369 - 74 10 Phan, K.L (2015) "Liriodendron chinense" IUCN Red List of Threatened Species 2015: e.T31284A2803363 doi:10.2305/IUCN.UK.20152.RLTS.T31284A2803363.en 11 Von Cräutlein M Pietiläinen M., Korpelainen H., Rikkinen J (2011) DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity Biodiversity and conservation 20: 373-389 12 Yongda Zhong, Aihong Yang, Shujuan Liu, Lipan Liu, Yanqiang Li, Zhaoxiang Wu and Faxin Yu (2018) “RAD-Seq Data Point to a Distinct Split in Liriodendron (Magnoliaceae) and Obvious East–West Genetic Divergence in L chinense” Forests.10,13.doi:3390 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng STUDY ON IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE OF Liriodendron chinense TO IDENTIFY PLANT SPECIES Bui Thi Mai Huong1, Nguyen Van Phong1 Vietnam National University of Forestry SUMMARY Liriodendron chinense is a species of high economic value with ornamental plant and good wood Nowaday, these species are being threatened and listed of species are still facing extinction because reproductive efficiency is low Therefore, it is necessary to identify DNA barcode fragments of Liriodendron chinense for species identification The genomic DNA was extracted from leaf tissue of Liriodendron chinense The DNA barcodes (rbcL, matK and TrnH-psbA) were amplified from total DNA of Liriodendron chinense by PCR technique The PCR results indicated that all DNA bands have a size similar to the theoretical size of rbcL, matK and TrnH-psbA fragments Nucleotide sequencing results of PCR products showed that the size of the isolated rbcL fragment is 658 nucleotide, matK fragment is 543 nucleotide and trnH-psbA fragment is 382 nucleotide After that, these sequences were compared with Liriodendron chinense species in NCBI and the results indicated that: matK gene fragment is similar to 100% with Liriodendron chinense species, rbcL gene fragment is similar to 99.1% with Liriodendron chinense species, TrnH-psbA gene fragment is similar to 92.4% with Liriodendron chinense species Finally, in three of gene fragment: matK, rbcL, TrnH-psbA we found that It is best for using TrnH-psbA molecular marker as DNA barcode to identify Liriodendron chinense in Vietnam Keywords: DNA barcoding, identify species, Liriodendron chinense, phylogenetic tree Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng : 15/9/2020 : 16/11/2020 : 25/11/2020 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 21 ... điện di ADN tổng số mẫu Áo cộc (Ac.1: Áo cộc 1; Ac.2: Áo cộc 2; Ac.3: Áo cộc 3) 3.2 Kết nhân đoạn mã vạch ADN kỹ thuật PCR ADN tổng số tách chiết từ mẫu Áo cộc sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen... vạch ADN (rbcL, matK, TrnHpsbA) lồi Áo cộc với trình tự nucleotide đoạn mã vạch tương ứng loài khác NCBI ra: loài Áo cộc thuộc loài L.chinense với tỷ lệ tương đồng 100% đoạn gen matK, 99,1% đoạn. .. mềm Mega X, nghiên cứu nhận khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác bảng Bảng Bảng so sánh khoảng cách di truyền loài Áo cộc với loài khác ngân hàng gen quốc tế NCBI dựa đoạn trình tự