Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài lan kim tuyến anoectochilus formosanus hayata

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chuyên đề này, em xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Thị Thơ cố vấn học tập tận tình giúp đỡ em hồn thành tốt khóa học, hƣớng dẫn giúp đỡ em trình nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô anh chị làm việc công tác Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình học tập Cuối tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ủng hộ động viên tinh thần để tơi hồn thành báo cáo Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Lê Công Mạnh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lan kim tuyến 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Lan kim tuyến 1.1.2 Đặc điểm hình thái sinh trƣởng 1.1.3 Giá trị dƣợc liệu Lan kim tuyến 1.2 Tổng quan mã vạch ADN (DNA barcode) 1.3 Những locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp ADN mã vạch thực vật 12 1.3.1 Trình tự gen nhân 12 1.3.2 Trình tự gen lục lạp 12 1.3.3 Trình tự gen rbcL 12 1.3.4 Trình tự gen matK 13 1.3.5 Trình tự gen ycf5 13 1.3.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 13 1.3.7 Trình tự hai gen trnH-psbA 14 1.3.8 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) 14 1.3.9 Vùng gen mã hóa ribosome 15 1.4 Ứng dụng lợi ích mã vạch ADN 15 1.5 Ứng dụng mã vạch ADN dƣợc liệu 17 1.6 Tình hình nghiên cứu ADN barcode thực vật 19 1.7 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN Lan kim tuyến 20 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.2 Nội dung nghiên cứu tách chiết 23 2.3 Địa điểm thực 23 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 23 2.4.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 ii 2.4.2 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Tách chiết ADN tổng số 24 2.5.2 Kỹ thuật PCR 25 2.5.3 Tinh sản phẩm PCR 26 2.5.4 Giải trình tự gen 27 2.5.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết AND tổng số 28 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 28 3.2.1 Kết nhân đoạn gen matK 29 3.2.2 Kết nhân đoạn gen rbcL 29 3.2.3 Kết nhân đoạn gen trnH-psbA 30 3.2.4 Kết nhân đoạn gen ITS2 31 3.3 Phân tích kết 31 3.3.1 Xác định, phân tích trình tự gen 31 3.3.2 So sánh khả phân biệt trình tự matK, rbcL ITS2 mẫu LKT với loài A albolineatus 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Tồn 44 4.3 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Việt Các từ viết tắt bp Cặp base CBOL Tổng hợp mã vạch sống cpDNA gen lục lạp Cytb Cytochrome b DNA (ADN) Axit deoxyribonucleic EDTA axit ethylenediamine tetraacetic F-Primer Mồi xuôi IGS vùng liên gen ITS vùng DNA nằm gen kb 1000 cặp base NCBI Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Phản ứng chuỗi polymerase PVP Polyvinyl pyrrolidone R- Primer Mồi ngƣợc RAPD Sự khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình RFLP Phân tích đa hình trình tự DNA RNA Axit ribonucleic rRNA ARN ribosome LKT Mẫu Lan kim tuyến TAE Tris-Acetate-EDTA tRNA ARN vận chuyển UV Tia cực tím iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 3.1: Kết so sánh trình tự đoạn gen matK mẫu lan kim tuyến nghiên cứu với số loài Ngân hàng gen 32 Bảng 3.2: Các vị trí sai khác vùng gen matK lan kim tuyến với mã gen khác 36 Bảng 3.3: Kết so sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu lan kim tuyến nghiên cứu với số loài Ngân hàng gen 37 Bảng 3.4: Các vị trí sai khác vùng gen rbcL lan kim tuyến với mã gen khác ngân hàng gen 39 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với trình tự gen ITS2 mẫu LKT ngân hàng gen NCBI 40 Bảng 3.6: Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng gen ITS2 41 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự 42 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thân ngầm thân khí sinh Lan kim tuyến Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK: 29 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcL: 30 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen trnH-psbA: 30 Hình 3.5 Sản phẩm PCR đoạn gen ITS2: M: marker; LKT 31 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự đoạn gen matK lan kim tuyến NC với mã gen khác NCBI 34 Hình 3.7 Kết so sánh trình tự nucleotit đoạn gen rbcL mẫu LKT với loài loài khác ngân hàng gen 39 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự gen ITS2 mẫu LKT với trình tự gen ngân hàng gen 42 Hình 3.9: Cây phát sinh lồi dựa đoạn gen ITS2 43 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) thuộc họ Lan (Orchidaceae), có tác dụng việc điều trị chứng bệnh đau bụng, tiểu đƣờng, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dƣơng, rối loạn gan, lách chứng đau nhói ngực (Lin, 2007) Chi Anoectochilus Cây Lan kim tuyến thuộc loại dƣợc liệu, nhóm 3A, đƣợc liệt vào sách đỏ Việt Nam năm 2016 Lan kim tuyến, hay đƣợc gọi với tên khác, nhƣ: lan gấm, kim cƣơng, kim tuyến liên, thạch tằm… loại dƣợc liệu quý Có khoảng 30-40 loài, loài Lan kim tuyến phân bố khu vực rộng, từ vùng Himalaya đến Đông Nam Á, miền Nam Trung Hoa, Úc, papua New Guinea số hải đảo thuộc Thái Bình Dƣơng Ở Việt Nam, thơng kê đƣợc 12 lồi, phân bố chủ yếu Lào Cai (Sapa, Văn Bàn), Hà Tĩnh (Hƣơng Sơn), Quảng Trị, Kon Tum (núi Ngọc Linh, núi Chƣ Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông), Lâm Đồng (núi Bidoup),(Nguyễn Tiến Bân, 2005) Do có nhiều tác dụng quý giá nên loài Lan kim tuyến đƣợc thu mua với giá cao Hiện Lan kim tuyến tự nhiên bị suy giảm bị khai thác tận diệt nên đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng EN A1a, c,d, bị cấm khai thác sử dụng mục đích thƣơng mại [1], [2] Do đặc điểm bên loài lan giống nên để phân loại chủ yếu dựa vào hoa Trong tự nhiên, loài Lan kim tuyến có số lƣợng khơng nhiều, mọc rải rác, khả tái sinh thấp, hoa, việc phân loại lồi lan hình thái khó Sử dụng thị ADN cho phép phân loại xác lồi thực vật có mối quan hệ gần gũi cách nhanh chóng xác vào giai đoạn phát triển Các gen dùng làm thị ADN barcode đƣợc nhiều nhà khoa học sử dụng việc phân loại thực vật Hiện nay, nhiều vùng gen đƣợc nghiên cứu để làm thị ADN cho thực vật, nhƣng cần nhiều vùng ADN thị để phân loại xác lồi thực vật (Chase et al., 2007; Kress and Erickson, 2008) Gen matK ADN lục lạp thị đƣợc sử dụng nghiên cứu biến đổi phạm vi loài mức độ thấp (Aoki and Ito, 2000; Soltis et al, 2001) Gen psbA ADN lục lạp thị DNA đƣợc sử dụng có hiệu việc phân tích mối quan hệ di truyền cá thể loài (Kress et al., 2005) Tiểu đơn vị lớn rbcL trình tự đƣợc sử dụng để phân biệt, nhân biết nguyên liệu thảo dƣợc với loài giả mạo Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata)” nhằm góp phần cung cấp thơng tin sở liệu cho việc xác định xác lồi cấp độ phân tử CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lan kim tuyến 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Lan kim tuyến Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) cịn đƣợc gọi lan trang sức vẻ đẹp hấp dẫn nó, đƣợc Carlvon Blume mơ tả năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae Trên giới thống kê đƣợc 51 loài Ở Việt Nam thống kê đƣợc 12 lồi, lồi Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) đƣợc biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales) Đây lồi đơn thân, mọc đất, có thân rễ mọc dài; thân đất mọng nƣớc có nhiều lơng mềm, mang - mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần trịn gốc, chóp nhọn có mũi ngắn, cỡ - x -3 cm, mặt màu nâu thẫm có vệt vàng màu hồng nhạt gân, mặt dƣới màu nâu nhạt Cuống dài - cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang - 10 hoa mọc thƣa Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thƣờng màu trắng, dài 2,5 - cm; môi dài đến 1,5cm, bên gốc mang - dải hẹp, chẻ đôi thành thuỳ hình thn trịn Bầu dài 13mm, có lơng thƣa Mùa hoa tháng 2, tháng Tái sinh chồi từ thân rễ hạt ít, sinh trƣởng chậm Là loại ƣa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thƣờng mọc dƣới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới độ cao 500 - 1600m Mọc rải rác vài ba đất ẩm, giàu mùn rụng Chúng sinh sống triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dƣới tán to rừng ẩm độ cao 500-1.600 mét Cây ƣa độ ẩm cao ƣa bóng râm, kỵ ánh sáng, u cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thống khí Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội, (Mỹ Đức: Chùa Hƣơng), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Trên Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonesia,  Phân bố theo kiểu rừng Kết điều tra rằng, Lan kim tuyến hầu hết phân bố kiểu rừng kín rộng thƣờng xanh nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thƣờng có tầng gỗ Đơi gặp Lan kim tuyến kiểu rừng kín rộng thƣờng xanh mƣa mùa nhiệt đới - Tầng ƣu sinh thái A2: Độ tán che thƣờng từ 85-90%, với loài gỗ chủ yếu nhƣ: Chắp tay bắc (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích loại (Acer spp), Trƣơng vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilusodoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Cơm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), v.v Chiều cao tầng A2 từ 15-25 m - Tầng gỗ A3: Bao gồm loài tầng cịn nhỏ lồi tầng dƣới nhƣ: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà gân (Lindera sp.), phân mã tuyến (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Rè hƣơng (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v Chiều cao tầng A3 từ 8-15m - Tầng bụi B: Gồm loài thực vật nhƣ Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v… - Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu loài Thƣờng sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp), Gừng (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dị (Costus speciosus), Mía dị bắc (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp), Cỏ tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lịng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v… CAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTTGGTTCCTACATAATTTTTATGTA TATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAAATTCTTCTTATT TACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGA TTCTCTGGTTCCTCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAG GAAAAGTAATTCTGACTTCAAAGGTAACTCTTATTCTGATGAAGAAA TGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATTTTCACTTTTGGT CTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAA GAAATCAAATGCTAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAG AAATTAGATACCGTAGCCCCAGTTATTTCTCTTATTGGATCATTGTCG AAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTAGTAAACCCATT TGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGGAAA TGTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGT TTTGTATCGTATAAAATATATATT Trình tự nucleotit đoạn gen matK thu đƣợc đƣợc so sánh với trình tự loại khác thuộc chi Anoectochilus loài thuộc chi Ludisia - chi có đặc điểm hình thái giống với lồi chi Anoectochilus (bảng 3.1.) nhờ cơng cụ BLAST NCBI Clustal Omega EMBL-EBI Kết đƣợc thể bảng 3.1 hình 3.6 Bảng 3.1: Kết so sánh trình tự đoạn gen matK mẫu lan kim tuyến nghiên cứu v i số loài Ngân hàng gen STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tƣơng đồng (%) Anoectochilus formosanus EU797513.1 99,87 Anoectochilus roxburghii KY966708.1 99,75 Anoectochilus koshunensis EU797512.1 99,62 Anoectochilus albolineatus JN166018.1 98,98 Anoectochilus lylei JN166019.1 98,72 Anoectochilus elatus KU687098.1 98,95 Ludisia discolor KY966902.1 97.72 32 AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA CCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA CCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGA **************************************************** GTATCATTACTTCAAAGAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGATTTTTTT GTATCATTACTTCAAAGAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGATTTTTTT GTATCATTACTTCAAAGAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGATTTTTTT GTATCATTACTTCAAAGAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGATTTTTTT GTATCATTACTTCAAATAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTT GTATCATTACTTCAAATAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTT GTATCATTACTTCAAATAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTT GTATCATTACTTCAAATAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTT ***************************************************** ***** GGCTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTTTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA GGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAA *********************************************************** AGTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTCATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG ATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATG * ****************************************************** ** TAAAAATGGAATCTATTTTAGTAGTGTATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGCTCC TAAAAATTGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCCGGTTCC TAAAAATTGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC TAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCC ****** ********* ******* ***************************** *** TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGTAATTCTGGCTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAATAATTCTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAGGTAATTTTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAATAATTCTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGG-AAAGTAATTCTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGTAATTCTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGTAATTCTGACTTCAAAGG TCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGTAATTCTGACTTCAAAGG ************************************ ********************** GAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGGCAATTTTATT GAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT GAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT GAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT TAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT TAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT TAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT TAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCAATTTTATT ************************************************ ********* TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT 33 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT AJ543911.1 KU687098.1 JN166019.1 JN166018.1 EU797512.1 KY966708.1 EU797513.1 LKT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACTTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT TTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCT ****************** **************************************** CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC CTTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGC *********************************************************** TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCGTAGCCCCAGTTA TAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCGTAGCCCCAGTTA ********************************************** ************ TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCGGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCGGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCGGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTA TTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTA ********************************************** ************* GTAAACCAATTTGGACCGATTTATCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTTTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCTATTTTGTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTTTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCAATTTTGTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCAATTTTGTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGGAAAT GTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGGAAAT ******* ******* ***** ********************** ***** ******** GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAA GTAAAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA GTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAA ******************************************* AATATATA AATATATATAATATATATAATATATATT AATATATATT AATATATATT AATATATATT Hình 3.6 Kết so sánh trình tự đoạn gen matK lan kim tuyến NC v i mã gen khác NCBI 34 Sử dụng đoạn trình tự nghiên cứu với kích thƣớc 790 bp đem so sánh với mã hiệu gen loài ngân hàng gen (bảng 3.1) nhận thấy từ vị trí thứ đến vị trí 763 có mức độ tƣơng đồng cao với mã gen lại Vì vậy, chúng tơi sử dụng đoạn trình tự để so sánh phân tích Cụ thể trình tự gen mẫu lan kim tuyến có 18 điểm sai khác so với mã gen so sánh (gồm mã gen thuộc loài chi mã loài thuộc chi gần gũi) chi tiết nhƣ bảng 3.2 Trong số 18 điểm khác biệt trên, có điểm sai khác mẫu lan kim tuyến nghiên cứu với lồi chi Anoectochilus (vị trí: 114, 248, 338, 361, 439, 588, 647, 706 712) Điều cho thấy, đoạn gen matK nhân đƣợc có mức độ đa hình cao khơng sử dụng làm mã vạch để phân biệt loài thuộc chi Anoectochilus chi Ludisia mà cịn sử dụng để phân biệt loài thuộc chi Anoectochilus Mặt khác, mẫu lan kim tuyến nghiên cứu có khác biệt nhỏ với trình tự matK A formosanus mã hiệu EU797513.1, vị trí 439 (nhƣ bảng 3.2) Nhƣ vậy, loài, xuất xứ khác có khác biệt nhỏ cấu trúc gen matK Nhƣ vậy, kết luận đoạn gen matK đƣợc sử dụng làm mã vạch loài Anoectochilus formosanus 35 Bảng 3.2: Các vị trí sai khác vùng gen matK lan kim tuyến v i mã gen khác Loài Vị tr sai khác Mã số LKT 114 182 237 248 258 266 297 338 361 410 439 588 647 668 677 683 706 712 A T T G C A T A T T C G A C T T G G A formosanus EU797513.1 A T T G C A T A T T T G A C T T G G A roxburghii KY966708.1 A T T G C A T A T T C A A C T T A G A koshunensis EU797512.1 A T T G C A T _ T T C A A C T T A G A JN166018.1 albolineatus T T T T C A T A G T C A G C T T G T A lylei JN166019.1 T T T G C A T A G T C A G C T T T G A elatus KU687098.1 T T T T C A T A G T C A G C T T G T L discolor AJ543911.1 T G C G T G C A G G C A A A C A G G 36 3.3.1.2 Trình tự gen rbcL Sau phân tích so sánh trình tự nucleotit đoạn gen rbcL phần mềm Bioedit công cụ BLAST chúng tơi thu đƣợc đoạn gen có kích thƣớc 523 bp có chất lƣợng tốt Vì chúng tơi sử dụng trình tự trình tự cho bƣớc phân tích Kết đoạn gen rbcL mẫu LKT nhƣ sau: AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACG AAACCAAAAGTACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAA CCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGCGCTGCGGTAGCAGCCGAAT CTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGT CTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGG GGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTT TGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGT TTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAAT TCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGCATCCA AGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGAT GTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGA GCGTAGAATG Trình tự nucleotit thu đƣợc chúng tơi tiến hành so sánh với trình tự gen rbcL bốn loài chi Anoectochilus lồi thuộc chi Ludisia NCBI (có mã hiệu đƣợc thể bảng 3.3) Bảng 3.3: Kết so sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu lan kim tuyến nghiên cứu v i số loài Ngân hàng gen STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tƣơng đồng (%) Anoectochilus emeiensis LC057212.1 100 Anoectochilus elatus KU687104.1 99,81 Anoectochilus qeniculatus JN166036.1 99,81 Anoectochilus albolineatus JN166035.1 99,43 Ludisia discolor MH749095.1 99,43 37 MH749095.1 AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 JN166035.1 AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 LC057212.1 AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 LKT AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 KU687104.1 AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 JN166036.1 AGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAAGTAC 60 ********************************************************************************* MH749095.1 TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 JN166035.1 TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTMACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 LC057212.1 TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 LKT TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 KU687104.1 TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 JN166036.1 TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG 120 ********************************* *********************************************** MH749095.1 CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACT 180 JN166035.1 CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACARCTGTGTGGACTGATGGACT 180 LC057212.1 CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACT 180 LKT CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACT 180 KU687104.1 CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACT 180 JN166036.1 CGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACT 180 ****************************************************** ************************** MH749095.1 TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 JN166035.1 TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 LC057212.1 TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 LKT TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 KU687104.1 TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 JN166036.1 TACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGA 240 ********************************************************************************** MH749095.1 AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 JN166035.1 AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 LC057212.1 AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 LKT AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 KU687104.1 AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 JN166036.1 AAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC 300 ****************************************************************************** MH749095.1 TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 JN166035.1 TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 LC057212.1 TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 LKT TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 KU687104.1 TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 JN166036.1 TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACG 360 ******************************************************************************* MH749095.1 TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 JN166035.1 TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 LC057212.1 TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 LKT TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 38 KU687104.1 TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 JN166036.1 TCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGG 420 **************************** ************ ************************************* MH749095.1 CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 JN166035.1 CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 LC057212.1 CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 LKT CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 KU687104.1 CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 JN166036.1 CATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT 480 ******************************************************************************** MH749095.1 TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTCGAGCG - 523 JN166035.1 TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCG - 523 LC057212.1 TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCG - 523 LKT TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGTAGAATG KU687104.1 TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCG - 523 JN166036.1 TAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCG - 523 530 ************************************************ Hình 3.7 Kết so sánh trình tự nucleotit đoạn gen rbcL mẫu LKT v i loài loài khác ngân hàng gen Bảng 3.4: Các vị trí sai khác vùng gen rbcL lan kim tuyến v i mã gen khác ngân hàng gen Loài Vị tr sai khác Mã số LKT 85 161 383 A G A A emeiensis LC057212.1 A G A A elatus KU687104.1 A G C A.qeniculatus JN166036.1 A G C A albolineatus JN166035.1 M R C L discolor MH749095.1 A A C Dựa vào kết phân tích so sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu LKT với loài chi loài thuộc chi Ludisia đƣợc thể hình 3.7 bảng 3.4 cho thấy: khơng có nhiều điểm sai khác lồi đƣợc so sánh với 39 mẫu LKT Cụ thể: Đối với lồi A emeiensis khơng tìm thấy khác biệt 521 nucleotit đƣợc so sánh Ba lồi cịn lại chi Anoectochilus có mức độ tƣơng đồng cao dao động từ 99,43-99,81% Trong đó, ba lồi khác mẫu LKT nghiên cứu vị trí nu thứ 383: mẫu LKT A, ba lồi cịn lại C Riêng lồi A albolineatus có hai vị trí thứ 85 161 chƣa xác định đƣợc loại nucleotit xác mẫu LKT nghiên cứu nucleotit loại A Nhƣ vậy, với điểm sai khác nhƣ khẳng định đoạn gen rbcL nhân đƣợc có ý nghĩa phân định loài thuộc chi Anoectochilus 3.3.1.3 Kết so sánh trình tự gen ITS2 Sau xử lý trình tự gen thu đƣợc phần mềm Bioedit công cụ BLAST, chúng tơi có đoạn gen ITS2 với kích thƣớc 327 bp có chất lƣợng tốt Trình tự đoạn gen ITS2 mẫu LKT nghiên cứu nhƣ sau: AATCTTTGACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGC ACGTCCGCCTGGGCGTCAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAAT TGCCCAGTATTGTGCTGTGGTGCTGGTCTGAATGCGGAGAGTGGCCC TTCGTGCACACTTGTGCGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTTCCTCTG GCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTTGGCCCACAC TATCATCTCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCGTGGCTG ATCACCCGATATAAATGTCGCAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCCA GGATGGGCG Trình tự đƣợc xử lý, so sánh với trình tự gen tƣơng ứng lồi có mã hiệu nhƣ bảng 3.5 thông qua công cụ BLAST Clustal Omega thu đƣợc kết thể bảng 3.6 hình 3.8 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng v i trình tự gen ITS2 mẫu LKT ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Anoectochilus lylei JN166060.1 Tỷ lệ tƣơng đồng (%) 99,69 Anoectochilus formosanus GQ396668.1 99,69 Anoectochilus koshunensis EU700340.1 99,39 Anoectochilus albolineatus JN166058.1 98,78 40 Dựa vào bảng 3.5 ta thấy trình tự gen ITS2 mẫu LKT mà chúng tơi nhân đƣợc có mức độ có mức độ tƣơng đồng với lồi chi cao dao động từ 98,78 - 99,69% Sự khác biệt cụ thể vị trí: Bảng 3.6: Các vị tr sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng gen ITS2 Vị tr sai khác STT Tên loài Mã hiệu LKT 10 112 221 231 273 - G C T G A albolineatus JN166058.1 A T T A G A lylei JN166060.1 A T C T G A.formosanus GQ396668.1 A T C T G A.koshunensis EU700340.1 A T C T A Từ bảng 3.6 ta thấy mẫu LKT nghiên cứu có vị trí sai khác mã hiệu gen so sánh lồi Trong lồi A formosanus mẫu LKT có vị trí sai khác vị trí 10 112, vị trí 10 mẫu LKT nucleotit cịn vị trí 112 thay nucleotit T G Nhƣ vậy, ITS2 dùng để phân biệt xuất xứ A formosanus với Đối với mức độ lồi, mẫu LKT nghiên cứu có khác biệt với loài A albolineatus vị trí (10, 112, 221, 231), với lồi A.koshunensis có khác biệt vị trí (số 10, 112 273) với lồi A lylei có sai khác hai vị trí số 10 112 Như vậy, với phân tích ta thấy dùng ITS2 để phân biệt mức độ loài loài chi Anoectochilus LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 AATCTTTGA-CGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGT AATCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGT AATCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGT AATCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGT AATCTTTGAACGCAAGTTGCGCCTGAGGCCAATTGGCTAAGGGCACGTCCGCCTGGGCGT ********* ************************************************** LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 CAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAATTGCCCAGTATTGTGCTGTGGTGCTGGTCT CAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAATTGCCCAGTATTTTGCTGTGGTGCTGGTCT CAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAATTGCCCAGTATTGTGCTGTGGTGCTGGTCT CAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAATTGCCCAGTATTGTGCTGTGGTGCTGGTCT CAAGCATTACATCGCTTCATTCGACACCAATTGCCCAGTATTGTGCTGTGGTGCTGGTCT ****************************************** ***************** LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 GAATGCGGAGAGTGGCCCTTCGTGCACACTTGTGCGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTT GAATGCGGAGAGTGGCCCTTCGTGCACACTTGTGTGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTT GAATGCGGAGAGTGGCCCTTCGTGCACACTTGTGCGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTT GAATGCGGAGAGTGGCCCTTCGTGCACACTTGTGCGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTT GAATGCGGAGAGTGGCCCTTCGTGCACACTTGTGCGACGGGTTGAAGAACAATTTGCTTT ********************************** ************************* 41 LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 CCTCTGGCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTTGGCCCACACTATCATC CCTCTGGCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTAGGCCCACACTATCATC CCTCTGGCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTTGGCCCACACTATCATC CCTCTGGCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTTGGCCCACACTATCATC CCTCTGGCCATGTTTTGATAAAGGGGTGGTGTATGCAGCCATTTGGCCCACACTATCATC ******************************************* **************** LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 TCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCGTGGCTGATCACCCGATATAAATGTCG TCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCGTGGCTGATCACCCGATATAAATGTCG TCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCGTGGCTGATCACCCGATATAAATGTCG TCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCGTGGCTGATCACCCGATATAAATGTCG TCATTGCCTTGAGGAGGATAAATGTACACATTCATGGCTGATCACCCGATATAAATGTCG ********************************* ************************** LKT JN166058.1 JN166060.1 GQ396668.1 EU700340.1 CAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCCA CAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCCCAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCCCAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCCCAGGTGACGCCCTGAAATGCGACCCC************************** Hình 3.8 Kết so sánh trình tự gen ITS2 mẫu LKT v i trình tự gen ngân hàng gen Trong trình nghiên cứu nhân thành công vùng gen trnH-psbA Tuy nhiên, kết giải trình tự chƣa đƣợc tốt nên chúng tơi khơng tiếp tục phân tích sâu kết đoạn gen 3.3.2 So sánh khả phân biệt trình tự matK, rbcL ITS2 mẫu LKT với loài A albolineatus Dựa vào kết trên, ta so sánh đƣợc tỷ lệ sai khác khả phân biệt trình tự gen matK, rbcL ITS2 mẫu LKT với loài A albolineatus qua bảng 3.7 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL ITS2 n đoạn gen Số điểm sai khác Kích thƣớc đoạn gen Tỷ lệ sai khác matK rbcL ITS2 790 521 327 0,76% 0,58% 1,22% Trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL có điểm sai khác, trình tự gen ITS2 có điểm sai khác Tỷ lệ sai khác đoạn gen ITS2 1,22% - giá trị cao Do khả phân biệt đoạn gen ITS2 mức lồi tốt Cịn tỷ lệ sai khác đoạn gen rbcL ( 0,58%) đạt mức thấp cho khả phân biệt lồi đoạn trình tự gen 42 Nhƣ vậy, ba trình tự gen matK, rbcL ITS2 nghiên cứu có giá trị làm ADN mã vạch cho lồi Anoectochilus formosanus Hình 3.9: Cây phát sinh loài dựa tr n đoạn gen ITS2 43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tách chiết đƣợc ADN tổng số mẫu LKT (Anoectochilus formosanus) - Nhân thành công đoạn gen matK, rbcL, ITS2 mẫu LKT - Xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL, ITS2 mẫu LKT - Kết luận sơ bộ: ba đoạn gen matK, rbcL, ITS2 có giá trị cho việc phân biệt mức loài chi Anoectochilus 4.2 Tồn Do thời gian kinh phí có hạn nên chúng tơi chƣa có điều kiện thực lặp lại nhiều lần số vùng gen nghiên cứu chƣa đủ lớn 4.3 Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành nhân giải trình tự gen để khẳng định cách xác trình tự gen làm sở xây dựng mã vạch ADN cho loài A formosanus - Nghiên cứu tiếp chuỗi ADN lục lạp khác, kết hợp với số gen nhân khác để có sở liệu hoàn chỉnh loài A formosanus 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, 2005 Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Hiền (2017), “phƣơng pháp phân lập đọc trình tự gen ITS lồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume ), Thanh Hóa”, Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Hồng Đức, S 35 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dƣơng, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã Đình Mỡi, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (2003), “Tách dịng xác định trình tự gen 18S rRNA Bình vơi”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1, pp 203-209 Đinh Đồn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Hồng La Việt (2017), “DNA barcoding nhân nhanh In vitro Dendrobium transparens Wall.ex Lindl”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology Vũ, Huyền Trang, Chu, Hồng Hà, Hồng, Đăng Hiếu, Phạm, Bích Ngọc, Lâm, Đại Nhân, Trƣơng, Nam Hải (2013), “Nghiên cứu sử dụng thị DNA mã vạch nhận dạng loài Lan kim tuyến (Anoectochilus roxurghii)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, tập 11, số 1, tr 121-129 Đỗ Thị Gấm, Hồng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2017), “phân tích quan hệ di truyền số lồi lan Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết sử dụng số chuỗi gen lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ lâm nghiệp”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5, pp 77-83 Mỹ hoa, Nghiên cứu nhân nhanh invitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghi Wall) nhằm bảo tồn nguồn dƣợc liệu quý 10 Bộ Khoa học Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007 Tài liệu tiếng anh 11 Cui SC, Yu J, Zhang XH, Cheng MZ, Yang LW, Xu JY (2013) Antihyperglycemic and antioxidant activity of water extract from Anoectochilus roxburghii in experimental diabetes Exp Toxicol Pathol 65(5):485–488 45 12 Tongwei Lv, Renda Teng, Qingsong Shao, Hongzhen Wang, Wangshu Zhang, Mingyan Li, Lili Zhang (2015) “DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants” 13 He CN, Wang CL, Guo SX, Xiao PG (2004) Advances on chemical compositions and pharmacological studies of Anoectochilus Blume (Orchidaceae) Chin Pharm J 39(2):81–84 14 Hebert PDN, Gregory TR (2005) The promise of DNA barcoding for taxonomy Syst Biol 54(5):852–859 15 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Use DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci USA 102 (23): 8369 16 Luo AX, Meng ZX, Chen XM, Guo SX (2012) Seed germination and young seedling propagation of Anoectochilus roxburghii, China Pharm J 47(15):1199–1203 17 Miller SE (2007)DNA barcoding and the renaissance of taxonomy Proc Natl Acad Sci USA 104(12):4775–4776 18 Stoeckle M (2003) Taxonomy, DNA, and the barcode of life Bioscience 53:796–797 19 Zheng C, Huang YZ, Pan X, Ji LF (1997) Pharmacognostical identification of Anoectochilus roxburghii Chin Herb Med 20(11):552–554 20 Hilu K W., L.H (1997), “The matK gene: sequence variation and application in plant systematics”, American Journal of Botany, 84, pp 830-839 21 Group, C.P.W (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106, pp 2794-12797 22 Gao T., S.Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Et Al (2011), “Identification of Fabaceae plants using the DNA barcode matK”, Planta Medica, 77, pp 92-94 Tài liệu mạng 23 http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-vahuong-nghien-cuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html 46 ... với loài giả mạo Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) ” nhằm góp phần cung cấp thông tin sở liệu cho việc xác. .. xác định xác lồi cấp độ phân tử CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lan kim tuyến 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố Lan kim tuyến Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) đƣợc gọi lan. .. đƣợc 51 loài Ở Việt Nam thống kê đƣợc 12 loài, lồi Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) đƣợc biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata)