Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho cây kim ngân lonicera japonica ở việt nam phục vụ giám định loài

LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập trƣờng Đại học Lâm nghiệp, em nhận đƣợc nhiều quan tâm bảo tận tình thầy cô, đặc biệt thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Bùi Văn Thắng Th.S Nguyễn Thị Huyền Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, ngƣời hƣớng dẫn trực tiếp em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn tới tồn thể cán Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành luận văn cách tốt Cuối em xin chân thành cảm ơn tới gia đình bạn bè ủng hộ, động viên giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Do thời gian có hạn nên làm khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy bạn bè để làm đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thế Hải i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tổng quan Kim ngân 1.1.1 Giới thiệu Kim ngân 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.1.4 Giá trị Kim ngân 1.1.5 Tình trạng 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.2 Ứng dụng lợi ích mã vạch ADN 1.2.3 Các đặc điểm trình tự mã vạch 1.3 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng phổ biến tình hình nghiên cứu 1.3.1 Mã vạch ADN động vật 1.3.2 Mã vạch ADN thực vật 1.3.3 Hiện trạng mã vạch thực vật 15 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.4.2 Hóa chất 23 2.4.3 Các thiết bị dùng nghiên cứu 24 ii 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 24 2.5.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 29 3.2 Kết nhân gen với cặp mồi đặc hiệu 29 3.2.1 Kết nhân gen ropB 29 3.2.2 Kết nhân gen trnL-trnF 30 3.3 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB gen trnL-trnF 31 3.3.1 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB 31 3.3.2 Kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF 33 3.4 Xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN 35 3.4.1 Kết so sánh đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự cơng bố Ngân hàng gen NCBI 35 3.4.2 Kết so sánh đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự cơng bố Ngân hàng gen NCBI 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP Bp BOLD CBOL cpDNA CTAB DNA dNTP EDTA 10 11 IGS Kb 12 NAD(P)H 13 NCBI 14 15 16 17 18 19 20 ORF PCR RNA rRNA cs TAE tRNA TT Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt Adenosin triphosphat Base pair Barcode of Life Data Systems Adenosin triphosphat Cặp base Cơ sở liệu mã vạch ADN Consortium for the Consortium for the Barcode of Life Barcode of Life Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Axit deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotid Deoxyribonucleotide triphosphate triphosphate axit ethylenediamine Ethylenediamine tetraacetic acid tetraacetic intergenic Vùng liên kết gen Kilobase (1000 base) 1000 cặp base Nicontinamide adenine Trung tâm Quốc gia Thông dinucleotide phosphate tin Công nghệ sinh học National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ Information sinh học Hoa Kỳ Open Reading Frame khung đọc mở Polymerase Chain Reaction phản ứng chuỗi polymerase Ribonucleic acid Axit ribonucleic Ribosomal RNA ARN ribosome Partner Cộng Tris – Acetic acide – EDTA Tris – Acetic acide – EDTA Transfer RNA ARN vận chuyển iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 11 Bảng 2.1: Thành phần đệm chiết ADN tổng số 23 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen rpoB 26 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen trnL-trnF 26 Bảng 2.5: Trình tự thông tin cặp mồi 27 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Kim ngân (Nguồn ảnh: caythuoc.org) Hình 1.3: Hoa kim ngân khơ (Nguồn ảnh: caythuoc.org) Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số mẫu Kim ngân 29 Hình 3.2: Kết nhân đoạn gen rpoB từ mẫu kim ngân thu đƣợc 30 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen trnL-trnF từ mẫu kim ngân 30 Hình 3.4: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen rpoB phân lập từ Kim ngân với trình tự rpoB loài Lonicera nervosa mã số MK176510.1 32 Hìnsh 3.5: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với loài Lonicera japonica mã số MH028738.1 34 Hình 3.6: So SÁNH trình tự nucleotit đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI 35 Hình 3.7: Cây phân loại đƣợc xây dựng dựa trình tự đoạn gen rpoB 36 Hình 3.8: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI 37 Hình 3.9: Cây phân loại đƣợc xây dựng dựa trình tự đoạn gen trnL-trnF 38 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Kim Ngân đƣợc biết đến với nhiều tên gọi: vàng bạc, nhẫn đông, (tên khoa học là: Lonicera japonica) Là loại leo, có nguồn gốc vùng Đông Á, phân bố Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Việt Nam mọc hoang đƣợc trồng nhiều miền núi, rừng nhƣ Cao Bằng, Hịa Bình, Thanh Hóa, Lào Cai … Cây kim ngân dễ trồng, khơng cầu kỳ chăm sóc, chịu đƣợc khí hậu nóng lạnh, thích nơi đất ẩm nhƣng thoát nƣớc, đất mùn, màu mỡ, cho hoa tốt ánh nắng mặt trời đầy đủ nhƣng bị rệp cơng phần bóng râm Trong Đông y, kim ngân để làm thuốc lại loại thảo dƣợc với nhiều công dụng nhƣ: điều trị rối loạn tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng hô hấp, đau đầu, đái tháo đƣờng … Bởi vậy, lồi hoa ln thu hút đƣợc quan tâm, ý nhiều ngƣời dẫn đến nhu cầu sử dụng thị trƣờng ngày lớn Thế nên cần thiết để xây dựng ADN mã vạch cho loài giá trị nhằm làm sở cho chiến lƣợc phát triển, kinh doanh bền vững phục vụ cơng tác giám định lồi ADN mã vạch (DNA barcode) phƣơng pháp định danh giám định loài dựa trình tự ADN ngắn vùng chuẩn hóa ADN hệ gen (Hebert cs., 2003) Ở thực vật, việc nghiên cứu truy tìm vùng ADN hệ gen thích hợp đƣợc chứng minh khó khăn so với động vật nhiều Tuy nhiên, qua nghiên cứu thấy có vài vùng gen hệ gen lục lạp nhƣ rpoB, trnL-trnF, rbcL, matK hay vùng đệm chép (internal transcribed spacer – ITS) đƣợc sử dụng việc xác định đoạn mã vạch ADN thực vật phục vụ cho mục đích khác Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho Kim ngân (Lonicera japonica) Việt Nam phục vụ giám định loài” nhằm góp phần cung cấp thơng tin sở liệu việc xác định xác lồi cấp độ phân tử CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Kim ngân 1.1.1 Giới thiệu Kim ngân Kim ngân đƣợc gọi vàng bạc, nhẫn đơng Có tên khoa học Lonicera japonica thuộc Dipsacales, họ Caprifoliaceae, chi Lonicera Chúng phân bố Bắc Mỹ, Đông Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên…) Việt Nam (Cao Bằng, Hịa Bình, Thanh Hóa, Lào Cai …) Kim ngân lồi khơng có giá trị kinh tế nhờ ứng dụng cảnh quan, phong thủy mà bên cạnh cịn có giá trị lớn y dƣợc nhờ khả điều trị chứng bệnh nhƣ: rối loạn tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng hơ hấp… 1.1.2 Đặc điểm hình thái Kim ngân loại dây mọc leo, thân quấn, thân vƣơn dài tới 10m hay Cành lúc cịn non máu lục nhạt, có phù lơng mịn, cành già chuyển màu nâu đỏ nhạ nhẵn có vân Lá mọc đối, dày, đơi mọc vịng một, hình trứng dài hay hình mũi mác – trái xoan, đầu tù, phía cuống tròn, dài – 7cm, rộng – 4cm, cuống ngắn – 3cm có lơng, hai mặt phủ lông mịn Vào tháng – hoa kim ngân mọc đôi kẽ là, kẽ có cuống mang hoa Hai mọc đối mang hoa Lá bắc giống nhƣng nhỏ Hoa hình ống xẻ hai mơi Mơi lớn xẻ thành hay thùy nhỏ Phiến tràng dài gần ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau nở thời gian chuyển sang màu vàng, lúc có hoa nở màu trắng nhƣ bạc, lại có hoa nở lâu màu vàng nhƣ vàng nên có tên kim ngân (kim vàng, ngân bạc) Cây kim ngân xanh tốt vào mùa đông nên cịn có tên nhẫn đơng, nghĩa chịu đựng mùa đơng nhị thịi dài cao tràng, vòi nhụy lại thòi dài cao nhị, mùi thơm dễ chịu Hình 1.1: Cây Kim ngân (Nguồn ảnh: caythuoc.org) 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố Cây kim ngân loài sống trời, ƣa nơi thơng thống Cây sống đƣợc bóng râm nhƣng dễ bị rệp công Cây dễ trồng, chịu đƣợc khí hậu nóng lạnh Cây có sức sống tốt, tốc độ sinh trƣởng nhanh khỏe khoắn nên dễ dàng chăm sóc Phân bố: Kim ngân có nguồn gốc vùng Đơng Á, phân bố Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Việt Nam mọc hoang đƣợc trồng nhiều miền núi, rừng nhƣ Cao Bằng, Hịa Bình, Thanh Hóa, Lào Cai … 1.1.4 Giá trị Kim ngân Giá trị y dƣợc, sức khỏe: Theo tây y kim ngân bắt đầu hoa khoảng từ tháng – Hoa kim ngân chứa tinh dầu, có α-pinen, geraniol, carvacrol, eugenol, đặc biệt flavonoid gồm: luteolin, luteolin-7glucosid, axit clorogenic, lonicerin… Cành chứa loganin giúp kháng khuẩn, tăng cƣờng chuyển hóa chất béo Theo đơng y Kim ngân hoa tính mát lạnh, vị ngọt, đắng, khơng độc Cây có cơng nhiệt, lợi thấp, giải độc, giải biểu, lợi tiểu, dùng chữa dƣơng bệnh Kim ngân có nhiều tác dụng, phải nói đến tác dụng quan trọng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi rút Nhiều nghiên cứu đƣợc chứng minh kim ngân có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn nhƣ tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn dung huyết, phế cầu khuẩn, trực khuẩn lị, trực khuẩn ho gà, trực khuẩn thƣơng hàn, trực khuẩn mủ xanh, số loại nấm, vi rút cúm Ngồi kim ngân cịn có tác dụng chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt làm tăng tác dụng thực bào bạch cầu Kim ngân làm thuốc tất phận dùng để làm thuốc nhƣng hoa phận thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất, hoa có cơng dụng nhiều làm thuốc Hình 1.3: Hoa kim ngân khơ (Nguồn ảnh: caythuoc.org) 1.1.5 Tình trạng Hiện nay, loài mọc hoang đƣợc trồng nhiều nhƣng tình trạng ngƣời khai thác cách bừa bãi, khơng có kế hoạch để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thực vật, nạn cháy rừng xảy thƣờng xuyên vào mùa hanh khô với mức độ ngày nghiêm trọng, nhiều lồi thực vật nói chung có Kim ngân dần bị suy giảm số lƣợng cá thể, quần thể dần bị thu hẹp, giảm bớt dần Do đó, cần tiến hành phát triển quần thể cịn sót lại nhƣ nghiên cứu nhân giống để gieo trồng tạo hàng hóa sử dụng, xuất bảo vệ nguồn gen 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 ADN mã vạch (DNA barcode) Khái niệm mã vạch ADN đƣợc biết đến rộng rãi từ năm đầu kỷ 21, nhà khoa học Canada trình bày nghiên cứu sử dụng đoạn gene dài 648 nucleotid từ gene ti thể - gọi Co1 - để định loại 260 loài chim đề CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số Tách chiết DNA bƣớc khởi đầu quan trọng, định thành cơng cho phản ứng PCR sau Để tách chiết DNA đạt hiệu suất độ tinh cao việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu quan trọng Đối với Na Dai, quy trình tách chiết sử dụng đệm chiết CTAB Với phƣơng pháp này, DNA đƣợc tách chiết dễ dàng, tiết kiệm chi phí, đặc biệt có độ tinh cao Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số mẫu Kim ngân Ghi chú: giếng từ 1-3: mẫu KN1-KN3 Kết điện di cho thấy băng vạch DNA sáng nét, khơng có băng phụ, chứng tỏ DNA tổng số tách chiết đƣợc từ mẫu kim ngân tƣơng đối tốt Băng có độ sáng tƣơng tự nhờ hàm lƣợng DNA tổng số tách chiết đƣợc từ mẫu tƣơng đối đồng nên mẫu DNA đảm bảo độ tinh để thực phản ứng PCR với mồi đặc hiệu 3.2 Kết nhân gen với cặp mồi đặc hiệu 3.2.1 Kết nhân gen ropB Hiện nay, rpoB gen đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu phát sinh loài xác định loài vi khuẩn, đặc biệt nghiên cứu chủng có quan hệ gần gũi 29 Hình 3.2: Kết nhân đoạn gen rpoB từ mẫu kim ngân thu đƣợc Cặp mồi sử dụng P5Fvà P5R để nhân đoạn gen rpoB Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen ropB khuyếch đại thành công tất mẫu Ở mẫu thu đƣợc băng DNA sáng rõ nét, khơng có băng DNA phụ xuất hiện, kích thƣớc khoảng 500 bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 1000bp) Phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen rpoB dự kiến nhân Kết khẳng định chất lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ không lẫn tạp chất gây ảnh hƣởng đến nhân dịng PCR, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.2.2 Kết nhân gen trnL-trnF Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen trnL-trnF từ mẫu kim ngân 30 Cặp mồi sử dụng trnF trnR để nhân đoạn gen trnL-trnF Kết kiểm tra sản phẩm điện di gen trnL-trnF gel agarose 1% cho thấy gen trnLtrnF đƣợc khuếch đại tốt tất mẫu, băng thu đƣợc sáng với kích thƣớc tƣơng tự khoảng 600 bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 1000bp) Kết lần khẳng định chất lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ khơng lẫn băng phụ gây ảnh hƣởng đến giải trình tự, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL-trnF đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.3 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB gen trnL-trnF 3.3.1 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB Kết giải trình tự đoạn gen rpoB nhân từ mẫu kim ngân (KN1, KN2 KN3) cho thấy đoạn gen rpoB phân lập từ mẫu kim ngân có kích thƣớc 509 bp So sánh trình tự gen rpoB với lồi Lonicera nervosa mã số MK176510.1 có độ tƣơng đồng 99% Gen nghiên cứu đƣợc mang so sánh ngân hàng gen: TTAAGTGCATTTGTTGGAACTGGGTTGGAACGGCAAGCAGCTCTAGATT CGGGGGCTCTTGCTATAGCCAAACACGAGGTAAAGATCAGTTATATCGATACG GACAAGATACTTTTATCAAGTAATAGAGATACTCTAAGCATTATGGGTCGGGG TTCCAACAAAAAGACTTGTATGCATCAAAAACCCCAGGTTCGGCGGGTTAAAT GCATTAAAAAAGGACAAATTTTAGGGTATGGCGCCGCTACGGTTGGCGGTGAA CTCGCTTTGGGGAAAAACGTATTAGTAGCTTATATGCCATGGGAAGGTTACAA TTCTGAAGATGCAGTACTCATTAGCGAGCGCTTGGTATATGAAGATATTTATA CTTCTTTTCACATACGGAAATATGAAACTAAGATTTATGTGACAAGCCAAGGC CCCGAAAGGGTCACTAATGAAATACCGCATTTAGAAGCCCATTTACTCCGCAA TTTAGACAAAAGGGGAATTGTGATGCTGGGATCAAA Gen rpoB phân lập từ Kim ngân với trình tự rpoB loài Lonicera nervosa mã số MK176510.1 Ngân hàng gen NCBI, kết nhƣ sau: Lonicera nervosa chloroplast, complete genome Sequence ID: MK176510.1Length: 154862Number of Matches: Range 1: 25738 to 26240GenBankGraphics 31 Alig nment stati sti cs fo r matc h #1 Score Expect 896 bits(485) Query 0.0 Identities Gaps 498/504(99%) 1/504(0%) Strand Plus/Minus AAGTGCATTTGTTGGAACTGGGTTGGAACGGCAAGCAGCTCTAGATTCGGGGGCTCTTGC 62 ||||||| |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26240 AAGTGCA-TTGTTGGAACTGGGTTGGAACGCCAAGCAGCTCTAGATTCGGGGGCTCTTGC 26182 Query 63 TATAGCCAAACACGAGGTAAAGATCAGTTATATCGATACGGACAAGATACTTTTATCAAG 122 ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26181 TATAGCCAAACACGAGGGAAAGATCAGTTATATCGATACGGACAAGATACTTTTATCAAG 26122 Query 123 TAATAGAGATACTCTAAGCATTATGGGTCGGGGTTCCAACAAAAAGACTTGTATGCATCA 182 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26121 TAATAGAGATACTCTAAGCATTATGGGTCGGGGTTCCAACAAAAAGACTTGTATGCATCA 26062 Query 183 AAAACCCCAGGTTCGGCGGGTTAAATGCATTAAAAAAGGACAAATTTTAGGGTATGGCGC 242 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26061 AAAACCCCAGGTTCGGCGGGTTAAATGCATTAAAAAAGGACAAATTTTAGGGTATGGCGC 26002 Query 243 CGCTACGGTTGGCGGTGAACTCGCTTTGGGGAAAAACGTATTAGTAGCTTATATGCCATG 302 |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26001 CGCTACAGTTGGCGGTGAACTCGCTTTGGGGAAAAACGTATTAGTAGCTTATATGCCATG 25942 Query 303 GGAAGGTTACAATTCTGAAGATGCAGTACTCATTAGCGAGCGCTTGGTATATGAAGATAT 362 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 25941 GGAAGGTTACAATTCTGAAGATGCAGTACTCATTAGCGAGCGCTTGGTATATGAAGATAT 25882 Query 363 TTATACTTCTTTTCACATACGGAAATATGAAACTAAGATTTATGTGACAAGCCAAGGCCC 422 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| Sbjct 25881 TTATACTTCTTTTCACATACGGAAATATGAAACTAAGATTTGTGTGACAAGCCAAGGCCC 25822 Query 423 CGAAAGGGTCACTAATGAAATACCGCATTTAGAAGCCCATTTACTCCGCAATTTAGACAA 482 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 25821 CGAAAGGGTCACTAATGAAATACCGCATTTAGAAGCCCATTTACTCCGCAATTTAGACAA Query 483 AAGGGGAATTGTGATGCTGGGATC 25762 506 |||||||||||| ||||||||||| Sbjct 25761 AAGGGGAATTGTAATGCTGGGATC 25738 Hình 3.4: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen rpoB phân lập từ Kim ngân với trình tự rpoB lồi Lonicera nervosa mã số MK176510.1 32 3.3.2 Kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF Kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF nhân từ mẫu kim ngân (KN1, KN2 KN3) cho thấy đoạn gen trnL-trnF phân lập từ mẫu kim ngân có kích thƣớc khoảng 597 bp mẫu có trình tự giống 100% So sánh trình tự gen trnL-trnF thu đƣợc với lồi Lonicera dasystyla (MH028738.1) có độ tƣơng đồng đạt 98% Trình tự gen gen trnL-trnF phân lập từ mẫu Kim ngân: GTCGAAATCGGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTAT GGAAACCTACTAAGTGAAAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCCGGAATTAATAA AAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCGGTTTTCCGAAAACAGGGGTTTAGAATA GAAAGCAAAAATCAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAA CAAACGGAGTTGACTGTCCTGTGTTGGTAGAAAGAATCCTTCCATAGAAACTT CAGAAAGGATAAACCTATAAACATAGATATACGTATTGAAATGCTATGATACT ATATCAAATGATTAATGACGATCCGAATTTGTATCTGTATTTTATATATATCA AAATGGAAGAATTGTTGTGAAGTGATTCCATATTGAAGAAAGAATCAAATATT CATTGATCAAATCATTCACTCCATAGTCTGATCGATCTTTTGAAGAACTGATT AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAAGACCGGCAACA ATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTAGAAATCGTGAGGGTTC AAGTCCTCCTATCCCCAC Gen ngân hàng gen đƣợc sử dụng để so sánh: Lonicera japonica mã số MH028738.1 Lonicera japonica chloroplast, complete genome Sequence ID: MH028738.1Length: 155060Number of Matches: Range 1: 49041 to 49628GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect 1042 bits(564) 0.0 Identities Gaps Strand 585/594(98%) 6/594(1%) Plus/Plus 33 Query CGAAATCGGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTAA |||||| 62 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49041 CGAAAT-TGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTAA 49099 Query 63 GTGAAAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCCGGAATTAATAAAAATGGGCAATCCTGAGCCA 122 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49100 GTGAAAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCCGGAATTAATAAAAATGGGCAATCCTGAGCCA 49159 Query 123 AATCCGGTTTTCCGAAAACAGGGGTTTAGAATAGAAAGCAAAAATCAAAAAGGATAGGTG 182 |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49160 AATCCGGTTTTCCGAAAACAGGGGTT -TAGAAAGCAAAAATCAAAAAGGATAGGTG 49214 Query 183 CAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAACGGAGTTGACTGTCCTGTGTTGGTAGAAAG 242 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49215 CAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAACGGAGTTGACTGTCCTGTGTTGGTAGAAAG 49274 Query 243 AATCCTTCCATAGAAACTTCAGAAAGGATAAACCTATAAACATAGATATACGTATTGAAA 302 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49275 AATCCTTCCATAGAAACTTCAGAAAGGATAAACCTATAAACATAGATATACGTATTGAAA 49334 Query 303 TGCTATGATACTATATCAAATGATTAATGACGATCCGAATTTGTATCTGTATTTTATATA 362 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49335 TGCTATGATACTATATCAAATGATTAATGACGATCCGAATTTGTATCTGTATTTTATATA 49394 Query 363 TATCAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGTGATTCCATATTGAAGAAAGAATCAAATATTCA 422 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49395 TATCAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGTGATTCCATATTGAAGAAAGAATCAAATATTCA 49454 Query 423 TTGATCAAATCATTCACTCCATAGTCTGATCGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACG 482 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49455 TTGATCAAATCATTCACTCCATAGTCTGATCGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACG 49514 Query 483 AGAATAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAAGACCGGCAACAATGAAATTTATAGTAA 542 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49515 AGAATAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAAGACCGGCAACAATGAAATTTATAGTAA Query 543 GAGGAAAATCCGTCGACTTTAGAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCTCCTATCCCCA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 49575 49574 596 ||||||||| GAGGAAAATCCGTCGACTTTAGAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCA 49628 Hìnsh 3.5: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với loài Lonicera japonica mã số MH028738.1 34 3.4 Xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN Sau đƣợc tinh Kit tinh hãng Norgen, ADN đƣợc gửi giải trình tự phịng thí nghiệm 1st Base Malaysia Sau nhận đƣợc lý trình tự Bioedit, đối chiếu với thông tin ngân hàng GenBank so sánh MUSCLE 3.4.1 Kết so sánh đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự cơng bố Ngân hàng gen NCBI Hình 3.6: So SÁNH trình tự nucleotit đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI 35 Lồi kim ngân nghiên cứu có mức độ sai khác lớn so với loài Lonicera vesicaria (mã số NC_039638.1) với vị trí sai khác cụ thể là: 33, 80, 249, 404, 414, 495 Đối với đoạn gen rpoB phát sinh đƣợc xây dựng gồm mẫu Kim ngân (Lonicera japonica) nghiên cứu với số loài nhƣ: Lonicera nervosa, Lonicera ferdinandi, Lonicera macranthoides, Lonicera vesicaria, Lonicera maackii Hình 3.7: Cây phân loại đƣợc xây dựng dựa trình tự đoạn gen rpoB Từ hình 3.7 cho thấy mẫu Kim ngân nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần với Lonicera nervosa-NC040961.1 với tỷ lệ tƣơng đồng đến 99% 3.4.2 Kết so sánh đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự cơng bố Ngân hàng gen NCBI 36 Hình 3.8: So sánh trình tự nucleotit đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Kim ngân với trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI Loài kim ngân nghiên cứu có mức độ sai khác lớn so với loài Lonicera macranthoides (mã số HM228578.1) Đối với đoạn gen trnL-trnF phát sinh đƣợc xây dựng gồm mẫu kim ngân nghiên cứu với số loài nhƣ: Lonicera dasystyla, Lonicera japonica, Lonicera alpigena có trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI; kết thu đƣợc hình phát sinh nhƣ sau: 37 Hình 3.9: Cây phân loại đƣợc xây dựng dựa trình tự đoạn gen trnL-trnF Từ hình 3.9 cho thấy mẫu Kim ngân nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần với Lonicera dasystyla- HM228587.1 với tỷ lệ tƣơng đồng 99% 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: 1) Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ mẫu Kim ngân nhân thành công đoạn gen rpoB trnL-trnF; đoạn gen rpoB có kích thƣớc 509 bp đoạn gen trnL-trnF có kích thƣớc 597 bp So sánh trình tự đoạn gen rpoB trnL-trnF mẫu nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng 100% 2) Đoạn gen rpoB phân lập từ Kim ngân (Lonicera japonica) nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng cao với trình tự gen rpoB lồi thuộc chi Lonicera công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI; với mức độ tƣơng đồng từ 98% đến 99% 3) Đoạn gen trnL-trnF phân lập từ Kim ngân nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng cao với trình tự gen trnL-trnF lồi thuộc chi Lonicera công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI; với mức độ tƣơng đồng từ 97% đến 99% 4) Đã xây dựng đƣợc phát sinh loài Kim ngân nghiên cứu dựa đoạn trình tự gen rpoB trnL-trnF với trình tự gen cơng bố NCBI; cho thấy loài Kim ngân nghiên cứu (Lonicera japonica) nằm nhánh riêng biệt so với loài thuộc chi Lonicera Kiến nghị: - Tiếp tục sử dụng phƣơng pháp ADN bacode với đoạn gen khác để phân loại loài thuộc chi Lonicera - Ứng dụng thị rpoB trnL-trnF để giám định lồi Kim ngân (Lonicera japonica) phục vụ cho cơng tác quản lý chất lƣơng dƣợc liệu, bảo tồn chọn tạo giống 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Hiền (2017), “Phƣơng pháp phân lập đọc trình tự gen ITS lồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus blume) Thanh Hóa” Tạp chí khoa học trƣờng đại học Hồng Đức số 35 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “ Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123-124 Lê Thanh Hƣơng, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017), “Ứng dụng mã vạch ADN hỗ trợ định loại loài số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm” Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 15 Võ Thƣơng Lan cộng (1990), “Nghiên cứu tính đa dạng số loài rong câu vùng ven biển miền Nam Việt Nam kĩ thuật RAPD-PCR”, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, Tr 1321-1327 Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng (2002), Công nghệ gen, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), “Đánh giá đa dạng di truyền số loài dƣợc liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật AND mã vạch”, luận văn Th.sĩ Nguyễn Hoàng Nghĩa, (1999), Bảo tồn đa dạng sinh học, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 10 Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hải Hà, Vũ Quang Nam, Nguyễn Thế Đại, Phan Văn Quynh, Nguyễn Ngọc Ánh (2017), “Giám định số loài Nƣa hóa dẫn liệu hình thái phân tử” Tạp chí Khoa học cơng nghệ giống trồng, số 40 11 Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, Nguyen Hoang Nghia (2012), Genetic diversity of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib in Vietnam based on analyses of chloroplast markers and radom amplified polymorphic ADN (RAPD), African Journal of Biotechnology, 11 (80), 14529-14535 12 PGS.TS Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen nguyên lí ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 13 Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Trần Thu Hƣơng, Ludwig Triest, Nguyễn Minh Tâm (2014), “Đặc điểm di truyền ba loài (Hopea) bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 36, tr 316-322 14 Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Tiến Vững, Vũ Đức Lợi (2017), “Xác định tên khoa học Ô đầu phƣơng pháp giải trình tự gen AND” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số  TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Ana S Barreira (2016), “The multiple applications of DNA barcodes in avian evolutionary studies”, Genome, 59 (11), 899-911 16 Aron J Fazekas, Royce Steeves, Steven G Newmaster and Peter M Hollingsworth (2010), “Stopping the stutter: ImProvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeat can increase the usefulness pf non – coding regions for DNA barcoding”, taxon, 59,pp 694- 694 17 Asadatun Abdullah Hartmut Rehbein (2016) “DNA barcoding for the species identification of commercially important fishery products in Indonesian markets”, Food Science Technology, 52(1), 266 – 274 18 Jiang C, Zhang YH, Chen M, Yuan Y, Lin SF, Wu ZG (2012), “Authentication of Lonicera japonica using bidirectional PCR amplification of specific alleles”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.2012 Dec;37(24) 19 Ren FM, Wang YW, Xu ZC, Li Y, Xin TY, Zhou JG, Qi YD, Wei XP, Yao H, Song JY (2019), “DNA barcoding of Corydalis, the most taxonomically complicated genus of Papaveraceae”, Ecol Evol 2019 Jan 21;9(4) 20 Viglietti G, Galla G, Porceddu A, Barcaccia G, Curk F, Luro F, Scarpa GM (2019), “Karyological Analysis and DNA Barcoding of Pompia Citron: A 41 First Step toward the Identification of Its Relatives”, Plants (Basel) 2019 Mar 31;8(4) 21 Hamilton, M.B (1999), “Four primer pairs for the aplification of chloroplast intergenic religions with intraspecific varation”, Molecular Ecology, 8, pp 513-525 22 Joey Shaw, Edgar B Lickey, Edward E Schilling, And Randall L Small (2007), “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise an the hare III”, American Journal of botany, 94, pp.275-288 23 He L, Qian J, Li X, Sun Z, Xu X, Chen S (2017), “Complete Chloroplast Genome of Medicinal Plant Lonicera japonica: Genome Rearrangement, Intron Gain and Loss, and Implications for Phylogenetic Studies”, Molecules 2017 Feb 7;22(2) 24 Lichao Jiao , Min Yu , Alex C Wiedenhoeft , Tuo He , Jianing Li , Bo Liu , Xiaomei Jiang & Yafang Yin (2017) “DNA Barcode Authentication and Library Development for the Wood of Six Commercial Pterocarpus Species: the Critical Role of Xylarium Specimens”, Scientific Reportsvolume, (1945) 25 Saravanan M, Mohanapriya G, Laha R, Sathishkumar R (2019), “DNA barcoding detects floral origin of Indian honey samples”, Genome 2019 Mar 28:1-8 26 S Ghaffariyan, S A Mohammadi and S Ahari zad (2012), ADN isolation protocol for the medicinal plant lemon balm (Melissa officinalis, Lamiaceae), Genetics and Molecular Research, 11 (2): 1049-1057 27 SaghaiMaroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W (1984), Ribosomal ADN spacer – length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics, Proc Natl Acad Sci, 81, 8014-8019 28 Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu (2011), “Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification”, Cladistics, 27(2), 165 – 170 42 29 Cui XY, Sun W, Xiong C, Meng XX, Shi YH, Wu L, Cheng LL, Li WJ, Zheng XL (2019), “Identification of 23 unknown Li minority medicinal plants based on DNA barcoding”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2019 Jan;44(2) 30 Sun Z, Gao T, Yao H, Shi L, Zhu Y, Chen S (2011), “Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method”, Planta Med 2011 Feb;77(3) 43 ... việc xác định đoạn mã vạch ADN thực vật phục vụ cho mục đích khác Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho Kim ngân (Lonicera japonica) Việt Nam phục vụ giám định. .. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích xác định đƣợc số đoạn ADN mã vạch Kim ngân góp phần cung cấp thơng tin sở liệu cho ngân hàng gen giới, giúp cho việc xác định loài cấp độ... xây dựng ADN mã vạch cho loài giá trị nhằm làm sở cho chiến lƣợc phát triển, kinh doanh bền vững phục vụ cơng tác giám định lồi ADN mã vạch (DNA barcode) phƣơng pháp định danh giám định lồi dựa