Nghiên cứu xác định đoạn DNA mã vạch cho giống na dai võ nhai thái nguyên

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn PGS.TS Bùi Văn Thắng ThS Nguyễn Thị Huyền tận tình hƣớng dẫn, bảo suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp giúp đỡ, bảo tận tình cho em khơng q trình làm khóa luận mà trình học tập, bồi dƣỡng Trƣờng; đặc biệt giúp đỡ toàn thể thầy cô Bộ môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi trình học tập, làm nghiên cứu khoa học hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian, khả thân cịn có hạn chế nên báo cáo khóa luận tốt nghiệp cịn thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, nhà khoa học nhƣ bạn sinh viên để khóa luận em đƣợc hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Hồ Thị Minh Thu i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH iv Đ T VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.Chi Na 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Sơ lƣợc đặc điểm hình thái Na 1.1.3 Phân bố, điều kiện địa lý tính chất hóa học 1.1.4 Giá trị Na 1.2.Tổng quan mã vạch DNA (DNA barcoding) 1.2.1 Các đặc điểm trình tự mã vạch DNA 1.2.2 Một số locus đƣợc sử dụng làm thị mã vạch DNA thực vật 10 1.2.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch DNA thực vật 15 1.2.3.2 Những thành tựu nghiên cứu Việt Nam 16 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.2 Hóa chất 20 2.3.3 Dụng cụ - máy móc 21 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 21 2.4.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 22 ii 2.4.3 Phƣơng pháp nhân gen đích kĩ thuật PCR 23 2.4.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1.Kết tách chiết DN tổng số 26 3.2.Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 27 3.2.1 Kết nhân gen rbcL 27 3.2.2 Kết nhân gen matK 28 3.2.3 Kết nhân gen trnH – PbsA 29 3.2.4 Kết nhân gen trnL 29 3.3 Kết xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen trnL 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận: 37 Kiến nghị: 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần hóa học có 100g Na (Pinto et al., 2005) [16] Bảng 1.2: Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 12 Bảng 2.1: Trình tự th ng tin cặp mồi đặc hiệu 21 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng 2.3: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P5 23 Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P9 23 Bảng 2.5: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P10 24 Bảng 2.6: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi P10 24 Bảng 3.1 Mức độ tƣơng đồng so sánh mẫu Na Dai nghiên cứu với loài ngân hàng gen NCBI 35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái phận na [16] Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số mẫu Na Dai 26 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen rbcL 27 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen trnH - PbsA 29 Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen trnL 30 Hình 3.6 Cây phân loại dựa gen trnL xây dựng MUSCLE (phƣơng pháp Neighbor – joining) 36 iv ẤN Ề Việt Nam quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với đặc trƣng nóng ẩm mƣa nhiều, có số lƣợng đa dạng loại ăn Trong đó, na ăn đƣợc trồng phổ biến nhiều vùng nƣớc, na có giá trị dinh dƣỡng cao hạt na có nhiều chất có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng cơng dụng phịng điều trị bệnh Cây na có tên khoa học Annona squamosa, loài thuộc chi Na, loài gỗ nhỏ cao từ – 8m Cây na có thân non màu nâu bạc, thân già màu nâu xám có nhiều lỗ bì nhỏ sẹo lồi to rõ; mọc xen hàng, hoa xanh, trịn có nhiều múi Quả na có vị chua, tính ấm, có tác dụng hạ khí tiêu đờm; nguyên liệu từ xanh làm săn da, tiêu sƣng Hạt na có vị đắng, h i, tính lạnh, có tác dụng can, giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng Lá có tác dụng kháng sinh tiêu viêm, sát trùng v.v [16] Na có khoảng 50 giống khác Ở nƣớc ta thƣờng gặp giống nhƣ: Na (mãng cầu), mãng cầu xiêm, nê, bình bát v.v [32] Trong Na (mãng cầu) miền Bắc chia thành giống Na Dai Na Bở dựa vào đặc tính (sự liên kết múi với vỏ múi với nhau) Giữa giống có đặc điểm hình thái, với hàm lƣợng chất dƣợc tính khác Chính lẽ đó, việc phân loại xác giống na quan trọng việc bảo tồn, phát triển nguồn gen truy xuất nguồn gốc giống Hiện nay, sử dụng mã vạch DNA công cụ hữu hiệu phục vụ định danh loài đảm bảo độ xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi mã vạch DNA Từ sở trên, thực đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu xác định đoạn mã vạch DNA giống Na Dai (Annona sqamosa L.) Võ Nhai, Thái Nguyên” làm sở cho việc nhận diện xác giống sản phẩm Na Dai Võ Nhai, Thái Nguyên CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.Chi Na 1.1.1 Phân loại khoa học Giới (Regnum): Plantae Ngành (Division): Magnoliophyta Lớp (Classis): Magnoliosida Bộ (Ordo): Magnoliales Họ (Familia): Annonaceae Chi (Genus): Annona Chi Na chi thực vật điển hình họ Na ( nnonaceae), thƣờng sinh trƣởng chủ yếu vùng nhiệt đới, có số lồi sinh sống vùng ơn đới Khoảng 900 lồi Trung Nam Mỹ, 450 loài châu Phi loài châu Á Tên Annona bắt nguồn từ “thu hoạch hàng năm” Latin Chi có nhiều đặc điểm thống nhất, đặc biệt liên quan đến chiều cao cây, hệ thống rễ, vỏ cây, đặc điểm hoa [11] Tên thƣờng gọi Việt Nam loài na mãng cầu dai mãng cầu ta tùy thuộc vào vùng miền, địa phƣơng Na đƣợc trồng chủ yếu tỉnh phía Bắc nhƣ Thái Nguyên, Lạng Sơn, Tuyên Quang số tỉnh Nam Bộ 1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái Na Cây na gỗ nhỏ cao từ – m, có thân non màu nâu bạc, thân già màu nâu xám có nhiều lỗ bì nhỏ sẹo lồi to rõ Lá na: Đơn nguyên, mọc cách, phiến hình mũi mác, dài từ – 13 cm, rộng – cm, màu xanh, mặt đậm mặt dƣới, - cặp gân phụ, cặp gân phụ mọc đối kh ng bìa phiến, cuống hình trụ gần trịn, dài 0,8 -1 cm, đáy phình to xanh đậm hơn, khơng có kèm Cụm hoa: Hoa riêng lẻ mọc đối diện với xim hoa cành già; hoa có màu xanh, đều, lƣỡng tính; cuống hoa màu xanh, dài 0,8 - 1,1 cm Đài hoa: đài đều, rời, màu xanh, mặt ngồi có nhiều lơng, màu tím, dài mm, rộng mm Tràng hoa: cánh hoa đều, rời, màu xanh, mặt ngồi có lơng, hình mác thn nhọn dày mập dọc theo phần cánh, móng lõm vào phía tạo hình lịng muỗng có màu đỏ, dài 1,8 – cm, rộng 0,6 - cm Bộ Nhị: Nhiều nhị rời, đều, dài từ – mm, đính xoắn ốc đế hoa lồi, nhị ngắn, bao phấn màu trắng, thn nẹp, nứt dọc, hƣớng ngồi, đính gốc, chung gốc kéo dài tạo phụ hình đĩa quắp xuống, hạt phấn màu trắng, rời, hình bầu dục thn nhỏ đầu, có rãnh, dài 45 μm, rộng 27,5 μm Bộ nhụy: Nhiều noãn rời, màu trắng – mm, xếp khít đế hoa lồi; nhị ngắn màu trắng Quả tụ, noãn cho mọng riêng biệt tất dính vào tạo thành khối hình tim hình cầu đƣờng kính 7-10 cm, mặt xanh chia làm nhiều rãnh, mặt màu trắng, mềm chín Hạt hình bầu dục đầu thn trịn, vỏ hạt đen nhẵn bóng dài – mm [32] Thân Lá Quả Hạt Hoa Hình 1.1: Hình thái phận na [16] 1.1.3 Phân bố, điều kiện địa lý tính chất hóa học 1.1.3.1 Phân bố điều kiện địa lý Với đặc điểm tốc độ sinh trƣởng nhanh, na thích hợp với khí hậu ấm áp, chịu nhiệt, kh ng kén đất Các loại đất cát sỏi, đất thịt nặng, đất vỏ sò hến, đất chua kiềm hay trung tính trồng đƣợc na Nói chung, na chịu đƣợc khô hạn tốt, khả chịu úng Các giống na Việt Nam đƣợc trồng phổ biến nhà vƣờn ba miền Bắc, Trung, Nam Đặc biệt, số tỉnh nhƣ: Thái Nguyên, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Quảng Ninh số tỉnh Nam Bộ [31] 1.1.3.2 Tính chất hóa học Lá na giàu aphosphat, chứa diterpenoid vỏ có chứa acetogenins Chất Squamotacin (tƣơng tự nhƣ bullatacin) acetogenins molvizarin chiết xuất từ na có hoạt tính gây độc tế bào tế bào khối u tuyến tiền liệt Thành phần acid béo có hạt là: stearic acid (9,3%), acid oleic (37%), acid linoleic (10,9%), acid arachidic (3,3%) acid isoricinoleic (9,8%) Hạt chứa tinh dầu hydrocarbon terpene, nhƣ alpha pirene, beta pirene, limorene, beta farnesene trans orimene Hạt giàu acetogenins, diterpenes saponin [3] Chất acetogenins quan trọng anonin anonacins: asimicin, annonastatin, bullatacin, bullatacinone squamocin Những chất có độc hại trùng chúng ăn phải ức chế phát triển sinh sản c n trùng Các anonin gây độc tế bào làm 70% Aedes aegypti bị tử vong với nồng độ sử dụng 10 ppm Các anonin hoạt động cách ức chế h hấp Chất simcin có hiệu chống lại c n trùng gây hại, nhƣ A aegypti, A vittatum, A gossypii, Colliphora vicina, Epilachna varivertis, Tetranychus urticae tuyến trùng Caenoharbiditis elegans Hợp chất đƣợc biết có 256 đồng vị, bullatacin chất độc Bullatacin gây tử vong 80% loài A aegypti, A gossypii Diabrotica undecimpunctata nồng độ lần lƣợt 1,10 24 ppm Một đồng phân khác bullatacinone Một số acetogenins đƣợc sử dụng làm chất chống c n trùng [9] 1.1.4 Giá trị Na 1.1.4.1 Giá trị dinh dưỡng Hạt na nhỏ, có màu vàng trắng Quả na A squamosa thƣờng đƣợc dùng ăn tƣơi, có vị ngon độ chua thấp, coi loài thuộc chi Annona thƣờng đƣợc tiêu thụ tƣơi nhƣ trái tráng miệng, pha chế nƣớc trái cây, kem làm rƣợu Phần ăn đƣợc chiếm khoảng 28 - 37% tổng trọng lƣợng tƣơi quả; hạt tƣơng ứng với 31 - 41% vỏ đến 23 - 40% Các carbohydrate có thịt na fructose (3,5%), sucrose (3,4%), glucose (5,1%) oligosaccarides (1,2 - 2,5%) [6] Bảng 1.1: hành phần hóa học có 100g Na (Pinto et al., 2005) [16] Stt Thành phần Water (g) Protein(g) Lipids (g) Carbohydrates(g) Fibre(g) Độ axit (g) Ash (g) Năng lƣợng (calo) Caxi (mg) 10 Photpho(mg) 11 Sắt(mg) Hàm lƣợng 72,6 2,4 (68,6-75,9) 1,6 0,8 (1,2-2,4) 0,4 0,3 (0,1-1,1) 19,6 (18,2-26,2) 1,4 (1,1-2.5) 0,1 0,7 0,1 (0,6-1,3) 96 (86-114) 26,2 (17-44,7) 42 14 (23,6-55,3) 0,8 0,5 (0,3-1,8) 12 Vitamin A(mg) 13 Vitamin B1(mg) 14 Vitamin B12(mg) 15 Vitamin B5(mg) 16 Axít ascorbic(mg) 17 Axít tannin(mg) Ghi chú: Số TB ± phƣơng sai 0,005 (0,004-0,007) 0,1 (0,10-0,11) 0,13 0,05 (0,057-0,167) 0,9 (0,65-1,28) 37,38 (34-42,2) Min - Max 1.1.4.2 Giá trị dược liệu Na có nhiều alkaloids, chẳng hạn nhƣ aporphine, roemerine, norcorydine, corydine, norisocorydine, glaucine anonain phận khác Rễ đƣợc sử dụng để điều trị bệnh kiết lỵ cấp, trầm cảm bệnh tủy sống; đƣợc sử dụng trƣờng hợp bị sƣng tràn hậu m n, lt Trà đƣợc làm từ rễ có tính tẩy uế cao trà đƣợc làm từ làm thuốc nhuận tràng nhẹ Chiết xuất ethanol từ vỏ dƣờng nhƣ có hoạt động chống khối u Các có alkaloid, higenamine có tác dụng phịng chống ung thƣ [3] Na chứa 16-b, 17-dihydroxykauran-19-oic acid, có hoạt tính chống HIV [28] Dịch chiết xuất từ hạt độc có tính chất diệt c n trùng, tế bào hồng cầu độc cá [17] Ở Ấn Độ, dịch chiết xuất từ hạt na kết hợp với Plumbago zeylanica đƣợc sử dụng để phá thai lạc bang Madhya Pradesh [3] Việc sử dụng loại thuốc dân gian đại đƣợc bào chế từ na rõ ràng, nhƣng kh ng nên tự ý dùng thuốc chƣa hiểu biết, tính chất độc hại hầu hết hợp chất có na có phản ứng phụ kh ng mong muốn Các alkaloids có lá, vỏ hạt na đƣợc sử dụng làm thuốc có tác dụng an thần th i miên Tây Ấn, nƣớc Pháp; chúng 3.2.Kết nhân gen với c p mồi nghiên cứu 3.2.1 K t nhân gen rbcL Gen rbcL gen giải trình thực vật; gen rbcL sử dụng rộng rãi nghiên cứu phát sinh loài phân loại thực vật với 10.000 trình tự rbcL có sẵn GenBank [21; 22] Cặp mồi P5F: 5‟- ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC -3‟ P5R: 5‟- CTT CTG CTA CAA ATA AGA ATC GAT CTC -3‟ đƣợc sử dụng để nhân gen rbcL Kết kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL gel agarose 1% (hình 3.2) cho thấy gen chƣa đƣợc khuếch đại, băng DNA thu đƣợc cịn mờ, có giếng thứ tƣơng ứng với mẫu số có lên băng sáng với kích thƣớc 500 bp so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp Mặc dù, thay đổi chu trình phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi khác nhƣng lần lặp lại kết tƣơng tự nhau, chứng tỏ việc sử dụng mồi không phù hợp để nhân gen rbcL từ mẫu DNA Na Dai M 500 bp Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen rbcL Ghi chú: M: marker 100bp; gi ng 1-5: mẫu ND1-ND5 27 3.2.2 K t nhân gen matK Trong số gen lục lạp, matK gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thƣớc khoảng 1.550 bp mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến q trình loại bỏ intron loại trình phiên mã RNA Do gen matK tiến hố nhanh có mặt hầu hết loài thực vật nên gen matK đƣợc sử dụng nhƣ thị DNA mã vạch nghiên cứu mối quan hệ loài phát sinh loài thực vật [21; 25] Sử dụng cặp mồi: P9F: 5‟- GAA CTC GTC GGA TGG AGT G -3‟ P9R: 5‟- GAG AAA TCT TTT TCA TTA CTA CAG TG - 3‟ để nhân gen matK Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% (hình 3.3) cho thấy gen matK chƣa đƣợc khếch đại, có mẫu có lên băng DN kích thƣớc khoảng 200 bp (giếng số 5) nhƣng lại có băng phụ Mặc dù, thay đổi chu trình phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi khác nhƣng lần lặp lại kết tƣơng tự nhau, chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi kh ng phù hợp để nhân gen matK từ mẫu DNA giống Na Dai M 5 500 bp 200 bp Hình 3.3 Ản điện di sản ph m PCR nhân gen matK Ghi chú: M: marker 100bp; gi ng 1-5: mẫu ND1-ND5 28 3.2.3 K t nhân gen trnH – PbsA Sử dụng cặp mồi P10F: 5‟- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC 3‟ P10R : 5‟- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC -3‟ để nhân đoạn gen PsbA- trnH Kết kiểm tra sản phầm PCR điện di gel agarose 1% cho thấy gen chƣa đƣợc khuếch đại, kh ng thu đƣợc băng DN (Hình 3.4) Mặc dù, thay đổi chu trình phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi khác nhƣng lần lặp lại kết tƣơng tự nhau, chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi kh ng phù hợp để nhân gen PsbA- trnH từ DN giống Na Dai M Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen trnH - PbsA Ghi chú: M: marker 100bp; gi ng 1-5: mẫu ND1-ND5 3.2.4 K t nhân gen trnL Gen trnL trình tự gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều loài thực vật Trình tự gen trnL đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng mối quan hệ hệ sinh thái lồi có liên quan chặt chẽ để định danh loài thực vật [5; 16] Sử dụng cặp mồi: P11F: 5' - CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG - 3' P11R: 5' - GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC - 3' để nhân đoạn gen trnL Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% cho thấy gen trnL đƣợc khuếch đại tốt tất mẫu nghiên cứu, băng DN 29 thu đƣợc sáng rõ có băng vạch với kích thƣớc khoảng 650 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp) M 650 bp 500 bp Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen trnL Ghi chú: M: marker 100bp; gi ng 1-5: mẫu ND1-ND5 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen trnL khuyếch đại PCR thành công tất mẫu Ở mẫu thu đƣợc băng DN nét, kh ng có băng DN sáng rõ phụ xuất hiện, kích thƣớc khoảng 650 bp phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen trnL dự kiến nhân (Hình 3.5) Kết lần khẳng định chất lƣợng kích thƣớc đủ lớn nhƣ kh ng lẫn băng phụ gây ảnh hƣởng đến giải trình tự, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.3 Kết xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen trnL Kết giải trình tự gen trnL thủ đƣợc cho thấy trình tự nucleotide gen trnL mẫu Na Dai giống 100% 30 Trình tự đoạn gen trnL phân tích đƣợc có kích thƣớc 657 bp, gần với kích thƣớc dự đoán 650 bp Khi so sánh đoạn gen phân tích đƣợc với trình tự gen lồi A Squamosa lấy ngân hàng gen NCBI, cho thấy tƣơng đồng lồi 99%, có khác vị trí: Thay A T vị trí Nu thứ 289 thay C T vị trí Nu thứ 299 31 Sau nhận đƣợc thơng tin xử lý trình tự phần mềm BioEdit đối chiếu với thông tin ngân hàng GenBank (NCBI), so sánh MUSCLE, chọn lồi có độ tƣơng đồng cao là: A Pruinosa mã số EU420438.1, A Dumetorum mã số GQ139879.1, A Bicolor mã số EU420837.1, A squamosa mã số KT452845.1, A.urbaniana mã số EU420849.1, A Haitiensis mã số EU669544.1 để so sánh, kết thu đƣợc trình tự nhƣ sau: CLUSTAL multiple sequence alignment by MUSCLE (3.8) A.pruinosa GGTATGGAAACCTACTAAGTGAGAACTTCCAAACTCAGAGAAACCCCGGAAT A.dumetorum -GGAAACATACTAAGTGAGAACTTCCAAACTCAGAGAAACCCCGGAAT A.bicolor TACTAAGTGAGAACTTCCAAACTCAGAGAAACCCCGGAAT A.squamosa TGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTTAGTGAGAACTTCCAAATTCAGAGAAACCCCGGAAT Nadai TGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTTAGTGAGAACTTCCAAATTCAGAGAAACCCCGGAAT A.urbaniana GGTATGGAAACCTACTAAGTGAGAACTTCCAAACTCAGAGAAACCCCGGAAT A.haitiensis -AAT *** A.pruinosa TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA A.dumetorum TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA A.bicolor TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA A.squamosa TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA Nadai TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA A.urbaniana TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA A.haitiensis TAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAAACAAGGTTCAGAAAGCGAGA ************************************************************ A.pruinosa ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT A.dumetorum ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAACGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT A.bicolor ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAACGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT A.squamosa ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT Nadai ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT A.urbaniana ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT A.haitiensis ATCAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATAGAGTTGACT ****************************** ***************************** A.pruinosa GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCCTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG A.dumetorum GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCCTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG A.bicolor GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCCTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG A.squamosa GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCCTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG Nadai GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCCTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG 32 A.urbaniana GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCGTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG A.haitiensis GCATCGGTAAGGGAATTCTTTCGTTTTATCCAAACGACAGAAAGGATGACCTTGTATACG ********************** ** ********************************** A.pruinosa TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGG -TTTTTTT A.dumetorum TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGG TTTTTTTTTT A.bicolor TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGG TTTTTTTTTT A.squamosa TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGGTTTTTTTTTTTT Nadai TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGGATTTTTTTTTCT A.urbaniana TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGG TTTT A.haitiensis TACGTATACATACTGAAACATCAAACGATTAATCACGACTCGAATCGG TTTT ******************** *************************** * * A.pruinosa TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC A.dumetorum TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC A.bicolor TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC A.squamosa TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC Nadai TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC A.urbaniana TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC A.haitiensis TTTTCTGAAAAATTTCAGAATAGAAGGATTGTGAATTGATTCCAAGTTGAAGGAAGAATC **** ************* ******* * ************************** A.pruinosa GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG A.dumetorum GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG A.bicolor GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG A.squamosa GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG Nadai GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG A.urbaniana GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG A.haitiensis GAATATTCAGAGATCAAATCATCCATTCCCGAGTCTAATAGATCTTTTGAAGAACCGATG ********************** ******** *************************** A.pruinosa AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT A.dumetorum AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT A.bicolor AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT A.squamosa AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT Nadai AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT A.urbaniana AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT A.haitiensis AATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATACAGACAACAATGAAAT ******************************* **************************** A.pruinosa TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC A.dumetorum TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC A.bicolor TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC A.squamosa TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC 33 Nadai TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC A.urbaniana TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC A.haitiensis TGATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTATAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCC ******** ***************************** ******************* A.pruinosa CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATTATTTATCC A.dumetorum CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATTATTTATCC A.bicolor CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATTATTTATCC A.squamosa CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATAATTTATCC Nadai CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATAATTTATCC A.urbaniana CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATAATTTATCC A.haitiensis CCAACACTATCCCCAAGAAAAAGGCCCATT TTC CCCCCCTAATAATTTATCC ************* *** *********** ********* ******** A.pruinosa TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA A.dumetorum TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA A.bicolor TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA A.squamosa TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA Nadai TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA A.urbaniana TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA A.haitiensis TCTTTTTTGTCAGTTCTTCCAAATTCGTTATGTTTCTCATTCACTCTACTCTTTCACAAA ** ***************************************************** *** A.pruinosa TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATTTACGT A.dumetorum TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATTTACGT A.bicolor TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATTTACGT A.squamosa TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATTTACGT Nadai TGGAT - A.urbaniana TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATCTACGT A.haitiensis TGGATCCGACCAGAAATGTTTCTCTCTTATCGCAGGTTTTGTGATAGATATGATCTACGT ***** A.pruinosa ACATGCGTACAAATGAACAGATAATGAATAGGCAAGGAATCTCCACTATTGAATCATTCA A.dumetorum ACATGCGTACAAATGAACAGATAATGAATGGGCAAGGAATCTCCACTATTGAATCATTCA A.bicolor ACATGCGTACAAATGAACAGATAATGAATGGGCAAGGAATCTCCACTATTGAATCATTCA A.squamosa ACATGCGTACAAATGAACAG Nadai A.urbaniana ACATGCGTACAAATGAACAGATAATGAATGGGCAAGGAATCTCCACTATTGAATCATTCA A.haitiensis ACATGCGTACAAATGAACAGATAATGAATGGGCAAGGAATCTCCACTATTGAATCATTCA A.pruinosa CAGTAATATCATTACTCTTATACAAAGTCTTC-TTTTTTCAGGGCCAGGGAATTCCAGGG A.dumetorum CAGTAATATCATTACTCTTATACAAAGTCTTC-TTTTTTCAGGGCCAGGGAATTCCAGGG A.bicolor CAGTAATATCATTACTCTTATACAAAGTCTTC-TTTTTTCAGGGCCAGGGAATTCCAGGG 34 A.squamosa Nadai A.urbaniana CAGTAATATCATTACTCTTATACAAAGTCTTC-TTTTTTCAGGGCCAGGGAATTCCAGGG A.haitiensis CAGTAATATCATTACTCTTATACAAAGTCTTC-TTTTTTCAGGGCCAGGGAATTCCAGGG A.pruinosa CCTAGGTGAGCTTTTGTAATGTTTTTTGAGTCTCTTTAATTTCATTGACATAGACTCAAG A.dumetorum CCTAGGTGAGCTTTTGTAATGTTTTTTGAGTCTCTTTAATTTCATTGACATAGACTCAAG A.bicolor CCTAGGTGAGCTTTTGTAATGTTTTTTGAGTCTCTTTAATTTCATTGACATAGACTCAAG A.squamosa Nadai A.urbaniana CCTAGGTGAGCTTTTGTAATGTTTTTTGAGTCTCTTTAATTTCATTGACATAGACTCAAG A.haitiensis CCTAGGTGAGCTTTTGTAATGTTTTTTGAGTCTCTTTAATTTCATTGACATAGACTCAAG A.pruinosa CCCTCTTCCTCTCGCGGGATGATGCATCGAGACTGGTCGGGATAGCTCAGCAGGTAGAGC A.dumetorum CCCTCTTCCTCTCGCGGGATGATGCATCGAGACTGGTCGGGATAGC A.bicolor CCCTCTTCCTCTCGCGGGATGATGCATCGAGACTGGTCGGGATAGCTCAGCAG - A.squamosa Nadai A.urbaniana CCCTCTTCCTCTCGCGGGATGATGCATCGAGACTGGTCGGGATAGCTCAGCAGGTAGAGC A.haitiensis CCCTCTTCCTCTCGCGGGATGATGCATCGAGACTGGTCGGGATAGCTCAGCAGGTAGAGC A.pruinosa AGAGGAC - A.dumetorum A.bicolor A.squamosa Nadai A.urbaniana AGAGGAC - A.haitiensis AGAGGACTGAAAATCCTC Bảng 3.1 Mức độ tƣơng đồng so sánh mẫu Na Dai nghiên cứu với loài ngân hàng gen NCBI STT Tên loài A pruinosa A dumetorum A bicolor A quamosa A urbaniana A haitiensis Số hiệu gen EU420438.1 GQ139879.1 EU420837.1 KT452845.1 EU420849.1 EU669544.1 35 Mức độ tƣơng đồng (%) 99 99 99 99 98 99 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại Dựa vào kết luận sơ trên, xây dựng quan hệ mẫu nghiên cứu với loài thuộc chi Annona ngân hàng gen NCBI (A pruinosa, A dumetorum, A bicolor, A squamosa, A.urbaniana, A haitiensis) dựa vào kết phân tích đoạn gen trnL thu đƣợc sơ đồ hình (Hình 3.6): Hình 3.6 Cây phân loại dựa gen trnL xây dựng MUSCLE phƣơng pháp Neighbor – joining) Kết phân tích hình 3.6 cho thấy mẫu nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần với loài A squamosa ngân hàng gen, tiếp đến loài A Bicolor loài A Dumetorum 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: 1) Đã tách chiết đƣợc DNA tổng số mẫu Na Dai nhân thành công gen trnL phƣơng pháp PCR từ mẫu DNA Na Dai 2) Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide gen trnL mẫu nghiên cứu, kết cho thấy trình tự nucleotide gen trnL mẫu Na Dai giống 100% 3) Bƣớc đầu đánh giá đƣợc tƣơng quan mối quan hệ di truyền loài Na Dai Thái Nguyên so với loài khác chi Na Kiến nghị: 1) Tiếp tục nghiên cứu thiết kế cặp mồi thích hợp cho việc nhân gen rbcL, matK PsbA– trnH từ mẫu DNA Na Dai 2) Tiếp tục nhân gen rbcL, matK, PsbA–trnL từ mẫu DNA Na Dai để tiến hành giải trình nucleotide xác định đoạn DN đặc trƣng 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Hà Văn Huân (2015), Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN (mã vạch DN ) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam ài liệu tiếng anh Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, 6: 558-576 Chao-Ming L., Ning-Hua T., Hui- Lan Z and Jun Z (1998) “ Cyclopeptide from the seeds of Annona muricata.” Phytochemistry, 48 (3): 555-556 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DN barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462): 1889 - 1895 Chen S.Y., Xia T., Wang Y.J., Liu J.Q., Chen S.L (2005) Molecular systematics and biogeography of Crawfurdia, Metagentiana and Tripterospermum (Gentianaceae) based on nuclear ribosomal and plastid DNA sequences Ann Bot 96: 413 – 424 F O (1990) “ Utilization of Tropical Food, Fruits and leaves” F O Food and Nutrition paper, 47 (7): 44 – 53 Hernández C R and ngel D N (1997) “ nonáceas com Propriedades Insecticidas.” [Portuguese] Annáceas: Produc ão e Mercado Edit by Moái O M and Reboucas T N H : 229 – 239 Hebert P, Ball S L, De Waard J R., (2003) Biological indentification through DNA barcodes Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270: 313 – 321 Hopp D C., Zeng L., Gu Z M and McLaughlin J L (1997) “ Novel Monotetrahydrofuran Ring Acetogenins, from the Bark of Annona squamosal, Showing Cytotoxic Selectivities from the human Pancreatic Carcinoma Cell Line, PACA -2.” Journal of Natural Product, 60: 581 - 586 10 Kress W J., Erickson D L (2008), “DN barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8): 2761 – 2762 11 Lizana L and Reginato G (1990) “Cherimoya” In: Fruits of Tropical and Subtropical Origin: Composition, Properties and Uses Edited by S Nagy, Shaw P E, Lake Alfrea, Florida, USA : 131-148 12 Mishara , Sing J N and Jha O P (1997) “Post Cotial Antifertility Activi of Anonacese in Italy.” Mesfin Newletter, 3(1): 11-12 13 Nerea Larranaga and José L Hormaza (2015) “DN barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona ( Annonaceae) 14 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DN barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2): 4598 15 Ochse J J., Soule Jr M J and Wehlburg C (1994) “Otros Cultivos Frutales.” [Spainsh] In: Cultivo y Mejoramiento de Plantas Tropicades Subtropicales Editoryial by Limusa, México 587-818 16 Pinto A C de Q, Cordeiro M C R, Andrade S R M de, Fereira F R, Kinpara D I, (2005),“ nnona species”, International Center for Underuilised, University of Southampton, Southampton, SO17 1BJ, UK, 3-40 17 Pandey G P and Varma B K (1997) “ nnona Seed Power as a Protectant of Mung Agaist Pulse Beetle, Callosobruchus maculatus (Fabr)” Bulletin of GrainTechnology,15 (2) : 100-1-4 18 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (U ) intron for plant DN barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 19 Savolainen V., and Chase M W (2003), “ decade of progress in plant molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19): 717-724 20 Scharaschklin T., Doyle J.A.( 2005) Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 21 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007) “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94): 275-288 22 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, 268(1-4): 235-256 23 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto renas M ., Culham , Chase M W (2000), “ phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DN ”, Lindleyana 15: 96114 24 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DN barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 25 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DN barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540 26 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DN barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205 27 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of singlecopy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: test case in the euasterid plant clade”, Genetics, 174: 1407-1420 28 Wu Leng W T and Flores M (1996) Tabla de composici ón de alimentos para uso en America Latina [Spain] INCAP-ICNND, Ciuda de Guatemala, Guatemaa : 132 29 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DN barcode for plants and animals”, PLoS ONE, 5: 13102 30 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (2010) “ uthentication of Taxillus chinensis using DN barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 Tài liệu internet: 31.http://caytrongvatnuoi.com/cay-trong/ky-thuat-trong-va-cham-soc-cay-na/ 32 http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=book/export/html/325 ... quyền giống sản phẩm chúng Ở Việt Nam nay, chƣa có nghiên cứu xác định mã vạch DNA ADN cho na Vì vậy, việc nghiên cứu xác định số thị mã vạch DN cho giống Na Dai Võ Nhai đặc sản tỉnh Thái Nguyên. .. nghiên cứu ? ?Nghiên cứu xác định đoạn mã vạch DNA giống Na Dai (Annona sqamosa L.) Võ Nhai, Thái Nguyên? ?? làm sở cho việc nhận diện xác giống sản phẩm Na Dai Võ Nhai, Thái Nguyên CHƢƠNG TỔNG QUAN... TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU À PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Xác định trình tự đoạn mã vạch DNA giống Na Dai (Annona sqamosa L.) Võ Nhai, Thái Nguyên nhằm cung cấp sở khoa học thực