Phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HUYỀN TRANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN CHÍ THUẬN Học viên: NGUYỄN HUYỀN TRANG Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Chí Thuận Trưởng phịng Cơng nghệ Phơi - Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Uyên, người giúp đỡ tận tình bảo tơi q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Một lần tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Huyền Trang Bảng chữ viết tắt APW Alkaline Pepton Water bp Base pair CFU Colony-Forming Unit DNA Deoxyribonucleic acid IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside kb Kilobase pair LB Luria - Bertani NB Nutrient broth PCA phenazine - 1carboxylic PCN Pyocyanin PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SAM S-adenosylmethionine TCA Trichloroacetic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Cấu trúc gen 1.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 10 1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống 10 1.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn 10 1.1.5 Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 11 1.2 Hoạt chất pyocyanin 12 1.2.1.Cấu trúc pyocyanin tham gia gen 12 1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn pyocyanin 13 1.2.3 Ứng dụng hoạt chất pyocyanin 14 1.3.Tổng quan Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Vibrio sp gây tôm 15 1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh: 15 1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ 17 1.3.3 Các phương pháp phòng ngừa điều trị 18 1.3.2.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp 18 1.3.2.2 Điều trị 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Thiết bị 21 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: 22 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng sinh học phân tử: 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp vi sinh 25 2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn môi trường King A 25 2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái vi khuẩn 26 2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme vi khuẩn 26 2.2.1.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 27 2.2.1.5 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: 27 2.2.1.6 Phương pháp tách chiết xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32] 28 2.2.1.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối nồng độ hoạt chất vi khuẩn 28 2.2.1.8 Phương pháp xác định khả kháng Vibrio sp: 28 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 29 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29 2.2.2.2 Phương pháp PRC khuếch đại gen 30 2.2.2.3 Phương pháp điện di 32 2.2.2.4 Phương pháp làm sản phẩm PCR 33 2.2.2.5 Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) 34 2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen 36 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết phân lập xác định P aeruginosa phương pháp vi sinh vật 38 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn P aeruginosa môi trường King A 38 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 3.1.2 Kết nhuộm Gram 39 3.1.3 Kết nghiên cứu hoạt tính enzyme 40 3.1.4 Kết thử hoạt tính kháng kháng sinh 41 3.2 Kết xác định P aeruginosa phương pháp sinh học phân tử 42 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 42 3.2.2 Kết PCR gen đặc hiệu P aeruginosa (PA): 43 3.2.3 Kết PCR gen 16s rRNA 44 3.2.4 Kết tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA 45 3.2.5 Kết giải trình tự gen 16s rRNA định tên vi khuẩn 47 3.3 Kết nghiên cứu khả sinh hoạt chất kháng Vibrio sp P.aeruginosa PS39 51 3.3.1 Kết xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn nồng độ hoạt chất 51 3.3.2 Kết xác định khả kháng Vibrio dịch nuôi vi khuẩn hoạt chất PCN 54 3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp 56 3.3.4 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Phụ lục 74 Phụ lục 75 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh ni trồng thủy sản nhằm phịng hạn chế bệnh nhiễm khuẩn ngày trở nên phổ biến Vì vậy, đề kháng kháng sinh vi sinh vật tăng lên nhiều, số kháng sinh đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại giới hạn Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh mối lo không người nuôi mà nhà quản lý sức khỏe cộng đồng khơng làm giảm hiệu điều trị mà tiềm ẩn nhiều nguy sức khỏe người Mặt khác, quan ngại hạn chế việc sử dụng kháng sinh nuôi thủy sản nên nghiên cứu hướng quan tâm đến chất thay có nguồn gốc thiên nhiên, chất không gây đề kháng khuẩn tồn dư vật nuôi ảnh hưởng tới môi trường Pseudomonas sp vi khuẩn phổ biến tìm thấy đất, nước, hệ vi sinh vật da môi trường nhân tạo khắp giới Chúng vi sinh vật có giá trị thương mại cơng nghệ sinh học Trong chế phẩm sinh học, Pseudomonas sử dụng probiotic kiểm soát sinh học nấm gây bệnh vi khuẩn nông nghiệp, phẩy khuẩn nuôi trồng thủy sản Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả tiết nhiều loại sắc tố hợp chất có tính kháng khuẩn Trong đó, hợp chất phenazine Pseudomonas sp tiết môi trường hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng Phenazine nhóm sắc tố Pseudomonas sp tiết bao gồm: pyocyanin PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) phenazine1-carboxamide Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, chiết chloroform, phenazine có sắc tố màu xanh Nghiên cứu tách chiết, tính chất ứng dụng pyocyanin tiến hành nhiều phịng thí nghiệm giới: Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010) Sắc tố xác định có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], Vibrio sp gây bệnh nuôi trồng thủy sản [66] Phân lập điều tra cho thấy pyocyanin có tính kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp V parahaemolyticus , V vulnificus , V alginolyticus , V fluvialis , V Proteolyticus, V harveyi ứng dụng cho chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản Đề tài nghiên cứu: “Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi” thực nhằm mục đích phân lập chủng Pseudomonas sp có khả sinh hoạt chất kháng Vibrio gây bệnh tôm ni, góp phần điều trị bệnh giúp tăng suất tôm nuôi Việt Nam Nhiệm vụ đặt cho đề tài là: 1.Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả kháng lại vi khuẩn gây bệnh tôm nuôi Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn 3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas chi vi khuẩn xuất nơi môi trường Sự biến dưỡng dễ thay đổi linh động chúng làm cho chúng sống nhiều môi trường khác nước, đất, động vật Vi khuẩn không phát triển mơi trường khơng khí bình thường, mà cịn sống mơi trường có khí oxy, cư trú nhiều mơi trường tự nhiên nhân tạo Vi khuẩn dinh dưỡng nhiều hợp chất hữu động vật Trong số lồi Pseudomonas này, có lồi tiêu biểu sử dụng cơng nghệ sinh học Một số lồi Pseudomonas aeruginosa Hình 1.1: Khuẩn lạc P aeruginosa mơi trường King A 1.1.1 Phân loại Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 17 Balcht, Aldona & Smith, Raymond (1994) Pseudomonas aeruginosa: Infections and Treatment Informa Health Care pg 83–84 18 Baron S.S., Terranova G., Rowe J.J (1981) “Antibiotic action of Pyocyanin” Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Dec 1981, p 814-820 19 Baron S.S., Terranova G., Rowe J.J (1989) “Molecular mechanism of the antimicrobial action of Pyocyanin” Curr Microbiol 18:223–230 20 Botzenhardt K., and Doring G (1993) Ecology and epidemiology of Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa as an Opportunistic Pathogen p 1-7 21 Brown, RW (1956) Composition of Scientific Words Smithsonian Institutional Press 22 Chanratchakool et all (1994) Health Management in shrimp ponds Published by Aquatic Animal Health Research Institute Department of Fisheries Kasrtsart University Campus Jatujak Bangkok Thailand 23 Collins FM (1955) “Effect of aeration on the formation of nitrate-reducing enzymes by P aeruginosa” Nature 175 (4447): 173–4 24 Cooper M, Tavankar GR, Williams HD (2003) “Regulation of expression of the cyanide-insensitive terminal oxidase in Pseudomonas aeruginosa” Microbiology 149 (Pt 5): 1275–84 25 Cornelis P (editor) (2008) Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology (ấn 1) Caister Academic Press 26 Costerton W., and Anwar H (1994) “Pseudomonas aeruginosa: The Microbe and Pathogen” Pseudomonas aeruginosa Infections and Treatment p.117 27 Cox C (1993) Iron and the Virulence of Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa : The Opportunist p 41-45 64 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 28 Craig W., and Ebert S (1994) “Antimirobial Therapy in Pseudomonas aeruginosa Infections” Pseudomonas aeruginosa Infections and Treatment p 470-491 29 Das T., Kutty S.K., Kumar N., Manefield M (2013) “Pyocyanin facilitates extracellular DNA binding to Pseudomonas aeruginosa influencing cell surface properties and aggregation” PLoS One 8(3):e58299 30 Delden C (2004) Virulence Fators in Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas pp 1-7 31 Enass G Sweedan (2010) Study the effect of “Antibiotics on Pyocyanin production from Pseudomonas aeruginosa and Pyocyanin as Antibiotic against different pathogenic bacteria” J of university of anbar for pure science: Vol.4:NO.1 32 Essar D W., Eberly L., Hadero A & Crawford, I P (1990) “Identification and characterization of genes for a second anthranilatesynthase in Pseudomonas aeruginosa: interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications” J Bacteriol 172, pp.884–900 33 Fick, R Pseudomonas aeruginosa —the Microbial Hyena and Its Role in Disease: An Introduciton Pseudomonas aeruginosa : The Opportunist 1993 pp 1-6 34 Flegel TW (2012) “Historic emergence, impact and current a status of shrimp pathogens in Asia” J Invertebr Pathol 110:166-173 35 Fontoura R., Spada J.C., Silveira S.T., Tsai S.M., Brandelli A (2009) “Purification and characterization of an antimicrobial peptideproduced by Pseudomonas sp strain 4B” World J Microbiol Biotechnol 25:205–213 65 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 36 Gilardi G (1985) “Cultural and Biochemical Aspects for Identification of Glucose-Nonfermenting Gram-Negative Rods” Nonfermenting Gram-Negative Rods 1985 p.17-24 37 Gohain et al.(2006).”The purification, crystallization and preliminary structural characterization of FAD-dependent monooxygenase PhzS, a phenazinemodifying enzyme from Pseudomonas aeruginosa”.Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications (Impact Factor: 0.55) 11/2006; 62(Pt 10):989-92 38 Hassan H M and Fridovich I (1980) “Mechanism of the Antibiotic Action of Pyocyanine” Journal of Bacteriology, Jan 1980, 141(1): 156-163 39 Hassanein W.A., Awny N.M., El-Mougith A.A and Salah El-Dein S.H (2009) “Characterization and antagonistic activities of metabolite produced by Pseudomonas aeruginosa Sha8” Journal of Applied Sciences Research, 5:392– 403 40 Hassanein W.A., Awny, M., El-Mougith, A.A and Salah El-Dien, S.H (2009) “The Antagonistic Activities of Some Metabolites Produced by Pseudomonas aeruginosa Sha8” Journal of Applied Sciences Research, 5(4): 404414 41 Hassett D.J (1996) “Anaerobic production of alginate by Pseudomonas aeruginosa: alginate restricts diffusion of oxygen” J Bacteriol 178 (24): 7322–5 42 Herbert R B., Holliman F.G and Sheridan J B (1974) Biosynthesis of iodinin: incorporationof D- [1-14C]-, D- [6-14C]- and D- [1,6,7-14C3] shikimic acid Tetrahedron Letters, 4201-4204 43 Herbert R B., Holliman F.G and Sheridan J B (1976) Biosynthesis of microbial phenazines :incorporation of shikimic acid TetrahedronLetters, 639642 66 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 44 Ho Sui S.J., Lo R., Fernandes A.R., Caulfield M.D.G., Lerman J.A., Xie L., Bourne P.E., Baillie D.L., Brinkman F.S.L (2012) “Raloxifene attenuates Pseudomonas aeruginosaPyocyanin production and virulence” Int J Antimicrob Agents 40:246–251 45 Hollstein U., Larry G Marshall (1972) “Biosynthesis of phenazines” J Org Chem., 1972, 37 (22), pp 3510–3514 46 Hollstein U and McCamey D A (1973) “Byosynthesis of phenazine II Incorporation of [6 - 14+ C]-D-Shikimic acid into phenazine-1-carbocylic acid and iodinin”, J Org Chem., 38: 3415-3417 47 Iglewski BH (1996) Pseudomonas In: Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.) (ấn 4) Univ of Texas Medical Branch 48 Irasema E Luis-Villaseñor, Ángel I Campa-Córdova, Nolberta HuertaAldaz, Antonio Luna-González, José M Mazón-Suástegui1 and Francisco FloresHiguera ( 2013) “Effect of beneficial bacteria on larval culture of Pacific whiteleg shrimp” Litopenaeus vannamei African Journal of Microbiology Research Vol 7(27), pp 3471-3478, July, 2013 49 Jamileh Nowroozi (2012) “Pyocyanine Biosynthetic Genes in Clinical and Environmental Pyocyanine’s Isolates of Antimicrobial Pseudomonas Effects with aeruginosa or without and Detection Colloidal of Silver Nanoparticles” Cell Journal (Yakhteh), Vol 14, No 1, 7-18 50 Jesus G.M., Silvia G.A., Ana I.A and Ftancisco R.V (1999) “Use of 16s 23s ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity” Journal Microbiol Methods 36: 55 - 64 51 Johnson, G., and Olsen, R (1997) “Multiple Pathways for Toluene Degradation in Burkholderia sp Strain JS150.” Applied and Environmental Microbiology, Volume 63 p 4047-4052 67 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 52 Jyoti Joshia, Jiraporn Srisalaa, Viet Hong Truong, Tung Chend, Bunlung Nuangsaenge, Orasa Suthienkulf, Chu Fang Lod, Timothy W Flegela, Kallaya Sritunyalucksanaa, Siripong Thitamadeea, (2014) “Variation in Vibrio parahaemolyticus isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)” Aquaculture Volumes 428–429, 20 May 2014, Pages 297–302 53 Karpagam S., Sudhakar T., Lakshmipathy M (2013) “Microbicidal response of Pyocyanin produced by P aeruginosa toward clinical isolates of fungi” Int J Pharm Pharm Sci 5:870–873 54 Kasozi D.M., Gromer S., Adler H., Zocher K., Rahlfs S., Wittlin S., FritzWolf K., Schirmer R.H., Becker K (2011) “The bacterial redox signaller Pyocyanin as an antiplasmodial agent: comparisons with its thioanalog methylene blue” Redox Rep 2011;16(4):154-65 55 Kerr J.R., Taylor G.W., Rutman A., Hoiby N., Cole P.J & Wilson R (1999) “PseudomonasaeruginosaPyocyanin and 1-hydroxyphenazine inhibit fungal growth” Journal of Clinical Pathology, 52: 385-387 56 Khamdan K., Suprapta D.N (2011) “Induction of plant resistance against soyabean stunt virus using some formulations of Pseudomonas aeruginosa” J ASSAAS 17:98–105 57 Khare E., Arora N.K (2011) “Dual activity of Pyocyanin from Pseudomonas aeruginosa—antibiotic against phytopathogen and signal molecule for biofilm development by rhizobia” Can J Microbiol 57:708–713 58 King E.O., Ward M.K., Raney D.E (1954) “Two simple media for the demonstration of Pyocyanin and fluorescin.” J Lab Clin Med 44 (2): 301–7 59 Lederberg, Joshua et al (2000) “Pseudomonas Encyclopedia of Microbiology” Second Edition, Volume 3, San Diego, 2000 p 876-891 68 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 60 Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.L., Tran L.H (2012) “Early mortality syndrome affects shrimp in Asia” Glob Aquacult Advocate Jan/Feb 2012: 40 Editorial responsibility: Grant Stentiford, Weymouth, UK 61 Lundgren B.R., Thornton W., Dornan M.H., Villegas-Peñaranda L.R., Boddy C.N., Nomura C.T (2013) “Gene PA2449 is essential for glycine metabolism and Pyocyanin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa PAO1” J Bacteriol 195:2087–3000 62 Millican R C (1962) “Biosynthesis of Pyocyanine” Can J Microbiol 9: 809-819 63 Mohamed M Gharieb, Mostafa M.El-Sheekh, Sabha M.El-Sabbagh, Walaa T.Hamza (2013) “Efficacy Of Pyocyanin Produced By Pseudomonas aeruginosa As A Topical Treatment Of Infected Skin Of Rabbits” Biotechnology Vol 7, Issue 64 National Center for Biotechnology Information site (NCBI) 65 P aeruginosa PA14 Genomic Sequencing Project 66 Pai S.S., Anas A.A., Jayaprakash N.S., Priyaja P., Sreelakshmi B., Philip R.,Mohandas A & Bright Singh I.S (2010) “Penaeus monodon larvae can be protected from Vibrioharveyi infection by preemptive treatment of rearing system with antagonistic or nonantagonistic bacterial probiotics” Aquaculture Research 41, p 847-860 67 Parsons J.F., Greenhagen B.T., Shi K., Calabrese K., Robinson H., Ladner J.E (2007) “Structural and functional analysis of the Pyocyanin biosynthetic protein Phz M from Pseudomonas aeruginosa” Biochemistry 46:1821–1828 68 Pattamarat Rattanachuay (2010) “Inhibition of shrimp pathogenic Vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3” Journal of Biotechnology Vol.13 No.1, Issue of January 15 69 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 69 Pattamarat Rattanachuay, Duangporn Kantachote,Manee Tantirungkij (2010) “AntiVibrio compounds produced by Pseudomonas sp W3:characterisation and assessment of their safety to shrimps” World J Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s11274-010-0529 70 Pieper D., Stadler-Fritzche K., Scholomann M., and Knackmuss H (1992) “Metabolism of 2-Chloro-4-Methylphenoxyacetate by Alcaligenes eutrophus JMP 134: Implications for the Degradation of Chloro- and Methyl-Substituted Aromatics via ortho Cleavage” Pseudomonas Molecular Biology and Biotechnology 1992 p 268-272 71 Pierson L.S., Pierson E.A (2010) “Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of the bacteria in the environment and biotechnological process” Appl Micorbiol Biotechnol 18:1659–1670 72 Porter R.C (2009) Studies in pigment production by Pseudomonas aeruginosa M.S thesis, Texas Tech University, TX, 59 p 73 Prabhakaran Priyajal (2012) Pyocyanin (5-methyl-1-hydroxyphenazine) Produced by Pseudomonas aeruginosa as Antagonist to Vibrios in Aquaculture: Overexpression, Downstream Process and Toxicity National Centre for aquatic animal health Cochin University of science and technology Kochi 682016, Kerala, India Thesis Doctor of Philosophyin marine biotechnology Chape Toxicity of Pyocyanin on various biological systems, p 94-127 74 Prabhakaran Priyajal (2014) “Antogonistic effect of Pseudomonas aeruginosa isolates from various ecological niches on Vibrio species pathogenic to crustaceans” Journal of Coastal Life Medicine 2014; 2(1): 76-84 75 Preetha R., Jose S., Prathapan S., Vijayan K.K., Jayaprakash N.S., Philip R and Bright Singh I.S (2010) “An inhibitory compound produced by Pseudomonas with effectiveness on Vibrio harveyi” Aquaculture Research 41, 1452-1461 70 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 76 Priest F.G and Austin B (1993) “Modern bacterial taxonomy”, Chapman and Hall, pp 50 - 94 77 Pseudomonas Genome Database 78 Rabaey K., and Verstraete W (2005) “Microbial Fuel Cells: novel biotechnology for enegy generation” TrendS in Biotechnology, Volume 23 79 Rojo F., and Dinamarca A (2004) Catabolite Repression and Physiological Control Pseudomonas 2004 p 365-366 80 Ryan K.J., Ray C.G (editors) (2004) Sherris Medical Microbiology (ấn 4) McGraw Hill 81 Saha S., Thavasi R., Jayalakshmi S (2008) “Phenazine pigments from Pseudomonas aeruginosa and their application as antibacterial agent and food colourants” Res J Microbiol 3:122–128 82 Saosoong K., Wongphathanakul W., Paorsiri C., Ruangviriyachi C (2009) “Isolation and analysis of antibacterial substance produced from Pseudomonas aeruginosa TISTR 781” KKU Sci J 37:163-172 83 Scott Angell, Bennie J Bench, Howard Williams (2006) “Pyocyanin Isolated from a Marine Microbial Population: Synergistic Production between Two Distinct Bacterial Species and Mode of Action” Chemistry & Biology 13, 1349– 1359, 84 Sheeba J (2007) “Isolation, pigment production, antifungal activity and antibiogram pattern of Pseudomonas aeruginosa” - a study M.Phil., Thesis, Bharathidasan University, 39 p 85 Spilker T et al (2004) “PCR-Based Assay for Differentiation of Pseudomonas aeruginosa from Other Pseudomonas species Recovered from Cystic Fibrosis Patients” J.Clin Mcrobiol Vol 42, No 5; 2074–2079 71 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 86 Stanisich V., and Richmond M (1075) “Gene Transfer in the Genus Pseudomonas” Genetics and Biochemistry of Pseudomonas 1975 p 170-175 87 Stover K., Pham Q., Erwin L., Mizoguchi D., Warrener P., Hickey J., Brinkman L., Hufnagle O., Kowalid D., M Lagrou, R.L Garber, L Goltry, E Tolentino, S Westbrock-Wadman, Y Yuan, L.L Brody, S.N Coulter, Folger,R., Kas A., Larbig K., Lim R., Smith K., Spencer D., Wong K.,Wu Z., Paulsenk J., Reizer Z., Saier H., Hancock R., Lory S., and Olson V (2000) “Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen” Nature 2000 Volume 406 p 961-964 88 Sudhakar T., Karpagam S., Shiyama S (2013) “Antifungal efficacy of Pyocyanin produced from bioindicators of nosocomial hazards” Int J ChemTech Res 5:1101–1106 89 Sweden E.G (2010) Study the effect of “Antibiotics on Pyocyanin production from Pseudomonas aeruginosa and Pyocyanin as antibiotic against different pathogenic bacteria” J Univ Anbar Pure Sci 4:15–18 90 Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete (2004) “The impact of mutation in quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrioanguillarum and Vibrioharveyi on their virulence towards gnotobiotically culture Artemia franciscana” Ghent University, Belgium 91 Valls M., Cases I., and Lorenzo V (2004) “Transcription Mediated by rpoN-Dependent Promoters” Pseudomonas 2004 p 398-302 92 Waksman S.A., Woodruff H.B (1940) “The soil as a source of microorganisms antagonistic to disease producing bacteria” J Bacteriol 40:581– 600 93 Wiehlmann L., Wagner G., Cramer N., Siebert B., GudowiusP., Morales G., Ko T., Delden C., Weinel C., Slickers P., and Tu B (2007) “Population structure 72 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang of Pseudomonas aeruginosa ” Preceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007 Volume 104 p 8101–8106 94 Williams H.D., Zlosnik J.E., Ryall B (2007) “Oxygen, cyanide and energy generation in the cystic fibrosis pathogen Pseudomonas aeruginosa” Adv Microb Physiol 52: 1–71 doi:10.1016/S0065-2911(06)52001-6 95 Worlitzsch D., Tarran R., Ulrich M., et al (2002) “Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonasinfections of cystic fibrosis patients” J Clin Invest 109 (3): 317–25 doi:10.1172/JCI13870 96 Young C (1947) “Pigment production and antibiotic activity in cultures of Pseudomonas aeruginosa” J Bact 54, 109 Tài liệu Web 97 http://aquanetviet.org/post/1885627/t-ng-quan-v-s-d-ng-ch-ph-m-sinh-h-cprobiotics-ki-m-so-t-d-ch-b 98 http://www.framelco.com/eng/products/feed-additives-monoglycerides The Netherlands 1-Monoglycerides May Prevent EMS June 21, 2013 99 http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa#cite_ref-7 73 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Phụ lục LOCUS DEFINITION sequence ACCESSION VERSION SOURCE ORGANISM KJ579 Pseudomonas 1529 bp aeruginosa DNA strain linear BCT 22-APR-2014 PS39 16S ribosomal RNA gene, partial KJ579953 KJ579953.1 GI:612340567 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas REFERENCE (bases to 1529) AUTHORS Thuan,N.C., Uyen,N.H and Trang,N.H TITLE Pseudomonas aeruginosa pyocyanin and antibacterial activity JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1529) AUTHORS Thuan,N.C., Uyen,N.H and Trang,N.H TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (14-MAR-2014) Embryotechnology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Hanoi 10 000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1529 /organism="Pseudomonas aeruginosa" /mol_type="genomic DNA" /strain="PS39" /db_xref="taxon:287" /collected_by="N.C Thuan" rRNA 1529 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 61 ggatgaaggg agcttgctcc tggattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 121 gcctggtagt gggggataac gtccggaaac gggcgctaat accgcatacg tcctgaggga 181 gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 241 ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 301 cactggaact gagacacggt ccagactcct acggggggca gcagtgggga atattggaca 361 atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag 421 cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca 481 gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta 541 atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcag caagttggat gtgaaatccc 601 cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagcta gagtacggta gagggtggtg 661 gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 721 accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 781 accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag 841 tggcgcagct aacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 901 aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 961 aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1021 gagctcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgagat gttgggttaa 1081 gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgg gcactctaag 1141 gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta 1201 cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg 1261 gagctaatcc cataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1321 gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc cgggccttgt 1381 acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgctccaga agtagctagt ctaaccgcaa 1441 gggggacggt taccacggag tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1501 ggggaacctg cggctggatc acctcctta 74 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang Phụ lục So sánh trình tự gen 16s rRNA chủng PS39 với trình tự gen chủng vi khuẩn lấy ngân hàng gen: * 20 * 40 * 60 * 80 * KJ579953 : AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGAC : JN003625 : A : AF125317 HQ288928 : : 97 97 97 : : 97 : A : 97 : : 97 NR_074828 : A : 97 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : : : : - : 100 * 120 * 140 * 160 * 180 * 97 97 96 KJ579953 : GGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATC : 194 JN003625 : : 194 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 : : : : : : 194 194 194 : : 194 : : 194 NR_074828 : : 194 GU566322 EF432565 JQ249910 : : : : 200 * 220 * 240 * 260 * 280 * KJ579953 : TTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGAT : JN003625 : : AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 193 291 : : 291 : : 291 : : 291 : : : : : : : G : NR_074828 : : 300 * 320 * 340 * 360 * 380 KJ579953 : GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGGGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCC : JN003625 : A : AF125317 194 291 291 291 291 290 291 388 : A : 388 : A : 388 : A : 388 : A : 388 NR_074828 : A : 388 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : A : : A : : A : 388 388 388 387 75 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 KJ579953 : GCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATA : JN003625 : : AF125317 HQ288928 : : 485 485 485 : : 485 : : 485 : : 485 NR_074828 : : 485 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : : : : : * 500 * 520 * 540 * 560 * 580 KJ579953 : AGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCA : JN003625 : : JF708186 : : AF125317 HQ288928 : : 485 485 484 582 582 582 : : 582 : : 582 : C : 582 NR_074828 : : 582 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : : : * 600 * 620 * 640 * 660 * 68 582 582 581 KJ579953 : AGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGT : 679 JN003625 : : 679 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 : : : : : : : : : : 679 679 679 679 679 : : 679 NR_074828 : : 679 JQ249910 : : * 700 * 720 * 740 * 760 * 678 KJ579953 : GAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT : 776 JN003625 : : 776 : : 776 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : : : : : : : : : : : NR_074828 : : 780 * 800 * 820 * 840 * 860 * 776 776 776 776 776 775 776 KJ579953 : AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGG : 873 JN003625 : : 873 AF125317 HQ288928 JF708186 : : : : : : 873 873 873 GQ180117 : : 873 EF432565 : : 873 GU566322 JQ249910 : : : : NR_074828 : : 873 872 873 76 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Huyền Trang 880 * 900 * 920 * 940 * 960 * KJ579953 : GGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTA : 970 JN003625 : : 970 : : 970 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 : : : : : : : : 970 970 970 970 : : 970 NR_074828 : : 970 JQ249910 : : 980 * 1000 * 1020 * 1040 * 969 1060 KJ579953 : CCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGA : 1067 JN003625 : A T : 1067 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : A T : 1067 : A T : 1067 : A T : 1067 : A T : 1067 : A T : 1067 : A T : 1067 : A T : 1066 NR_074828 : A T : 1067 * 1080 * 1100 * 1120 * 1140 * 1160 KJ579953 : GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAG : 1164 JN003625 : : 1164 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 : : 1164 : : 1164 : : 1164 : : 1164 GU566322 : : 1164 JQ249910 : : 1163 EF432565 : : 1164 NR_074828 : : 1164 * 1180 * 1200 * 1220 * 1240 * 1260 KJ579953 : GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGG : 1261 JN003625 : : 1261 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : 1261 : : 1261 : T : 1261 : : 1261 : : 1261 : : 1261 : : 1260 NR_074828 : : 1261 * 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * 13 KJ579953 : AGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGG : 1358 JN003625 : : 1358 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : 1358 : : 1358 : : 1358 : : 1358 : : 1358 : : 1358 : : 1357 NR_074828 : : 1358 77 Luận văn thạc sỹ 60 Nguyễn Huyền Trang * 1380 * 1400 * 1420 * 1440 * KJ579953 : TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCA : 1455 JN003625 : : 1455 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : : 1455 : : 1455 : : 1455 : : 1455 : : 1455 : : 1455 : : 1454 NR_074828 : : 1455 1460 * 1480 * 1500 * 1520 KJ579953 : CGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACC-TGCGGCTGGATCACCTCCTT : 1528 JN003625 : .- : 1528 AF125317 HQ288928 JF708186 GQ180117 GU566322 EF432565 JQ249910 : .- : 1528 : .G : 1529 : .- : 1528 : .- : 1528 : .- : 1528 : .- : 1528 : .- : 1527 NR_074828 : .- : 1528 78 ... phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản Đề tài nghiên cứu: ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi? ?? thực nhằm mục đích phân lập chủng Pseudomonas sp. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH... quan Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh tôm nuôi 15 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Vibrio sp gây tôm 15 1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh: