Nghiên cứu này bước đầu đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm synbiotic gồm vi khuẩn sinh axit lactic Lactococcus lactis và fructooligosaccharide lên các chỉ tiêu miễn dịch của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Tôm thí nghiệm (khối lượng ban đầu 5 ± 0,6 g/con) được cho ăn thức ăn công nghiệp không có hoặc có chế phẩm synbiotic với hàm lượng phối trộn vi khuẩn L. lactis 108 CFU/mL và lần lượt 4 hàm lượng của fructooligosaccharide là 0,1; 0,2; 0,5 và 1%. Mời các bạn tham khảo!
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 5(1)-2021:2310-2319 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM SYNBIOTIC CHỨA VI KHUẨN SINH AXIT LACTIC Lactococcus lactis VÀ FRUCTOOLIGOSACCHARIDE LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH CỦA TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Nguyễn Thị Huế Linh*, Nguyễn Thị Xuân Hồng, Trần Thị Thúy Hằng, Nguyễn Ngọc Phước, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế * Nhận bài: 23/11/2020 Tác giả liên hệ: nguyenthihuelinh@huaf.edu.vn Hoàn thành phản biện: 02/03/2021 Chấp nhận bài: 24/03/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu bước đầu đánh giá ảnh hưởng chế phẩm synbiotic gồm vi khuẩn sinh axit lactic Lactococcus lactis fructooligosaccharide lên tiêu miễn dịch tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tơm thí nghiệm (khối lượng ban đầu ± 0,6 g/con) cho ăn thức ăn cơng nghiệp khơng có có chế phẩm synbiotic với hàm lượng phối trộn vi khuẩn L lactis 108 CFU/mL hàm lượng fructooligosaccharide 0,1; 0,2; 0,5 1% Sau 30 ngày cho tôm ăn thức ăn thử nghiệm, tiến hành thu mẫu máu tơm để phân tích tiêu miễn dịch Kết cho thấy tổng số tế bào máu, hoạt tính enzyme phenoloxidase hoạt động thực bào tôm cho ăn theo chế độ ăn có bổ sung chế phẩm synbiotic cao (p0,05) Những kết đạt nghiên cứu bước đầu cho thấy chế phẩm synbiotic thử nghiệm làm tăng hoạt động miễn dịch tơm thẻ chân trắng Từ khố: Chỉ tiêu miễn dịch, Fructooligosaccharide, Lactococcus lactis, Synbiotic, Tôm thẻ chân trắng PRELIMINARY STUDY ON EFFECT OF A MIXTURE OF LACTIC ACID BACTERIA Lactococcus lactis AND FRUCTOOLIGOSACCHARIDE ON IMMUNE RESPONSE PARAMETERS OF WHITE LEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei) Nguyen Thi Hue Linh*, Nguyen Thi Xuan Hong, Tran Thi Thuy Hang, Nguyen Ngoc Phuoc University of Agriculture and Forestry, Hue University ABSTRACT This study initially evaluated the effect of a synbiotic containing a mixture of lactic acid-producing bacteria L lactis and fructooligosaccharide on immune response factors of white leg shrimp (L vannamei) The experimental shrimp (5 ± 0,6 g/con) were fed commercial feed without or containing the synbiotic with L lactis (108 CFU/mL) and/or concentrations of fructooligosaccharide 0,1; 0,2; 0,5 and 1%, respectively After 30 days of feeding trial, shrimp hemolymph was collected to analyze the related parameters to shrimp immune response The results showed that the immunological parameters such as total hemocytes count, phenoloxidase enzyme activity, and phagocytic activity of shrimp in the treated groups were significantly higher (p 0,05) The results of this study provided scientific data on the effectiveness of synbiotic in stimulating immune response parameters of cultured white leg shrimp Keywords: Fructooligosaccharide, Immune Response Parameters, Lactococcus lactis, Synbiotic, White leg shrimp 2310 Nguyễn Thị Huế Linh cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP MỞ ĐẦU Trong 20 năm trở lại đây, việc ứng dụng vi khuẩn sinh axit lactic sản phẩm trao đổi chất chúng làm chế phẩm sinh học tiềm sử dụng ngành công nghiêp nuôi tôm (Chiu cs., 2007; Castex cs., 2008; Vieira cs., 2008) nhà nghiên cứu quan tâm Vi khuẩn sinh axit lactic có khả sản xuất chất kháng khuẩn ức chế phát triển vi khuẩn cạnh tranh thành phần kháng khuẩn axit lactic, axit axetic, hydro peroxide (Ouwehand Vesterlund, 2004) Chế phẩm sinh học bao gồm Lactobacillus sp., Bacillus sp., nấm men nhiều vi khuẩn gram âm báo cáo có khả ức chế hiệu vi khuẩn Vibrio ngành công nghiệp nuôi tôm (Chiu cs., 2007; Vaseeharan Ramasamy, 2003; Suphantharika cs., 2003; Scholz cs., 1999; Ruiz-Ponte cs., 1999) Bright cs (2004) thông báo sau tôm he cho ăn L acidophilus, Streptococcus cremoris, L bulgaricus 56 L bulgaricus 57 cảm nhiễm với V alginolyticus tỷ lệ sống sót tơm thí nghiệm 60% - 80%, so với tỷ lệ sống 20% nhóm đối chứng khơng sử dụng chế phẩm Tương tự, kết nghiên cứu Vieira cs (2007) chứng minh ấu trùng tôm thẻ chân trắng sau cho ăn vi khuẩn sinh axit lactic cải thiện tỷ lệ sống lên 44% - 50% so với tôm lô đối chứng (21%) thí nghiệm cảm nhiễm với V harveyi (Vieira cs., 2008) Trong nghiên cứu khác, tiến hành điều trị cho tôm Litopenaeus stylirostris bị nhiễm V nigripulchritudo chế phẩm sinh học Pediococcus acidilactici làm tăng tỷ lệ sống lên 7% 15% tôm nuôi ao thử nghiệm, tương quan với việc giảm tỷ lệ nhiễm vi khuẩn V nigripulchritudo tuần (Castex cs., 2008) Lactococcus lactis vi khuẩn sinh axit lactic sử http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 5(1)-2021:2310-2319 dụng làm chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản (Haziyamin cs., 2012) Đối với cá biển, có báo cáo tác dụng có lợi L lactis WFLU12 giúp cá bơn chống lại liên cầu khuẩn S parauberis thông qua việc cạnh tranh loại bỏ tăng đáp ứng miễn dịch, chủng vi khuẩn có triển vọng hứa hẹn thúc đẩy tăng trưởng cho cá chuyển hóa thức ăn tốt (Nguyen cs., 2017) Linh cs (2018) có báo cáo ảnh hưởng tích cực L.lactis K-C2 lên tốc độ tăng trưởng, hàm lượng amino acid hệ vi sinh vật ruột cá cam (Seriola dumerili) Trong đó, L lactis subsp lactis chứng minh tác động tích cực lên tăng trưởng, hệ vi sinh vật đường ruột, hoạt động enzyme tiêu hóa khả kháng bệnh tôm thẻ chân trắng) nghiên cứu Adel cs (2017) Gần đây, số nghiên cứu cho sử dụng synbiotic sản phẩm kết hợp hỗn hợp men vi sinh (probiotic, gồm vi khuẩn có lợi) prebiotic (một dạng thực phẩm tự thân khơng tiêu hóa có ảnh hưởng tốt cho thể sống cách kích thích tăng trưởng vi khuẩn có lợi) kích thích phát triển, hoạt hoát khả trao đổi chất cải thiện khả sống sót lợi khuẩn trình di chuyển qua đường ruột, góp phần trì cân hệ vi sinh vật đường ruột nâng cao sức khoẻ cho vật chủ (DeVrese Schrezenmeir, 2008; Pandey cs., 2015; Ringø Song, 2016) Prebiotic carbonhydrate có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật, prebiotic khơng bị ảnh hưởng axít tiêu hố dày, muối mật enzyme thuỷ phân dịch ruột, không bị hấp thu đường tiêu hoá dễ dàng lên men nhờ hệ vi sinh vật có lợi đường ruột (Kuo, 2013) Fructooligosaccharide (FOS) prebiotic thực vật cho thấy có nhiều tiềm ứng dụng loài thủy hải sản nuôi (Zhou cs., 2010; Dong Wang, 2013) Việc bổ sung 2311 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY fructooligosaccharide vào chế độ ăn chứng minh làm tăng tốc độ tăng trưởng động vật thủy sản rùa mai mềm (Trionyx sinensis) (Ji cs., 2004) ấu trùng bọ (Psetta maxima) (Mahious cs., 2006) Tuy nhiên, thông tin phương thức hoạt động synbiotic đến hệ thống miễn dịch L vannamei chưa nghiên cứu nhiều Mục tiêu nghiên cứu bước đầu đánh giá ảnh hưởng chế phẩm synbiotic tỷ lệ phối trộn thích hợp vi khuẩn sinh axit lactic L lactis fructooligosaccharide chế phẩm lên hoạt động tiêu miễn dịch tôm thẻ chân trắng, cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng chế phẩm synbiotic phòng trị bệnh cho tôm nuôi PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguồn vi khuẩn lactic Vi khuẩn có lợi L lactis phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng tự nhiên, lưu trữ cung cấp từ phịng thí nghiệm Khoa Thuỷ sản, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Chủng vi khuẩn L lactis nuôi cấy môi trường thạch MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) nhiệt độ 28oC 24 Sau đó, lấy khuẩn lạc rời đĩa thạch nuôi cấy tăng sinh 50 mL môi trường MRS lỏng máy ủ lắc (Shaking incubator) (LM-4200, Yinder, Trung Quốc) nhiệt độ 28oC, tốc độ 100 vòng/phút 24 - 48 Dung dịch vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3.000 vòng 20 phút máy ly tâm (Digisystem Laboratory Instruments Inc., Đài Loan), loại bỏ phần dịch thu phần vi khuẩn Cho 50 mL dung dịch nước muối sinh lý 0.85% NaCl vào để tạo huyền phù Lấy mL huyền phù vi khuẩn đo OD máy so màu quang phổ (Spectrophotometer model 4111 RS, Zuzi, Tây Ban Nha) bước sóng 620 nm, dùng nước muối sinh lý pha loãng đến giá trị OD huyền phù OD600 = 2312 ISSN 2588-1256 Vol 5(1)-2021:2310-2319 (tương đương 108 CFU/mL, số liệu không công bố) 2.1.2 Phương pháp điều chế chế phẩm synbiotic Vi khuẩn L lactis (108 CFU/mL) phối trộn với fructooligosaccharide hàm lượng 0,1; 0,2; 0,5 1% Cụ thể, 100 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn L lactis với nồng độ 108 CFU/mL ly tâm với tốc độ 3.000 vòng 20 phút để loại bỏ phần dịch nổi, vi khuẩn lắng lại trộn với 10 ml nước cất hoà tan fructooligosaccharide với liều lượng 0,1; 0,2; 0,5 g Cuối cùng, 10 mL nồng độ phối trộn chế phẩm trộn với 100 g thức ăn công nghiệp (Goal Plus 8604, Công ty Cổ phần Chăn nuôi CP Việt Nam, tổng hàm lượng protein 46%, kích cỡ < 1,2 mm), để khơ nhiệt độ phịng Hỗn hợp tạo thành lưu giữ nhiệt độ 4oC sử dụng thí nghiệm Fructooligosaccharide sử dụng sản phẩm thương mại cung cấp công ty Wako Pure Chemical Industries, Ltd (Nhật Bản) 2.2 Tơm thí nghiệm Tơm thẻ chân trắng (L vannamei) với số lượng 250 con, có khối lượng thể trung bình ± 0,6 g/con, tơm qua kiểm dịch không mang mầm bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh đầu vàng (YHD), bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mô (IHHNV) bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính (AHPND) trạm xá Thú y (Chi cục Chăn nuôi, Thú y Thừa Thiên Huế), cung cấp từ trang trại nuôi tôm xã Phú Thuận, Thừa Thiên Huế Tôm ni bể composite (kích thước x x 1m) 14 ngày trước tiến hành thí nghiệm Nhiệt độ nước, độ mặn oxy hòa tan q trình ni q trình thí nghiệm trì khoảng tương ứng 22 - 23oC, 30‰ - mg/L Tôm cho ăn ngày lần với phần ăn 3% trọng lượng thể Nguyễn Thị Huế Linh cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP 2.3 Bố trí thí nghiệm Tơm thí nghiệm bố trí nghiệm thức, nghiệm thức đối chứng gồm tôm thẻ chân trắng cho ăn thức ăn công nghiệp không chứa chế phẩm synbiotic Bốn nghiệm thức thí nghiệm (nghiệm thức 1, 2, 3, 4) gồm tôm thẻ chân trắng cho ăn thức ăn có phối trộn chế phẩm synbiotic chứa vi khuẩn L lactis fructooligosaccharide với tỷ lệ phối trộn 0,1; 0,2; 0,5 1% Mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần Tôm thí nghiệm bố trí bể nhựa (kích thước 30 x 60 x 40cm) chứa 15 tôm/bể Tôm cho ăn lần/ngày với khối lượng thức ăn 3% khối lượng thể tơm Thí nghiệm cho ăn tiến hành 30 ngày 2.4 Phương pháp xác định tiêu miễn dịch Các tiêu miễn dịch (tổng số tế bào máu, hoạt tính enzyme lysozyme, hoạt tính enzyme phenoloxidase, hoạt động thực bào) tơm thí nghiệm xác định vào trước ngày cho ăn (đầu thí nghiệm) sau 30 ngày cho ăn thức ăn có khơng có chế phẩm synbiotic Tiến hành lấy máu tôm (3 tôm) nghiệm thức lần thu mẫu Dùng xilanh -1 ml chứa sẵn 400 µL dung dịch chống đơng máu (29,22 mg NaCl; 3,8 mg ethylene glycol tetra-acetic acid; 2,38 mg Hepes (C8H18N2O4S); mg L-cystein, L nước cất, pH 7,6) (Itami cs., 1998) lấy 300 µL máu từ gốc chân bị thứ tơm, sau cho vào ống eppendorf chứa sẵn 800 µL dung dịch chống đông máu trộn đều, tổng tỷ lệ pha lỗng dung dịch máu tơm dung dịch chống đông máu 1:4 Máu tôm chia thành nhiều phần sử dụng để phân tích tiêu miễn dịch khác sau: 2.4.1 Tổng số tế bào máu Nhỏ 10 µL máu tơm cho vào buồng đếm hồng cầu Neubauer-improved, đếm số lượng tế bào máu kính hiển vi quang học (Leica DMIL, Leica Microsystems, Wetzlar, Đức) với độ phóng http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 5(1)-2021:2310-2319 đại 400x để xác định tổng số tế bào máu tôm theo công thức: Tổng số tế bào máu (𝑡ế 𝑏à𝑜 / 𝑚𝐿) Tổng số tế bào máu đếm × 10 000 = Số vng đếm × hệ số pha lỗng 2.4.2 Hoạt tính enzyme lysozyme Hoạt tính enzyme lysozyme xác định theo phương pháp Ellis (1990): lấy 700 μL dung dịch máu tơm ly tâm tốc độ 6.500 vịng/phút phút Loại bỏ phần dịch nổi, phần lắng trộn với mL (0,02%) dung dịch Micrococcus lysodeikticus (Sigma, St Louis, MO, USA) nhiệt độ phòng Đo mật độ quang học dung dịch bước sóng 530 nm sau 0,5 4,5 phút máy quang phổ (Spectrophotometer model 4111 RS, Zuzi, Tây Ban Nha) Một đơn vị hoạt động enzyme lysozyme tạo tương đương với giảm độ hấp thụ 0,01 phút −1, biểu thị U (g/mL)−1 2.4.3 Hoạt tính enzyme phenoloxidase Hoạt tính enzyme phenoloxidase phân tích cách xác định hình thành dopachrome từ L-DOPA (L-3, -4dihydroxyphenylalanine, Sigma) (Pan cs., 2008; Sung cs., 1994) Lấy 700 μL dung dịch máu tôm ly tâm tốc độ 6.500 vòng/phút phút nhiệt độ 4oC), loại bỏ phần dịch nổi, phần lắng rửa trộn nhẹ nhàng 700 μL dung dịch đệm cacodylate 0,1 M (natri cacodylate 10 mM, natri clorua 450 mM trisodium citrat 100 mM; pH 7,0), sau tiếp tục ly tâm (10.000 vịng/phút, 10 phút, 4oC) Lấy 100 μL phần dịch trộn với 100 μL trypsin 0,1% (hòa tan dung dịch đệm cacodylate 0,1 M) ủ 10 phút 25oC Sau đó, cho 100 μl LDOPA (3 mg/mL cacodylate 0,1 M) vào ủ 20 phút 25oC, bổ sung vào hỗn hợp 300 μL dung dịch đệm cacodylate 0,1 M Hoạt động phenoloxidase xác định máy đo máy quang phổ (Spectrophotometer model 4111 RS, Zuzi, Tây Ban Nha) bước sóng 490 nm 2313 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY 2.4.4 Hoạt động thực bào Hoạt động thực bào tế bào máu tôm xác định theo phương pháp Liu Chen (2004) Đầu tiên, lấy 20 μL vi khuẩn V parahaemolyticus (2 × 107CFU/mL) tiêm vào xoang bụng tơm nghiệm thức thí nghiệm Sau tiêm giờ, tiến hành lấy máu tôm trình bày Lấy 100 μL mẫu máu trộn với 100 μL paraformaldehyde 0,1% để cố định tế bào máu 30 phút 4°C Tiếp theo, lấy 50 μL dung dịch tế bào máu cố định nhỏ lên phiến kính ly tâm với tốc độ 1000 rpm phút máy Cytospin TD-4K (Hunan Xingke Scientific Instruments Co., Ltd, Trung quốc) Sau đó, ISSN 2588-1256 Vol 5(1)-2021:2310-2319 lam kính để khơ nhiệt độ phịng nhuộm thuốc nhuộm WrightGiemsa Hoạt động thực bào tế bào máu tơm quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 400x Hoạt động thực bào (PA) xác định sau: PA (%) = [(Tế bào máu tơm có hoạt động thực bào) / (Tổng số tế bào máu)] × 100 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng chế phẩm synbiotic lên tổng số tế bào máu Tổng số tế bào máu tơm nghiệm thức thí nghiệm tăng lên sau 30 ngày cho ăn không cho ăn chế phẩm synbiotic thể Bảng Bảng Tổng số tế bào máu tơm nghiệm thức thí nghiệm sau 30 ngày cho ăn không cho ăn chế phẩm synbiotic Tổng số tế bào máu (10⁷tế bào/mL) Nghiệm thức Đầu thí nghiệm Ngày thí nghiệm thứ 30 Nghiệm thức 1,3 ± 0,2a 2,6 ± 0,2b a Nghiệm thức 1,2 ± 0,3 2,9 ± 0,4b a Nghiệm thức 1,1 ± 0,3 3,5 ± 0,3c a Nghiệm thức 1,3 ± 0,4 3,5 ± 0,4c Đối chứng 1,2 ± 0,3a 2,0 ± 0,5a Số liệu đại diện cho giá trị trung bình ± SD Các số liệu cột với chữ khác biểu khác có ý nghĩa thống kê (p