BÁO CÁO " ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ (Astragalus radix) LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) " doc

Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 278 ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ (Astragalus radix) LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Đặng Thị Hoàng Oanh 1 và Trần Thị Yến Nhi 1 ABSTRACT Striped catfish (20-30 g/individual) were fed by pellet supplemented with 0,5% extract from Astragalus radix for 5 weeks. Samples were colleted every week to measure growth and subjeted to haematological analysis. After 5 weeks feeding with herb extract, challenge experiment with Edwardiella ictaluri was carried out by using immersion method. Results from haematological analysis revealed a significant increase in total number red blood cells, lymphocyte, monocyte, neutrophils and thrombocyte in fish that were fed 5 weeks with extract. Where as, the total of white blood cells increased after three weeks. After challenge with bacteria, number of red and white blood cells, lymphocyte and thrombocyte decreased but monocyte and neutrophils increased. The ability to kill bacteria in serum of diseased fish was higher than in healthy fish. Percentage of bacteria survived after react with serum from fish fed with herb extract was lower than that of fish fed without herb extract. Keywords: striped catfish, Edwardsiella ictaluri, Astragalus radix extract. Title: Effects of extracted product from Astragalus radix on non-specific immune parameters of the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) TÓM TẮT Cá tra (20-30 g/con) được cho ăn thức ăn bổ sung chiết xuất hoàng kỳ với tỉ lệ 0,5% trong 5 tuần. Mỗi tuần thu mẫu 1 lần theo dõi tăng trưởng và phân tích các chỉ tiêu huyết học. Sau 5 tuần, cá được gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp ngâm với mật độ 0,42x10 4 CFU/ml. Kết quả cho thấy số lượng hồng cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu của cá ăn hoàng kỳ đều tăng có ý nghĩa thống kê so với cá không ăn hoàng kỳ sau 5 tuần. Tuy nhiên, số lượng tổng bạch cầu tăng có ý nghĩa sau 3 tuần. Sau khi gây cảm nhiễm, số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu ở các nghiệm thức đều giảm trong khi bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng. Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá bệnh cao hơn cá khỏe, 1 Khoa Thuỷ sản, Đại học Cần Thơ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 279 phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá ăn hoàng kỳ thấp hơn so với cá không ăn hoàng kỳ. Từ khóa: Cá tra, Edwardsiella ictaluri, chiết xuất hoàng kỳ 1 GIỚI THIỆU Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đang là đối tượng nuôi hấp dẫn đối với nhiều người dân vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Theo Cục Nuôi trồng Thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sản lượng cá tra tại ĐBSCL năm 2009 đạt hơn 1 triệu tấn, với kim ngạch xuất khẩu dự báo đạt trên 1 tỷ USD. Hiện tại, nhu cầu cá tra cho xuất khẩu và tiêu thụ trong nước đều tăng cao. Giải pháp quan trọng để tạo thêm nhiều sản phẩm là nuôi công nghiệp tập trung. Tuy nhiên, hạn chế chính của môi trường nuôi công nghiệp mật độ cao là dịch bệnh dễ có điều kiện bùng phát và lây lan. Trong số các bệnh thường gặp trên cá tra thì bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân nguy hiểm, gây thiệt hại nghiêm trọng lên đàn cá ở nhiều địa phương vào giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ chết cao (10-90%) (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Để hạn chế dịch bệnh người nuôi đã sử dụng rất nhiều loại kháng sinh. Việc dùng kháng sinh trị bệnh thường tốn kém và hiệu quả không cao. Hơn nữa, lượng tồn dư kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Việc lạm dụng kháng sinh và thuốc thú y thủy sản đang làm cho sản phẩm cá tra và basa của Việt Nam gặp nhiều bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường khó tính (Bùi Quang Tề, 2006). Trong các nỗ lực làm hạn chế dịch bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá tra, biện pháp tăng cường sức đề kháng cho cá nuôi đang đượ c nhiều người quan tâm. Phòng bệnh cho cá tra bằng cách bổ sung các chất kích thích làm tăng sức đề kháng vào thức ăn, sử dụng vắc-xin, thảo dược, các chất chiết xuất thảo dược để tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch là một hướng đi tích cực nhằm đảm bảo sự phát triển bền v󱠐󳬁󻜁󺜁󽬅󲰁󻜍ề nuôi cá tra vùng ĐBSCL. Hiện nay, một số nghiên cứ u về việc bổ sung vitamin C vào thức ăn cho cá, phòng bệnh cá tra bằng vắc-xin… đã được nghiên cứu và từng bước đưa vào thực tế sản xuất. Nhưng đối với việc sử dụng thảo dược, các chất chiết xuất thảo dược phòng bệnh mủ gan cho cá tra Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu về “Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá tra” nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây hoàng kỳ để làm tăng sự đề kháng của cá tra nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 280 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thí nghiệm cho cá ăn thức ăn bổ sung hoàng kỳ 2.1.1 Cá thí nghiệm Cá tra giống có trọng lượng từ 20-30 g/con, khỏe mạnh, phản ứng linh hoạt. Cá mua về dự trữ trong bể composite có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá. Cá được thuần hóa trong khoảng 3-5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. 2.1.2 Hoàng kỳ Chiết xuất hoàng kỳ (40% polysaccharide) do hãng Xuancheng Baicao, Trung Quốc sản xuất. 2.1.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm thực hiện trên bể nhựa (250 L/bể), nước cung cấp cho bể thí nghiệm là nước máy, có sục khí. Bể, lưới che, vợt đều được xử lí bằng Chlorine 10% và làm sạch bằng nước trước khi sử dụng. Mật độ cá bố trí là 35 con/bể. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho 2 nghiệm thức: (1) Nghiệm thức 1 (NT1) không cho ăn hoàng kỳ (đối chứng) và (2) Nghiệm thức 2 (NT2) cho ăn hoàng kỳ. Hoàng kỳ được trộn vào thức ăn cho cá với tỉ lệ 0,5% sau đó áo bằng dầu mực. Cá được cho ăn 2-3 lần/ngày theo nhu cầu. Thời gian thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung hoàng kỳ trong 5 tuần. Mẫu máu (3 con/nghiệm thức) được thu để theo dõi tăng trưởng và phân tích chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu) (1 lần/tuần). 2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm cá tra với vi khuẩn E. ictaluri 2.2.1 Vi khuẩn cảm nhiễm Phục hồi vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E. ictaluri CAF258 từ bộ sưu tập vi khuẩn (Bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ) được phục hồi trên môi trường TSA và giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 28ºC. Kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng kích thước vi khuẩn, nhuộm gram, các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản (oxidase, catalase, tính di động, phản ứng decarboxylase, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose). Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Chọn khuẩn lạc đồng nhất trong mẻ cất thuần để nuôi tăng sinh trong môi trường BHI ở 28ºC trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn được chuyển qua ống Falcon đã tiệt trùng, li tâm ở 8.000 vòng/phút trong 5 phút với nhiệt độ 4ºC. Loại bỏ dung dịch phía trên, rửa phần còn lại (vi khuẩn) qua nước muối sinh lý 2-3 lần, hòa tan nước muối và vi khuẩn. Pha loãng mật độ vi khuẩn đến mật độ khoảng 10 4 CFU/ml. Mật số vi khuẩn được kiểm tra lại trên môi trường TSA, kết quả mật độ vi khuẩn đã sử dụng là 0,42.10 4 CFU/ml. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 281 2.2.2 Gây cảm nhiễm Sau 5 tuần thực hiện thí nghiệm cho cá ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, thí nghiệm cảm nhiễm cá với vi khuẩn E. ictaluri được thực hiện bằng phương pháp ngâm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần gồm có: NT1: không gây cảm nhiễm; NT2: không gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn bổ sung hoàng kỳ; NT3: gây cảm nhiễm, cá sử dụ ng thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và NT4: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn bổ sung hoàng kỳ 0,5%. Cá được theo dõi dấu hiệu bệnh lý sau khi gây cảm nhiễm. Sau 1 tuần cảm nhiễm, tiến hành thu mẫu máu phân tích các chi tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu), xác định khả năng diệt khuẩn huyết thanh (3 cá/bể) và tái định danh vi khuẩn E. ictaluri từ cá lờ đờ bằng cách trữ mô thận trong Ethanol (100%) để phân tích PCR. 2.3 Phương pháp phân tích mẫu máu cá Cá từ các bể thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm được thu ngẫu nhiên 3 con/bể. Máu được lấy ở động mạch chủ ở đuôi (Houston, 1990) và mỗi con cá chỉ lấy máu một lần để tránh ảnh hưởng kết quả xét nghiệm. 2.3.1 Định lượng hồng cầu (Natt & Herrick, 1952) 10 µl máu được cho vào ống nghiệm nhựa có chứa 1.990 µl dung dịch Natt & Herrick. Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm. M ật độ hồng cầu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học (40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Mật độ hồng cầu được tính theo công thức: C x 10 x 5 x 200 (tb/mm 3 ) với C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm. 2.3.2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu Mẫu máu đã được cố định trên lame được nhuộm bằng dung dịch nhuộm Wright & Giemsa (Chinabut et al., 1991). Theo thứ tự như sau: (1) nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút; (2) ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút; (3) nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút; (4) ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút; và (5) rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫ u. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100. Định loại các tế bào máu theo Chinabut et al., (1991). 2.3.3 Tổng bạch cầu (TBC) (Hrubec & ctv, 2000) Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. Tổng bạch cầu được xác định bằng công thức: TBC (tb/mm 3 ) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 282 2.3.4 Từng loại bạch cầu (Hrubec & ctv, 2000) Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm 3 ) = (số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/200. 2.3.5 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Lượng máu trữ trong tuýp nhựa 1,5 ml sau khi đem về phòng thí nghiệm được ly tâm với tốc độ 1.300 vòng trong 4 phút. Rút lấy phần huyết thanh (dịch trong) bên trên cho vào 1 tuýp nhựa khác (đã thanh trùng) và trữ ở -80°C cho đến khi phân tích. Pha loãng huyết thanh 10 lần trong nước muối sinh lý khi sử dụng. Cho 100 µl dung dịch huyết thanh vào các giếng trừ giếng đối chứng thì cho môi trường nutrient broth (NB) vào. Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 48h trong môi trường NB ở 28°C và pha loãng đến mật độ 10 4 CFU/ml. 30 µl vi khuẩn được cho vào các giếng trừ giếng đối chứng. Ủ qua đêm ở 28°C. Sau đó cho 10 µl MTT (5 mg/ml nước cất) vào các giếng, lắc trong 15 giây thì đọc ở bước sóng 600 nm bằng máy microplate reader. Phần trăm vi khuẩn sống sót được tính bằng công thức: PSA = ((OD sample – OD blank )/(OD control – OD blank )) x 100 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. 3 KẾT QUẢ 3.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra 3.1.1 Hồng cầu Hình 1. Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của cá trong 5 tuần cho ăn thức ăn có bổ sung chiếc xuất từ hoàng kỳ. ĐC: cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ; HK: cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ; (*): Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 283 Kết quả định lượng cho thấy sau 5 tuần cho cá ăn thức ăn bổ sung hoàng kỳ, số lượng hồng cầu trung bình ở cá có sử dụng hoàng kỳ là 2,01x10 6 tế bào/ml, cao hơn có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) so với cá không sử dụng hoàng kỳ (1,73x10 6 tế bào/ml) (Hình 1). Kết quả phân tích ở mỗi tuần đều cho thấy số lượng hồng cầu của cá cho ăn hoàng kỳ cao hơn cá không cho ăn hoàng kỳ. 3.1.2 Bạch cầu Tổng bạch cầu, tế bào lympho, tế bào bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu của cá đều tăng có ý nghĩa thống kê sau 5 tuần ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ so với cá ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ (Bảng 1). Bảng 1. Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của cá sau 5 tuần thí nghiệm Loại tế bào (x10 3 tế bào/ml) Cá không ăn HK Cá ăn HK Tổng bạch cầu 126,28 ± 5,0 a 158,48 ± 20,8 b Lympho 98,50 ± 5,3 a 118,98 ± 14,9 b Bạch cầu đơn nhân 6,16 ± 1,7 a 8,05 ± 2,4 b Bạch cầu trung tính 7,55 ± 1,9 a 11,13 ± 2,4 b Tiểu cầu 14,01 ± 1,8 a 17,67 ± 1,0 b Giá trị thể hiện trên bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Sau 3 tuần cho ăn hoàng kỳ, tổng bạch cầu của cá ăn hoàng kỳ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với cá không ăn hoàng kỳ. Nhìn chung, số lượng tổng bạch cầu của cá sử dụng hoàng kỳ tăng dần qua các tuần và cao hơn cá ở nghiệm thức không cho ăn. Tương tự, các loại tế bào như lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu tăng không ổn định qua 5 tuần và có sự khác biệt so với nghiệm đối chứng, nhưng chỉ có ý nghĩa thống kê sau 5 tuần (Bảng 1). Hoàng kỳ đã được chứng minh là có ảnh hưởng tích cực tới hệ thống miễn dịch ở cá chép (Yin et al., 2004). Phân tích cho thấy hoàng kỳ có chứa polysaccharides, monosaccharides, flavonoid và alkaloid, cùng với choline, betaine, axít folic, axít amin khác nhau, mucoitin, cellulose, và mười bốn chất khoáng vi lượng, bao gồm selen, kẽm, sắt, đó là vi chất dinh dưỡng cần thiết cho con người và động vật. Các nghiên cứu củ a Wang (1999) và Liu (2002) đã cho thấy một số thành phần như polysaccharides, các axít hữu cơ, glucosides… làm tăng chức năng miễn dịch. Cho đến nay cơ chế mà polysaccharide của hoàng kỳ làm tăng đáp ứng miễn dịch của cá vẫn chưa được hoàn toàn làm sáng tỏ. Nhưng có báo cáo cho rằng polysaccharide của hoàng kỳ có glucan và heteropolysaccharide có thể kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. Ở cá, glucan được báo cáo cho tồn tại trên đại thực bào làm tăng cường miễn dịch không đặc hiệu thông qua kích hoạt trực tiếp các đại thực bào (Ainsworth, 1994). Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 284 Đại thực bào là thành phần tế bào quan trọng nhất của hệ thống miễn dịch bẩm sinh ở cá. Hoạt động thực bào là hàng rào bảo vệ và là đặc tính quan trọng của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (Neumann et al., 2001). Chiết xuất thảo dược có thể tăng cường thực bào ở nhiều loài cá khác nhau (Dügenci et al., 2003). Trong thí nghiệm của Ador et al., (2007), chiết xuất hoàng kỳ đã cải thiện đáng kể hoạt động thực bào của bạch cầu ở cá rô phi, thậm chí một tuần sau khi bắt đầu cho ăn. Sự gia tăng hoạt động này được duy trì trong toàn bộ thời gian thử nghiệm. Tác giả kết luận rằng chất các chất chiết xuất từ hoàng kỳ có thể được sử dụng như nhân tố để tăng cường phản ứng miễn dịch và kháng bệnh của các loài cá nuôi. Kết quả nghiên cứu của Yin et al., (2005) cho thấy cá rô phi cho ăn thức ăn bổ sung 0,1 và 0,5% chiết xuất hoàng kỳ làm tăng hoạt động lysozyme sau 1 tuần, nâng cao hoạt động thực bào sau 3 tuần cho ăn. 3.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri 3.2.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá được gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri Cá sau khi gây cảm nhiễm có dấu hiệu lờ đờ, đôi khi có xuất huyết. Khi giải phẫu cá lờ đờ ghi nhận có đốm trắng ở thận, tỳ tạng và gan. Kết quả định danh bằng phương pháp PCR cho thấy cá nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 3.2.2 Hồng cầu Hình 2. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi số lượng hồng cầu cá sau cảm nhiễm. 1: cá cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ; 2: cá cảm nhiễm ăn hoàng kỳ; 3: cá không cảm nhiễm, không ăn hoàng kỳ; 4: cá không cảm nhiễm, ăn hoàng kỳ Kết quả phân tích cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) rõ rệt về số lượng hồng cầu của cá ở nghiệm thức cảm nhiễm E. ictaluri và không ăn hoàng kỳ với cá ở nghiệm thức không gây cảm nhiễm E. ictaluri và không cho ăn hoàng kỳ hoặc có cho ăn hoàng kỳ. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 285 nghĩa giữa các nghiệm thức còn lại (Hình 2). Cá được gây cảm nhiễm có cho ăn hoàng kỳ có số lượng hồng cầu giảm còn 87,6% so với cá không được gây cảm nhiễm và không cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ trong khi cá được gây cảm nhiễm không cho ăn hoàng kỳ thì số lượng hồng cầu giảm (chỉ còn 77,2%). Giữa 2 nghiệm thức gây cảm nhiễm thì số lượng hồng cầu của cá ở nghiệm thứ c cá có sử dụng hoàng kỳ là 1,65x10 6 tế bào/ml, cao hơn cá ở nghiệm không sử dụng hoàng kỳ là 1,45x10 6 tế bào/ml. Kết quả cũng tương tự ở 2 nghiệm thức cá không gây cảm nhiễm, cá không được gây cảm nhiễm có cho ăn hoàng kỳ có số lượng hồng cầu là 2,01x10 6 tế bào/ml trong khi cá không cho ăn hoàng kỳ là 1,88x10 6 tế bào/ml. Nguyễn Thị Thúy Liễu (2010) cũng báo cáo có sự giảm đáng kể số lượng hồng cầu dưới tác dụng của vi khuẩn gây bệnh. 3.2.3 Bạch cầu Hình dạng các loại bạch cầu không có sự khác biệt giữa được gây cảm nhiễm và cá không được gây cảm nhiễm. Sự thay đổi số lượng bạch cầu được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2. Bảng kết quả số lượng các loại tế bào bạch cầu sau cảm nhiễm Loại tế bào (x10 3 tế bào/ml) NT 1 NT 2 NT 3 NT 4 Tổng bạch cầu 55,15 ± 12,0 a 100,70 ± 41,3 ab 126,60 ± 14,7 b 144,68 ± 22,2 b Lympho 38,60 ± 9,1 a 73,88 ± 30,1 ab 97,72±7,0 b 113,52 ±12,6 b Bạch cầu đơn nhân 6,93 ± 1,8 a 8,46 ± 4,4 a 5,41 ± 3,0 a 6,34 ± 1,7 a Bạch cầu trung tính 8,16 ± 1,6 a 8,59 ± 5,6 a 7,68 ± 2,0 a 7,85 ± 2,6 a Tiểu cầu 1,46 ± 0,6 a 9,76 ± 3,5 ab 15,79 ± 6,4 ab 16,98 ± 5,7 b Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT 1: cá cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ; NT 2: cá cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ; NT 3: cá không cảm nhiễm, không ăn hoàng kỳ; NT 4: cá không cảm nhiễm, ăn hoàng kỳ Tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm đều giảm so với các nghiệm thức không gây cảm nhiễm trong khi số lượng tế bào đơn nhân, bạch cầu trung tính lại tăng. Sự khác biệt về tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu chỉ có ý nghĩa ở nghiệm cá được gây cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ so với các nghiệm cá không được gây cảm nhiễm. Nhìn chung số lượng các loại bạch cầu ở nghiệm thức gây cảm nhiễm có sử dụng hoàng kỳ đều cao hơn nghiệm thức cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ, nhưng vẫn thấp hơn các nghiệm thức cá không được gây cảm nhiễm. Riêng bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 286 Kết quả này tương tự kết quả của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2010) là số lượng tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu của cá bệnh thu ngoài tự nhiên giảm có ý nghĩa thống kê so với cá khỏe (p<0,05), trong khi số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân trên cá bệnh tăng cao nhưng chỉ có sự tăng của bạch cầu trung tính là có ý nghĩa thống kê. Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002), vùng gan, thận, tỳ tạng cá nhiễm E. ictaluri đến giai đoạn hoại tử thận bị mất chức năng quan trọng như bài tiết các chất thải của quá trình trao đổi chất gây ra sự tích tụ các sản phẩm thải của quá trình biến dưỡng gây độc cho cơ thể. Đồng thời, mô tạo máu cho cơ thể bị phá hoại làm cho lượng máu trong cơ thể giảm do không có máu thay thế. Sự hoại tử ở tỳ tạng cũng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu để bảo vệ cơ thể chống lại vi khuẩn và những tác nhân gây bệnh khác. Đây chính là nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu và tổng bạch cầu đều giảm. Số lượng tiểu cầu cũng giảm nhanh khi có sự xuất hiện của vi khuẩn trong các tổ chức. Trong máu và dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải một hàng rào rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ không đặc hiệu đó là các tế bào thực bào gồm có bạch cầu trung tính và các đại thực bào (Vũ Triệu An, 2001), do đó khi bị vi khuẩn tấn công, hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá hoạt động làm cho số lượng các tế bào này tăng. Ainsworth và Dexiang (1990) đã chỉ ra rằng các bạch cầu trung tính cũng quan trọng trong việc chống vi khuẩn gây bệnh trong đó có E. ictaluri. Bạch cầu trung tính thực bào vi khuẩn Aeromonas hydrophila hay Micrococcus luteus dễ dàng hơn so với E. ictaluri. 3.3 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Sáu mẫu huyết thanh của từng nghiệm thức được chọn ngẫu nhiên để tiến hành đo khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. Kết quả tính phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh được thể hiện ở bảng 3 cho thấy có 48,81% vi khuẩn còn sống sau khi tương tác với huyết thanh cá được gây cảm nhiễm không có ăn hoàng kỳ; 31,25% vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ; 73,26% vi khuẩn còn sống sau khi tương tác với huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ và 66,68% vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ. Theo Lawrence et al,. (2003), khả năng kháng huyết thanh của vi khuẩn khác nhau tuỳ theo cấu tạo lớp vỏ ngoài của vi khuẩn, kết quả nghiên cứu cho th ấy có 64% vi khuẩn E. ictaluri chủng 93-126 còn sống sau khi tương tác với 21 mẫu huyết thanh của cá da trơn nuôi ao và 68,6% đối với E. ictaluri chủng 93- 149R6. Theo Nguyễn Thị Thúy Liễu (2010), khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá tra bị nhiễm E. ictaluri cao hơn cá không nhiễm, đồng thời cũng xảy ra trường hợp vi khuẩn phát triển hơn 100% sau khi tiếp xúc với huyết thanh của cá. Như vậy, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá được gây cảm Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 278-288 Trường Đại học Cần Thơ 287 nhiễm cao hơn cá không được gây cảm nhiễm (kể cả cá có ăn hoàng kỳ và cá không ăn hoàng kỳ). Ở các mẫu cá được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cao hơn cá được gây cảm nhiễm không sử dụng hoàng kỳ, khả năng diệt khuẩn của các mẫu huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm cũng cho kết quả tương tự. Điều này cho thấy việc bổ sung hoàng kỳ cho cá tra có thể làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu trong việc đề kháng E. ictaluri thông qua làm tăng khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. Bảng 3. Phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). I: huyết thanh cá được gây cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ; II: huyết thanh cá được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ; ĐC: huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm không ăn hoàng kỳ; HK: huyết thanh cá không được gây cảm nhiễm có ăn hoàng kỳ 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Cá tra cho ăn hoàng kỳ sau 5 tuần có số lượng hồng cầu tăng so với cá không ăn hoàng kỳ. Tổng bạch cầu, lympho, tiểu cầu tăng dần qua các tuần cao hơn nghiệm đối chứng và có ý nghĩa thống kê sau 5 tuần thí nghiệm. Sau khi gây cảm nhiễm E. ictaluri, cá ăn hoàng kỳ vẫn có các thông số huyết học cao hơn cá không ăn hoàng kỳ. Khả năng diệt khuẩn c ủa huyết thanh cá được gây cảm nhiễm cao hơn cá không được gây cảm nhiễm, cá ăn hoàng kỳ cao hơn cá không ăn hoàng kỳ. Kết quả làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm sử dụng chiết xuất từ cây hoàng kỳ để phòng bệnh do vi khuẩn ở cá tra. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ainsworth, A.J., Dexiang, C. (1990). Differences in the phagocytosis of four bacteria by channel catfish neutrophils. Dev. Comp. Immunol. 14: 201. Ardó L, Guojun Yin, Pao Xu, László Váradi, Gábor Szigeti, Zsigmond Jeney, Galina Jeney, 2008. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera Mẫu I II ĐC HK 1 132,71 29,64 126,68 174,18 106,21 2 67,04 59,6 89,69 78,28 136,07 3 132,95 90,56 127,13 102,68 166,4 4 30,57 42,56 56,83 6,59 101,94 5 124,64 90,12 81,61 55,07 - 6 109,26 32,86 77,27 8,57 - Trung bình 48,81±18,79 a 31.25±2,28 ab 73,26±23,23 b 66,68±16,41 ab [...]... Nhà xuất bản Nông nghiệp 439 trang Dügenci, Süheyla Karata, Nazlı Arda, Akın Candan 2003 Some medicinal plants as immunostimulant for fish Jounal of Ethnopharmacology 88 (2003) Newman.S.G 1973 Bacterial Vaccines for Fish Annual Rev of Fish Diseases (1993) Nguyễn Quốc Thịnh, 2006 Điều tra đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng thuốc hóa chất trong quá trình nuôi đến tình hình bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus). .. và Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ 137-142 Vũ Triệu An và Jean, C.H 2001 Miễn dịch học Nhà xuất bản Y học Yin G, Galina Jeney, Timea Racz, Pao Xu, Xie Jun, Zsigmond Jeney Effect of two Chinese herbs (Astragalus radix and Scutellaria radix) on non-specific immune response of tilapia, Oreochromis niloticus... Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh (2011) Sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá tra nhiễm Edwardsiella ictaluri Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ Shotts, E.B., Blazer, VS., Waltman, W.D (1986) Pathogenesis of experimental Edwardsiella ictaluri in channel catfish (Ictalurus punctatus) Can J Fish Aquat Sci 43:36-42 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị . Thơ 278 ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ (Astragalus radix) LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus). Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá tra nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây hoàng