NGHIÊN cứu ở mức độ PHÂN tử KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM của một số VI KHUẨN GRAM âm PHÂN lập từ BỆNH NHÂN tại BỆNH VIỆN VIỆT đức và BỆNH VIỆN QUÂN đội 108

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN QUÂN ĐỘI 108 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2017 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Đặng Đức Anh GS TS Phạm Văn Ty Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án Tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi …, ngày …tháng …năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Vi khuẩn kháng kháng sinh vấn đề nghiêm trọng đóng vai trị trọng tâm cơng tác chăm sóc sức khoẻ người tồn giới Sự quan ngại ngày lớn xuất lây lan nhanh chóng chủng vi khuẩn kháng carbapenem, coi kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” điều trị trường hợp nhiễm trùng vi khuẩn đa kháng thuốc gây bệnh viện Do vấn đề giành quan tâm đặc biệt nhà khoa học giới với số lượng nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh ngày tăng Việt Nam nằm khu vực châu Á xem "điểm nóng" vi khuẩn kháng kháng sinh Hiện báo cáo cho thấy vi khuẩn Gram âm kháng lại carbapenem bệnh viện mức độ cao Một số nghiên cứu vai trò gen NDM-1, KPC, OXA23 OXA-58 chế kháng carbapenem vi khuẩn Gram âm phân lập số bệnh viện Việt Nam bước đầu xác định số đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn kháng carbapenem phân lập Để giải vấn đề tồn từ nghiên cứu trước như: tồn gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme carbapenemase (gọi tắt gen carbapenemase) khác; mối liên hệ kiểu gen, sequence type (ST) chủng mang gen kháng Việt Nam giới đặc biệt bối cảnh giao thông du lịch phát triển mạnh, tạo hội cho lây lan chủng kháng phạm vi giới; đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập bệnh viện lớn Việt Nam, sử dụng kỹ thuật tiên tiến để thực đề tài: "Nghiên cứu mức độ phân tử khả kháng carbapenem số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Quân đội 108" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phát gen carbapenemase chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem phân lập Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN - Kết nghiên cứu cho thấy vai trò chế sinh carbapenemase đặc tính kháng carbapenem vi khuẩn Gram âm phân lập bệnh viện, qua bổ sung số liệu quan trọng mức độ phan tử thực trạng kháng carbapenem Việt Nam - Luận án cung cấp thơng tin hữu ích nguồn gốc lây lan chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem địa điểm nghiên cứu mối quan hệ với chủng kháng giới - Kết nghiên cứu sở khoa học để đưa biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu bệnh viện, đồng thời góp phần giảm gánh nặng nguy lan truyền vi khuẩn kháng thuốc cộng đồng - Việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến giới vào nghiên cứu góp phần nâng cao lực NCS nói riêng tồn nhóm nghiên cứu nói chung chất lượng cơng trình nghiên cứu ngang tầm với quốc gia khác khu vực giới NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Là nghiên cứu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến (giải trình tự toàn hệ gen vi khuẩn) để xác định chế kháng carbapenem mức độ phân tử sinh tổng hợp enzyme carbapenemase số chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng phổ biến phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng - Kết nghiên cứu cho thấy tranh rõ nét mối liên hệ kiểu gen, sequence type chủng vi khuẩn kháng carbapenem nghiên cứu với chủng vi khuẩn sinh carbapenemase số bệnh viện khác Hà Nội giới - Nghiên cứu đặc điểm phân tử plasmid yếu tố di truyền di động mang gen carbapenemase CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo phụ lục; gồm chương, 37 hình, 10 bảng, 234 tài liệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt, 220 tài liệu tiếng Anh) Bố cục luận án gồm: Mở đầu trang, Tổng quan 37 trang, Vật liệu phương pháp nghiên cứu 15 trang, Kết bàn luận 59 trang, Kết luận trang, Kiến nghị trang; báo có liên quan trực tiếp đến luận án công bố CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Gram âm tính kháng kháng sinh 1.1.1 Vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có nhiều gen quan trọng nằm ADN vịng tách biệt, rải rác nguyên sinh chất vi khuẩn gọi plasmid Plasmid thường chứa gen sản xuất kháng sinh, số gen sản xuất loại độc tố protein có hoạt tính cao có chức tăng cường độc lực cho vi khuẩn Plasmid công cụ giúp vận chuyển ADN từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác thông qua tượng truyền gen ngang nên chúng đóng vai trị quan trọng lĩnh vực y, sinh, nông, dược môi trường 1.1.2 Tính kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm Tính đề kháng kháng sinh vi khuẩn bắt nguồn từ hai yếu tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng vi sinh vật hoạt tính kháng sinh ức chế vi khuẩn nhạy chọn lọc vi khuẩn kháng Tính đề kháng phát triển có mặt đồng thời yếu tố môi trường vật chủ Các gen quy định đặc tính kháng tế bào vi khuẩn nhân lên lan rộng áp lực chọn lọc kháng sinh có môi trường 1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm thường phân thành nhóm chế chính: làm giảm hấp thụ kháng sinh vào bên tế bào vi khuẩn, thay đổi đích tác động kháng sinh sản sinh enzyme để ức chế biến đổi kháng sinh 1.1.4 Cơ sở di truyền học chế kháng kháng sinh Đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn đề kháng tự nhiên đề kháng thu Đề kháng tự nhiên đặc điểm sinh học lồi, thường có yếu tố di truyền với mục đích bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động kháng sinh Đề kháng thu đề kháng có nhờ đột biến gen, nhận gen đề kháng từ bên ngồi thơng qua truyền gen ngang kết hợp chế 1.2 Kháng sinh nhóm carbapenem chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm 1.2.1 Kháng sinh nhóm carbapenem Kháng sinh nhóm carbapenems xem “sự lựa chọn cuối cùng”, thường định điều trị trường hợp nhiễm trùng nặng nhiễm trùng vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng Cơ chế tác động kháng sinh nhóm carbapenem gắn bất hoạt protein gắn penicillin (PBP), qua ức chế q trình hình thành peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn 1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm Ba chế đề kháng carbapenem phổ biến vi khuẩn Gram âm bao gồm: gen nằm nhiễm sắc thể plasmid mã hóa sinh tổng hợp enzyme carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo đột biến làm giảm tính thấm màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu và/ hoạt động lỗ màng phân tử PBP; sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh tế bào vi khuẩn Trong chế này, chế sinh tổng hợp carbapenemase chế phổ biến nghiên cứu sâu rộng Các enzyme carbapenemase phát chủ yếu thuộc nhóm A (ví dụ enzyme KPC GES), nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ enzyme VIM, IMP NDM) nhóm D (ví dụ enzyme họ OXA OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181) Đối với vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng bao gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm B) OXA-48 (nhóm D) 1.3 Một số phương pháp đại ứng dụng nghiên cứu chế đề kháng carbapenem mức độ phân tử khả lan truyền chủng vi khuẩn mang gen kháng Các phương pháp nghiên cứu đặc tính chế kháng carbapenem mức độ phân tử chủng vi khuẩn kháng thuốc bao gồm: kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR); thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung Triton (Triton Hodge Test - THT) Carba NP cải tiến; S1-PFGE kết hợp với Southern blotting; phân loại plasmid giải trình tự gen Các phương pháp nghiên cứu khả lan truyền chủng vi khuẩn mang gen kháng bao gồm: phương pháp điện di xung trường (PFGE), phân loại trình tự đa vị trí (MLST) tiếp hợp 1.4 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm giới Việt Nam 1.4.1 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm giới Các kháng sinh hệ đắt tiền, chí số kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” nhóm carbapenem dần hiệu lực Vi khuẩn mang gen carbapenemase nhóm A, B D xuất toàn giới mức độ gây vụ dịch lớn trường hợp riêng rẽ 1.4.2 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm Việt Nam Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm kháng lại kháng sinh mức độ cao Tại bệnh viện vào năm 2008 ghi nhận mức độ kháng carbapenem chủng P aeruginosa 20% chủng A baumannii gần 50% Theo nghiên cứu bệnh nhân nhi thuộc Khoa hồi sức cấp cứu bệnh viện tuyến đầu Việt Nam cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem chủng K pneumoniae, P aeruginosa A baumannii 55%, 71% 65% Các nghiên cứu chế kháng carbapenem Việt Nam cho thấy xuất gen NDM-1, KPC, OXA-23, OXA-51 OXA58 chủng vi khuẩn đường ruột A baumannii phân lập số bệnh viện lớn Tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem có xu hướng tăng ngày lan rộng Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu Chọn có chủ đích Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Trung ương Quân đội (TƯQĐ) 108 2.2 Thiết kế nghiên cứu Mơ tả phân tích phịng thí nghiệm 2.3 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Nghiên cứu thực giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2017 Địa điểm thực hiện: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Oxford Hà Nội (OUCRU), Việt Nam; Trường Đại học Cardiff Trường Đại học Oxford, Vương quốc Anh; Viện Nghiên cứu Quốc gia bệnh truyền nhiễm, Nhật Bản 2.4 Đối tượng cỡ mẫu nghiên cứu 622 chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm bệnh viện Việt Đức TƯQĐ 108 cho kết kháng sinh đồ kháng với loại kháng sinh thuộc nhóm carbapenem 2.6 Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy vi khuẩn; tách chiết ADN; phản ứng PCR; Hodge test Carba NP cải tiến; thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế phát triển vi khuẩn (MIC); PFGE; giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn (WGS); S1-PFGE Southern blotting; tiếp hợp vi khuẩn 2.7 Xử lý phân tích số liệu Phần mềm Excel phần mềm tin sinh học chuyên dụng khác 2.9 Đạo đức nghiên cứu Mọi thông tin cá nhân bệnh nhân bảo mật CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Một số đặc điểm chung chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện Tổng số chủng vi khuẩn thu thập giai đoạn nghiên cứu 622 chủng từ Bệnh viện Việt Đức 318 chủng từ Bệnh viện TƯQĐ 108 304 chủng Trong tổng số 622 chủng thu thập được, A baumannii chiếm tỉ lệ lớn 53% (n=330), K pneumoniae 26% (n=162) thấp E coli với 21% (n=130) Tỉ lệ A baumannii kháng carbapenem cao phù hợp với công bố trước tỉ lệ chủng A baumannii chiếm ưu bệnh viện Việt Nam 3.2 Phát gen mã hoá khả sinh tổng hợp enzyme carbapenemase chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập bệnh viện Trong loại vi khuẩn nghiên cứu, chủng A baumannii có tỷ lệ mang gen carbapenemase cao với 92,12% (304/330 chủng), K pneumoniae với 54,32% (88/162 chủng) cuối E coli với 30,0% (39/130 chủng) (Bảng 3.2) Điều cho thấy nhiều khả chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem chủ yếu chủng A baumannii K pneumoniae phân lập Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện TƯQĐ 108 thông qua việc sinh tổng hợp enzyme Do độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp với chủng gen carbapenemase khác khác nên tổng hợp kết phương pháp có 100% (39/39) chủng E coli, >90% chủng K pneumoniae A baumannii mang gen có khả sinh carbapenemase Các bệnh viện Việt Nam chưa áp dụng kỹ thuật để phát kiểm soát lây lan chủng vi khuẩn kháng sinh carbapenemase khuyến cáo CLSI Từ kết nghiên cứu cho thấy Carba NP cải tiến có độ nhạy cao với loại vi khuẩn, thời gian thực ngắn (khoảng giờ), thao tác thực đơn giản giá thành hợp lý nên việc đưa Carba NP cải tiến vào áp dụng bệnh viện Việt Nam để sàng lọc phát nhanh chủng sinh carbapenemase hoàn toàn khả thi cần thiết, đặc biệt nhận thức tầm quan trọng việc phát sớm chủng sinh carbapenemase nỗ lực tăng cường hiệu cho công tác điều trị kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện 3.3.2 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn mang gen kháng theo tiêu chuẩn lâm sàng Kết MIC cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng lại IMP MEM theo tiêu chuẩn lâm sàng mức cao, cao A baumannii (85,56% 90%), thấp E coli (76,92% 69,23%) Trong nhiều chủng kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem nồng độ cao 32-256 µg/ml Mức độ đề kháng chủng vi khuẩn với kháng sinh khác CIP, CAZ cao, cao CTX với tỉ lệ chủng E coli, K pneumoniae A baumannii kháng 94,87%, 96,3% 96,67% Sự có mặt phổ biến gen sinh ESBL TEM, SHV, CTX chủng kháng sở giải thích cho mức độ đề kháng cao với kháng sinh Đa số chủng 11 kháng (> 90%) nhạy với colistin Nếu chủng kháng kháng sinh thơng thường nhóm carbapenem lại kháng colistin dẫn đến nguy không cịn thuốc kháng sinh có tác dụng điều trị Đáng lưu ý tổng số 431 chủng có 11 chủng kháng với loại kháng sinh, chiếm 2,55% Với tốc độ gia tăng nhanh chóng tỉ lệ đề kháng carbapenem vi khuẩn Gram âm năm gần Việt Nam, hồn tồn có khả tỉ lệ tăng lên nhanh chóng, cảnh báo khả lan rộng chủng vi khuẩn kháng hết loại kháng sinh dẫn đến thất bại điều trị 3.4 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Trung ương quân đội 108 3.4.1 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phương pháp PFGE Nhìn chung chủng E coli mang gen kháng có độ tương đồng khơng cao, có nhóm kiểu gen có độ tương đồng ≥ 80% Trái lại chủng K pneumoniae A baumannii có độ tương đồng cao với nhóm kiểu gen (Hình 3.8) Ở loại vi khuẩn ghi nhận tượng nhóm kiểu gen tương đồng bao gồm chủng thuộc khoa, thuộc khoa khác bệnh viện phân lập năm nhiều năm khác Đây sở để đưa giả thuyết lây lan chủng mang gen kháng bệnh nhân khoa; lưu hành chủng kháng qua nhiều năm khoa khả lây lan khoa khác Các chủng khơng thuộc nhóm kiểu gen độ tương đồng thấp nên không nguồn gốc hình thành cách riêng lẻ 12 áp lực chọn lọc tự nhiên lây nhiễm từ mơi trường bên ngồi bệnh viện Hình 3.8: Mối liên hệ kiểu gen chủng A baumannii mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ bệnh viện 3.4.2 Xác định mối liên hệ kiểu gen sequence type chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase Việt Nam giới phương pháp WGS 3.4.2.1 Mối liên hệ kiểu gen sequence type chủng vi khuẩn E coli mang gen carbapenemase Việt Nam giới Kết phân tích mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập bệnh viện tương đồng với kết PFGE: có mối liên hệ chặt chẽ kiểu gen chủng vi khuẩn phân lập vào năm khác khoa khoa khác Bệnh viện Việt Đức Điều lần củng cố thêm cho giả thuyết lưu hành chủng mang gen kháng nội khoa qua năm lan truyền khoa khác 13 Từ kết phân tích, so sánh core genome chủng vi khuẩn nghiên cứu với bệnh viện lớn khác Hà Nội (Hình 3.10), nhận thấy hai vấn đề cộm bệnh viện lớn Hà Nội: (i) phát tán rộng rãi plasmid mang gen NDM chủng E coli (gen NDM phân bố 10/12 ST có chủng mang gen kháng tỉ lệ dương tính với gen NDM cao); (ii) kiểu kháng nguồn gốc chủng kháng bệnh viện có khác biệt cho thấy nhiều khả chủng kháng hình thành áp lực chọn lọc tự nhiên từ thói quen sử dụng kháng sinh khác bệnh viện bắt nguồn từ lây lan bệnh viện với Hình 3.10: Cây phân loại core genome sequence type chủng vi khuẩn E coli mang gen carbapenemase phân lập bệnh viện Hà Nội Một chủng bệnh viện TƯQĐ 108 thuộc ST457, ST gần phát mang gen MCR-1 kháng colistin Việt Nam Trung Quốc Nếu chủng E coli ST457 mang gen kháng carbapenem colistin truyền plasmid cho tạo nên hệ sau kháng loại kháng sinh kháng nhiều nhóm kháng sinh khác, vơ hiệu hố loại kháng sinh sử dụng lâm 14 sàng gây hậu đặc biệt nghiêm trọng cho sức khoẻ người So sánh ST chủng E coli sinh carbapenemase phân lập Việt Nam với giới (Hình 3.11) nhận thấy số ST phổ biến khắp châu lục ST131, ST101, ST167, ST617, ST648, ST38 xuất Việt Nam, đặc biệt ST131 chịu trách nhiệm cho vụ dịch nhiễm khuẩn bệnh viện lớn xảy mơi trường bệnh viện Có ST ghi nhận lần đầu Việt Nam ST48, ST709, ST448, ST2930, ST3580, ST48 ST709 thuộc clonal complex ST10 thường mang gen sinh ESBL người, động vật môi trường, cho thấy mối nguy hiểm tiềm tàng khả lây lan chủng vi khuẩn mang gen kháng sang vật chủ khác Hình 3.11: Biểu đồ mối liên hệ phân bố sequence type chủng vi khuẩn E coli mang gen carbapenemase giới 15 3.4.2.2 Mối liên hệ kiểu gen sequence type chủng vi khuẩn K pneumoniae mang gen carbapenemase Việt Nam giới Tương tự E coli, nhóm chủng K pneumoniae có mối quan hệ gần gũi kiểu gen thuộc ST ST clonal complex (Hình 3.12) Các chủng mang gen kháng phân bố vào 11 ST khác chiếm ưu ST11 ST15, nhóm ST gây vụ dịch lớn giới Hình 3.12: Cây phân loại core genome sequence type chủng vi khuẩn K pneumoniae mang gen carbapenemase phân lập bệnh viện Cả gen KPC, NDM OXA-48 xuất chủng thuộc ST11 Việc chủng thuộc ST mang nhiều gen carbapenemase (nằm plasmid) điều kiện thuận lợi để tạo chủng mang đồng thời nhiều gen kháng khác thông qua 16 phương thức truyền gen ngang, ví dụ ghi nhận 01 chủng K pneumoniae ST11 mang gen NDM-1 OXA-181 Cũng tương tự chủng E coli, gen NDM phân bố rộng khắp 10/11 ST, KPC OXA-48 lại có xu hướng khu trú vào vài ST định Trong vài năm trở lại đây, số dòng vi khuẩn kháng dần thay clonal complex ST258 gây dịch nhiều quốc gia giới, điển hình ST307, dịng vi khuẩn gắn liền với lan rộng toàn giới gen CTX-M-15 sinh ESBL trước mang gen KPC gây vụ dịch lớn Italy năm 2014 gần Hàn Quốc năm 2015 Trong nghiên cứu có chủng ST307, dù số lượng cịn cần phải theo dõi sát dòng vi khuẩn thời gian tới hậu nghiêm trọng mà gây tỉ lệ tử vong cao, kéo dài thời gian điều trị so với dòng vi khuẩn khác Khi tổng hợp thêm liệu WGS bệnh viện Thanh Nhàn Xanh Pôn kết nghiên cứu bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, nhận thấy ST15 dòng ST trội bệnh viện lớn Việt Nam Kết phân tích mối liên hệ sequence type chủng K pneumoniae phân lập Việt Nam giới (Hình 3.14) cho thấy chủng thịnh hành toàn giới ST15, ST11, ST307, ST395, ST231, ST37, ST16 ghi nhận Việt Nam Đáng ý không phát ST258 Việt Nam chủng gây đại dịch quốc gia Châu Âu Mỹ Thay vào đó, phổ biến ST15 ST11 Việt Nam hoàn toàn tương đồng với tình hình chung khu vực Châu Á Trung Quốc Đài Loan, quốc gia coi ST11 ST chịu trách nhiệm cho lan truyền rộng rãi trội chủng sinh carbapenemase Như 17 chủng mang gen carbapenemase Việt Nam nhiều khả có nguồn gốc với chủng khu vực Châu Á, điển hình Trung Quốc Một nguyên nhân dẫn đến tình trạng vị trí tiếp giáp mật độ thông thương cao Việt Nam Trung Quốc Hình 3.14: Cây phân loại core genome sequence type chủng vi khuẩn E coli mang gen carbapenemase phân lập bệnh viện Hà Nội Với phát tương đồng tồn ST thịnh hành giới ST xuất Việt Nam chủng E coli K pneumoniae nghiên cứu này, đưa đến kết luận: hình thành lan truyền chủng vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập bệnh viện Việt Nam thơng qua đường chính: (i) lan truyền chủng mang gen kháng từ quốc gia khu vực giới; (ii) hình thành áp lực chọn lọc tự nhiên, hậu việc sử dụng kháng sinh điều trị khoảng thời gian dài liên tục Dù theo đường thấy 18 rõ ràng mức độ kháng kháng sinh chủng vi khuẩn bệnh viện Việt Nam mức báo động 3.4.3 Xác định chế lan truyền qua trung gian plasmid chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase Plasmid mang gen NDM-1 KPC Việt Nam chủ yếu thuộc nhóm IncF, nhóm phổ biến họ vi khuẩn đường ruột Điểm đặc biệt nhóm plasmid IncF mang đồng thời nhiều replicon khác nhau, giúp mở rộng phổ vật chủ tăng cường khả chép có tính linh hoạt khả thích ứng cao, giúp chúng lan truyền nhanh chóng quần thể vật chủ Khác với plasmid mang gen KPC bệnh viện có kích thước khoảng 55 kb, plasmid mang gen NDM-1 đa dạng kích thước: 45 kb, 55 kb, 60 kb, 80 kb, 90 kb, 105 kb, 130 kb 170kb (Hình 3.16) Hình 3.16: Kết phát plasmid mang gen NDM số chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện Trong plasmid mang gen OXA-48 nghiên cứu thuộc loại IncL/M kích thước khoảng 60kb, có khả tự truyền phổ vật chủ rộng, hoàn toàn tương đồng với plasmid mang gen OXA48 phát toàn giới Kết tiếp hợp thành công chủng vi khuẩn mang gen chủng vi khuẩn nhận E coli J53 kháng sodium azide không cao (12,5 %; 3/24 chủng) gồm chủng E coli có plasmid mang gen NDM 19 chủng K pneumoniae mang plasmid chứa gen KPC Mặc dù tỉ lệ tiếp hợp thành công thấp việc truyền plasmid chủng nghiên cứu in vitro đủ chứng minh chủng vi khuẩn hồn tồn truyền gen kháng qua trung gian plasmid Đây chế quan trọng giúp gen carbapenemase nói riêng gen kháng kháng sinh khác nói chung lây lan mơi trường bệnh viện chí từ bệnh viện cộng đồng 3.4.4 Xác định cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen carbapenemase 3.4.4.1 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen KPC-2 Phát mơ hình cấu trúc khác biệt yếu tố di truyền di động mang gen KPC-2 chủng (Hình 3.18) Hình 3.18: Các dạng cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen KPC-2 Mơ hình (I): KPC nằm transposon Tn4401b có khung transposon Tn3, ISKpn6 ISKpn7, có khả di chuyển gen KPC với hiệu suất cao "nhảy" sang nhiều loại plasmid có khả tiếp hợp, đóng vai trò đặc biệt quan trọng việc lan truyền gen KPC nhiều quốc gia giới Mô hình (II): giữ khung Tn3 kèm với cụm ISKpn27-KPC-∆ISKpn6 ghi 20 nhận Trung Quốc, kết lan truyền chủng vi khuẩn kháng thuốc từ Trung Quốc Mơ hình (III) với xuất cụm ISEcp1-CTX-M bên cạnh cụm ISKpn27-KPC-∆ISKpn6 plasmid chưa ghi nhận công bố trước Nhiều khả nguồn gốc hình thành plasmid tồn đồng thời plasmid mang gen KPC CTX chủng vi khuẩn kháng kết hợp với tượng tái tổ hợp khiến cụm ISEcp1-CTX-M chèn vào cấu trúc ISKpn27-KPC∆ISKpn6 transposon Tn3 Đây chứng quan trọng cho thấy tồn nhiều gen mã hoá carbapenemase chủng phân lập dẫn đến nguy xảy tượng tái tổ hợp dẫn đến việc gen kháng khác nằm plasmid 3.4.4.2 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen NDM-1 Có mơ hình cấu trúc khác nhau, mơ hình (I) phổ biển với cấu trúc điển hình transposon Tn125, phát quốc gia khác Ấn Độ, Ba Lan, Trung Quốc (Hình 3.19) Mơ hình (II) (IV) cho thấy dấu hiệu tượng tái tổ hợp Mơ hình (III) xuất thêm gen kháng kháng sinh khác DHA-1 AmpR mã hố tính kháng cephalosporin phổ rộng ampicilin Rõ ràng với nguồn gen phong phú áp lực chọn lọc tự nhiên, chủng vi khuẩn kháng ngày tiến hố theo nhiều hướng có khả tích hợp nhiều gen kháng plasmid thông qua phương thức truyền gen ngang Không Việt Nam mà nhìn chung giới nhận thấy cụm ISAba125/∆ISAba125-NDM-1-ble bảo tồn, tồn nhiều dạng cấu trúc khác nhau, tương ứng với đa dạng plasmid mang gen lan truyền rộng rãi gen NDM-1 chủng vi khuẩn tồn giới 21 Hình 3.19: Các dạng cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen NDM-1 3.4.4.3 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen IMP-1 Gen IMP-1 nằm integron class có nhiều điểm tương đồng với integron mang gen IMP-5 chủng A baumannii phân lập Bồ Đào Nha năm 1998 Cấu trúc có điểm khác biệt với integron class truyền thống xuất yếu tố dịch chuyển lặp lại đảo (MITE) có khả làm tăng khả dịch chuyển integron Trước phức hợp MITE-integron phát chủng A baumannii phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng, nghiên cứu ghi nhận xuất ba lồi khác thuộc họ Acinetobacter, phát triển hệ đường ruột tôm Đây chứng cho thấy mối liên quan chủng mang gen kháng có thực phẩm chủng phân lập từ người 22 3.4.4.4 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen OXA-48 Tồn cấu trúc mang gen OXA-48: transposon Tn1999 bao gồm cụm cấu trúc IS1999-OXA48-lysR-IS1999 thường nằm plasmid nhóm IncL/M, nhiều khả có chung nguồn gốc với plasmid phát quốc gia khác Nhờ đặc tính Tn1999 với plasmid mang transposon này, gen OXA-48 Việt Nam xuất nhiều loài vi khuẩn đường ruột E coli, K pneumoniae, E cloacae C freunddi việc phát kiểm sốt lây lan chủng mang OXA-48 cấp thiết 3.4.4.5 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen OXA-23 Trong nghiên cứu phát cấu trúc tương tự chủng A baumannii mang gen OXA-23 phân lập nhiều nơi giới Sự xuất ISAba1 trước gen OXA-23 có xu hướng làm tăng biểu cho gen qua tăng tính đề kháng với kháng sinh nhóm carbapenem ISAba1 có mặt phần lớn chủng nghiên cứu với 84/90 chủng (93,33%) Sự phổ biến ISAba1 nghiên cứu chúng tơi hồn tồn phù hợp với công bố khác giới KẾT LUẬN Đã phát 431/622 chủng vi khuẩn (chiếm 69,3%) mang gen carbapenemase nhóm A, B D Gen OXA-23 phổ biến giới hạn chủng A baumannii gen NDM-1 phát tán khắp loại vi khuẩn bệnh viện khác Lần đầu phát số biến thể gen carbapenemase Việt Nam: NDM-6, NDM-9 OXA-181 Trên 90% chủng mang gen có khả sinh enzyme carbapenemase cho thấy Carba NP cải tiến kỹ thuật áp dụng rộng rãi bệnh viện để sàng lọc chủng mang gen kháng 23 Có tương đồng kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase khoa, khoa khác năm khác Đã xuất nhiều chủng gây dịch giới Việt Nam bao gồm: E coli ST101, K pneumoniae ST15 ST11 Đã chứng minh lan truyền qua trung gian plasmid số gen carbapenemase mơ hình phịng thí nghiệm Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen carbapenemase Việt Nam có nhiều điểm tương đồng với nước khu vực giới KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu chế kháng carbapenem khác vi khuẩn Gram âm; xác định khởi nguồn, tiến trình chế lan truyền vi khuẩn kháng thuốc môi trường bệnh viện; đặc điểm cấu trúc hoàn chỉnh plasmid mang gen kháng - Tăng cường cơng tác kiểm sốt nhiễm khuẩn bệnh viện nghiên cứu 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trần Diệu Linh, Nguyễn Hoài Thu, Trần Như Dương, Trần Vân Phương, Phạm Duy Thái, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Đặng Đức Anh, Đinh Duy Kháng, Trịnh Hồng Sơn, Phạm Văn Ty, Nguyễn Bình Minh, Trần Huy Hoàng (2016), "Escherichia coli mang gen blaKPC-2 phân lập Bệnh viện Việt Đức năm 2010-2012", Tạp chí Y học Việt Nam 443(6), tr 70-73 Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức Anh, Nguyễn Bình Minh, Đinh Duy Kháng, Phạm Văn Ty, Trần Huy Hoàng (2016), "Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện có nguyên nhân từ chủng vi khuẩn đường ruột sinh KPC kháng carbapenem phân lập bệnh viện Hà Nội", Tạp chí Y học Việt Nam 444(7), tr 148-152 Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức Anh, Nguyễn Bình Minh, Đinh Duy Kháng, Phạm Văn Ty Trần Huy Hoàng (2016), "Tỷ lệ vi khuẩn mang gen mã hóa tính kháng Extended-βlactamases (ESBLs) chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem mang gen blaKPC-2 phân lập bệnh viện", Tạp chí Y học dự phòng, 26(7), tr 27-33 Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Kim Phương, Phạm Duy Thái, Nguyễn Thanh Thuỷ, Đặng Đức Anh, Trần Như Dương, Phạm Văn Ty, Phan Quốc Hoàn, Lê Văn Hưng, Trần Huy Hoàng (2018), " Vi khuẩn Gram âm mang gen mã hoá enzyme carbapenemase phân lập Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 giai đoạn từ 2014 đến 2015", dự kiến đăng Tạp chí Y học dự phịng 28(1) ... carbapenem phân lập Bệnh vi? ??n Vi? ??t Đức Bệnh vi? ??n Trung ương Quân đội 108 Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập Bệnh vi? ??n Vi? ??t Đức Bệnh vi? ??n Trung ương Quân đội 108. .. carbapenem số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân Bệnh vi? ??n Vi? ??t Đức Bệnh vi? ??n Quân đội 108" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phát gen carbapenemase chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem. .. kháng phạm vi giới; đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập bệnh vi? ??n lớn Vi? ??t Nam, sử dụng kỹ thuật tiên tiến để thực đề tài: "Nghiên cứu mức độ phân tử khả kháng carbapenem