Nghiên cứu đã làm thuần và định danh được chủng Bacillus vezelensis có khả năng kháng nhiều loài nấm gây bệnh thực vật như Alternaria sp., Fusarium F1, Collectotrichunm R6 và Pyricularia oryzea. Trên môi trường khoai tây – glucose, chủng sinh hoạt chất kháng Alternaria sp. tốt nhất sau 5 ngày, với đường kính vòng kháng nấm đạt 17,5mm.
http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2021.02.169 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM ALTERNARIA SP CỦA BACILLUS VEZELENSIS Trần Ngọc Hùng(1), Nguyễn Nhật Hào(1), Phan Ngọc Minh(1) (1) Trường đại học Thủ Dầu Một Ngày nhận 20/01/2021;Ngày phản biện 28/01/2021; Chấp nhận đăng 30/03/2021 Liên hệ email: hungtngoc@tdmu.edu.vn https://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2021.02.169 Tóm tắt Nấm Alternaria tác nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo Việc kiểm soát nấm bệnh biện pháp sinh học mục tiêu nhằm nâng cao chất lượng giá trị xuất trái chanh leo Nghiên cứu làm định danh chủng Bacillus vezelensis có khả kháng nhiều loài nấm gây bệnh thực vật Alternaria sp., Fusarium F1, Collectotrichunm R6 Pyricularia oryzea Trên môi trường khoai tây – glucose, chủng sinh hoạt chất kháng Alternaria sp tốt sau ngày, với đường kính vịng kháng nấm đạt 17,5mm Hoạt chất kháng nấm thu nhận hiệu kết tủa với 50% ethanol thời gian 60 phút Từ khóa: Alternaria sp., Bacillus vezelensis, hoạt chất kháng nấm Abstract ISOLATION AND ASSESSING THE ABILITY TO SYNTHESIS THE COMPOUDS INHIBIT Alternaria sp FROM Bacillus vezelensis Alternaria is the main agent cause the brown-spot disease on passion fruit Controlling the disease fungi by biological solutions is necessary to improve the quality and export value of the passion fruit The study isolated and classify the Bacillus vezelensis has a ability to inhibit many damaging fungi species on plants such as Alternaria sp., Fusarium F1, Collectotrichunm R6 and Pyricularia oryzea On the potato – glucose medium, the bacterial strain synthesis best the anti-Alternaria compounds for days, the diameter of antifungal zone gets 17.5mm The antifugal compounds were recipitated effectively with ethanol 50% for 60 minutes Đặt vấn đề Theo báo cáo Cục trồng trọt, tính đến cuối năm 2019, diện tích trồng chanh leo đạt khoảng 10.500ha Là ăn có giá trị tỉnh Tây nguyên, trồng chanh leo lại tốn cơng chăm sóc nên nhiều hộ nơng dân mạnh dạn mở rộng diện tích Việc người dân ạt trồng chanh leo không theo quy hoạch dẫn tới dịch bệnh bùng phát gây thiệt hại cho nhà nơng, điển hình bệnh đốm nâu nấm 14 Tạp chí khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(51)-2021 Alternaria passiflorae gây Các biện pháp phòng trừ bệnh hại chủ yếu sử dụng loại thuốc hố học có gốc Copper, Metalaxyl, Tuy cho hiệu nhanh độc hại Thị trường xuất chanh leo mở rộng tới 50 nước Do đó, nhiều biện pháp sinh học trọng phát triển nhằm phục vụ nông nghiệp bền vững đáp ứng yêu cầu xuất thị trường giới (Nguyễn Văn hòa cs., 2016) Vi khuẩn Bacillus vezelensis (thuộc nhóm Bacillus subtilis) phân loại gần đây, cho thấy nhiều ưu điểm việc kiểm soát loài nấm bệnh hại trồng (Rooney cs., 2009) Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng biện pháp sinh học để kiểm soát bệnh trồng chủ yếu tập trung vào xạ khuẩn, nhóm nấm đối kháng số loài thuộc chi Bacillus Một số nghiên cứu liên quan kể đến Trần Thị Thu Thủy sàng lọc chủng Bacillus megaterium ba chủng Bacillus pumilus từ 45 chủng ban đầu có khả kiểm sốt nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von (Trần Thị Thu Thủy cs., 2014); Trịnh Thành Trung cs., (2017) phân lập 15 chủng vi khuẩn Bacillus vezelensis từ vùng sinh thái khác nhau, chúng có khả kháng nhiều loại nấm bệnh khác Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici vi khuẩn gây bệnh bạc Xanthomonas oryzae Những nghiên cứu thực dòng vi khuẩn Bacillus vezelensis chưa nhiều, đặc biệt tìm hiểu đặc tính hoạt chất kháng nấm Alternaria sp Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus vezelensis có hoạt tính kháng nấm cao phân lập làm từ phịng thí nghiệm; khả kháng nấm dịch nuôi cấy chủng Bacillus vezelensis đánh giá chủng nấm gây bệnh thực vật khác ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hiệu kháng nấm; dịch nuôi cấy tiếp tục tinh sơ đánh giá hiệu kháng nấm Alternaria sp điều kiện kết tủa khác Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu môi trường dùng nghiên cứu Chủng nấm bệnh thực vật: Bao gồm Fusarium, Collectotrichunm truncatum, Pyricularia oryzea, Scytalidium, Alternaria sp phân lập từ mẫu trồng bị bệnh, phịng thí nghiệm Sinh học Trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp Môi trường potato glucose (PG): Khoai tây 200g/L, đun sôi 30 phút thu dịch chiết; glucose 50g/L Môi trường LB: Pepton 10g/L; cao nấm men 5g/L; NaCl 10g/L; pH: 7,0 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập làm vi khuẩn Bacillus: Chủng vi khuẩn mục tiêu tạp nhiễm môi trường PGA làm cách trải nhiều lần mơi trường LB Xác định hình thái chủng vi khuẩn phân lập phương pháp nhuộm gram Chủng định danh lồi phương pháp giải trình tự gen so sánh trình tự ngân hàng liệu NCBI 15 http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2021.02.169 Phương pháp xác định khả kháng nấm thạch đĩa: Các chủng nấm bệnh thực vật cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PGA Khi vòng tăng trưởng nấm đạt khoảng 2cm; khoan giếng thạch có đường kính 0,5cm phía vịng tăng trưởng nấm, cách khoảng 1,5cm Dùng 0,1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus vezelensis sau loại bỏ tế bào nhỏ vào giếng thạch; giữ nhiệt độ phòng thời gian 24 xác định đường kính vịng ức chế tăng trưởng nấm Giếng đối chứng chứa 0,1ml môi trường vô trùng (Trịnh Thành Trung cs., 2017) Phương pháp thu nhận hoạt chất kháng nấm bệnh thực vật từ môi trường nuôi cấy lỏng Bacillus vezelensis: Chủng Bacillus vezelensis nuôi cấy mơi trường PG khoảng thời gian thích hợp, tốc độ lắc 120 vòng/phút thời gian ngày; ly tâm thu dịch nuôi cấy tốc độ 10000 vòng/phút thời gian 10 phút; thu nhận hoạt chất kháng nấm cách bổ sung ethanol 99,9% với tỷ lệ từ 50-85%, thời gian kết tủa thay đổi từ 30 đến 90 phút Ly tâm thu kết tủa tốc độ 10000 vòng/phút thời gian 10 phút Kết tủa huyền phù lại 10ml nước cất vô trùng tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Xử lý thống kê: Các thí nghiệm thực lặp lại lần Phân tích ANOVA phần mềm Stargraphic Centurion 15 2.3 Bố trí thí nghiệm Phân lập định danh Bacillus vezelensis: Chủng vi khuẩn mục tiêu tạp nhiễm môi trường PGA làm cách trải nhiều lần mơi trường LB Xác định hình thái chủng vi khuẩn phân lập phương pháp nhuộm gram Chủng định danh lồi phương pháp giải trình tự gen so sánh trình tự ngân hàng liệu NCBI Khả đối kháng Bacillus vezelensis nấm gây bệnh thực vật: Các chủng nấm Fusarium, Collectotrichunm R6, Pyricularia oryzea, Scytalidium, Alternaria sp cấy vào đĩa petri chứa mơi trường PGA Khi vịng tăng trưởng nấm đạt khoảng 2cm; cấy điểm vi khuẩn Bacillus vezelensis vào phía vịng tăng trưởng nấm Giữ đĩa mơi trường nhiệt độ phịng thời gian 24-48 xác định đường kính vịng ức chế tăng trưởng nấm Đối với dịch nuôi cấy chủng Bacillus vezelensis, khoan lỗ thạch phía vịng tăng trưởng nấm Dịch ni cấy vi khuẩn Bacillus vezelensis sau loại bỏ tế bào nhỏ 0,1ml vào lỗ thạch; giữ nhiệt độ phòng thời gian 24 xác định đường kính vịng ức chế tăng trưởng nấm Lỗ thạch đối chứng chứa 0,1ml môi trường vô trùng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh hoạt chất kháng nấm: Vi khuẩn Bacillus vezelensis cấy môi trường PG; tốc độ lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ 35oC Sau khoảng thời gian ngày, ngày, ngày, ngày ngày, ly tâm thu dịch nuôi cấy bổ sung 0,1ml vào giếng Ủ nhiệt độ phòng (30oC) thời gian 24 xác định đường kính vịng kháng nấm nghiệm thức Chọn nghiệm thức có đường kính vịng kháng Alternaria sp lớn để tiến hành thử nghiệm 16 Tạp chí khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 2(51)-2021 Tinh sơ hoạt chất kháng nấm bệnh thực vật từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus vezelensis: Chủng Bacillus vezelensis nuôi cấy môi trường PG thời gian ngày; ly tâm thu dịch ni cấy tốc độ 10000 vịng/phút thời gian 10 phút; thu nhận hoạt chất kháng nấm cách bổ sung ethanol 99,9% với tỷ lệ từ 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80% 85% vào 20ml dịch ly trích, giữ nhiệt độ 5oC thời gian 60 phút Ảnh hưởng thời gian kết tủa thực với tỷ lệ ethanol tối ưu khoảng thời gian 30; 60; 90 120 phút Ly tâm thu kết tủa tốc độ 10000 vòng/phút thời gian 10 phút hòa tan 20ml nước cất vơ trùng; tiến hành đánh giá hoạt tính kháng nấm phương pháp đục lỗ thạch Chọn điều kiện kết tủa cho hiệu thu nhận hoạt chất kháng Alternaria sp tốt Kết thảo luận 3.1 Phân lập định danh Bacillus vezelensis Chủng vi khuẩn mục tiêu làm xác định số đặc điểm hình thái; kết thể hình Hình A) hình thái khuẩn lạc chủng Bacillus vezelensis mơi trường PGA; B) hình thái nhuộm gram chủng Bacillus vezelensis quan sát vật kính 100X Trên mơi trường PGA, chủng phát triển nhanh, khuẩn lạc màu vàng nhạt, mép xẻ thùy Hình ảnh nhuộm gram cho thấy tế bào vi khuẩn bắt màu tím, có dạng hình que, nằm rời rạc gắn với thành chuỗi Bằng kỹ thuật PCR vùng gen 16S chủng có trình tự sau: TAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT GTAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA CCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGC CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA AGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGC ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 17 http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2021.02.169 Kết so sánh ngân hàng liệu NCBI cho thấy chủng phân lập thuộc loài Bacillus vezelensis với mức tương đồng 99,8% (E-value = 0) 3.2 Khả đối kháng trực tiếp Bacillus vezelensis nấm gây bệnh thực vật Các chủng nấm Fusarium, Collectotrichunm R6, Pyricularia oryzea, Scytalidium, Alternaria sp cấy vào đĩa petri chứa môi trường PGA Khi vòng tăng trưởng nấm đạt khoảng 2cm; vi khuẩn Bacillus vezelensis dịch nuôi cấy cho vào phía vịng tăng trưởng nấm Giữ đĩa mơi trường nhiệt độ phịng thời gian 24-48 xác định đường kính vịng ức chế tăng trưởng nấm Kết thí nghiệm thể hình Hình Khả đối kháng nấm bệnh vi khuẩn Bacillus vezelensis Các ký tự khác cột biểu thị sai khác độ tin cậy 95% (P