Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học một số dịch chiết từ cây diệp hạ châu ngọt ở quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐÀ NẴNG KHOA HÓA  TRẦN MAI NGỌC QUẾ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU NGỌT Ở QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƢỢC ĐÀ NẴNG - 2015 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HOÁ  NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU NGỌT Ở QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƢỢC Sinh viên thực : Trần Mai Ngọc Quế Lớp : 11CHD Giáo viên hƣớng dẫn : Th.S Đỗ Thị Thúy Vân ĐÀ NẴNG – 2015 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA  CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trần Mai Ngọc Quế Lớp : 11CHD 1.Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết từ diệp hạ châu Quảng Nam” Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.1 Hóa chất: n-hexan, diclometan, etyl acetat 2.2 Dụng cụ: cân phân tích, nhiệt kế loại, ống đong loại, buret, cốc thủy tinh loại, đũa thủy tinh, bình cầu loại, bình tam giác loại, sinh hàn, lọ thủy tinh cổ rộng có nắp đậy,… 2.3 Các máy móc, thiết bị phân tích: tủ sấy, lị nung, chiết Soxhlet, máy đo sắc kí kết hợp khối phổ GC_MS,… Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu lý thuyết Tổng hợp, thu thập tài liệu, tƣ liệu, báo khoa học mà nhà nghiên cứu thực ngồi nƣớc có liên quan đến đề tài Thảo luận với giáo viên hƣớng dẫn, tổng hợp kinh nghiệm từ sinh viên khóa trƣớc 3.2 Nghiên cứu thực nghiệm 3.2.1 Phần Xử lý nguyên liệu Xác định độ ẩm Xác định hàm lƣợng tro Xác định hàm lƣợng kim loại 3.2.2 Phần Nghiên cứu điều kiện chiết tốt ảnh hƣởng tới trình chiết 3.2.3 Phần Xác định thành phần, công thức cấu tạo hợp chất hóa học từ diệp hạ châu Thử hoạt tính sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Ths Đỗ Thị Thúy Vân Ngày giao đề tài: 8/2014 Ngày hoàn thành: 4/2015 Chủ nhiệm khoa Giáo viên hƣớng dẫn PGS.TS Lê Tự Hải ThS Đỗ Thị Thúy Vân Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa ngày … tháng… năm 2015 Kết điểm đánh giá: Ngày … tháng… năm 2015 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng cảm ơn q thầy Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại Học Đà Nẵng tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành nội dung báo cáo Em xin cảm ơn ThS Đỗ Thị Thúy Vân hết lòng hƣớng dẫn tận tình cho em kiến thức quý báu để thực tốt đề tài Cuối xin chân thành cảm ơn toàn thể bạn sinh viên động viên, giúp đỡ thời gian qua Đà Nẵng, ngày 27 tháng 04 năm 2015 Sinh viên thực Trần Mai Ngọc Quế MỤC LỤC TRANG BÌA PHỤ TRANG NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC (TÊN MỤC, TRANG) DANH MỤC CÁC BẢNG (TÊN BẢNG, TRANG) DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ (TÊN, TRANG) LỜI MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU BỐ CỤC LUẬN VĂN: gồm phần Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu diệp hạ châu 1.2 Mô tả 1.3 Phân bố, sinh thái 1.4 Bộ phận dùng thu hái, chế biến 1.5 Tác dụng sinh học chi Phyllanthus 1.5.1 Một số tác dụng dƣợc lý chi Phyllanthus 1.5.2 Một số công dụng chi Phyllanthus 1.6 Thành phần hóa học 10 1.6.1 Các nhóm hợp chất hóa học có Phyllanthus urinaria L .10 1.6.2 Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Phyllanthus urinaria L 11 1.7 Phân biệt diệp hạ châu diệp hạ châu đắng 12 1.8 Một số sản phẩm đƣợc làm từ diệp hạ châu để điều trị bệnh gan:13 Chƣơng – NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 15 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.3 Hóa chất: .15 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 16 2.3 Các phƣơng pháp xác định tiêu hóa lý 17 2.3.1 Độ ẩm 17 2.3.2 Hàm lƣợng tro .18 2.3.3 Đo hàm lƣợng kim loại 19 2.4 Khảo sát thời gian chiết dƣợc liệu diệp hạ châu 19 2.5 Xác định thành phần hợp chất từ diệp hạ châu phƣơng pháp GC-MS 20 2.6 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết diệp hạ châu 21 2.6.1 Hoạt tính kháng sinh .21 2.6.2 Hoạt tính độc tế bào 22 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết xác định số tiêu hóa lý diệp hạ châu 23 3.1.1 Độ ẩm 23 3.1.2 Hàm lƣợng tro .23 3.1.3 Hàm lƣợng kim loại 24 3.2 Kết khảo sát thời gian chiết 25 3.2.1 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi n-hexan .25 3.2.2 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi diclometan 26 3.2.3 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi etyl acetat 26 3.3 Kết xác định thành phần hóa học hợp chất cắn chiết bột diệp hạ châu 27 3.3.1 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexan 28 3.3.2 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết diclometan 30 3.3.3 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat .31 3.4 Kết thử hoạt tính sinh học cắn chiết diệp hạ châu 33 3.4.1 Thử hoạt tính kháng sinh 33 3.4.2 Thử hoạt tính độc tế bào .34 Kết luận kiến nghị 35 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Phân loại diệp hạ châu Trang 1.2 Phân biệt diệp hạ châu diệp hạ châu đắng 12 3.1 Kết đo độ ẩm 23 3.2 3.3 Kết khảo sát hàm lƣợng tro Kết đo hàm lƣợng kim loại 24 24 3.4 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết với dung môi n-hexan Kết khảo sát thời gian chiết với dung môi diclometan 25 26 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết với dung môi etyl acetat 27 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexan 28 3.8 Thành phần hóa học dịch chiết diclometan 31 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat 3.10 Kết thử hoạt tính kháng sinh 32 33 3.11 Kết thử hoạt tính độc tế bào 34 Hình 3.3 Dịch chiết etyl acetat sau khảo sát thời gian chiết Bảng 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết với dung môi etyl acetat D (g/ml) 4h 6h 8h 10h 12h 0.8751 0.8856 0.8963 0.8675 0.86121 Kết thu đƣợc bảng cho ta thấy: tăng thời gian chiết khối lƣợng cắn thu đƣợc nhiều, đến lúc khối lƣợng cắn thu đƣợc lớn nhất, tiếp tục tăng thời gian chiết khối lƣợng cắn giảm nguyên nhân ta tăng thời gian kéo dài thời gian chiết nên chiết đƣợc nhiều cấu tử hàm lƣợng cấu tử tăng lên nên khối lƣợng cắn tăng nhƣng đến cấu tử tách hết khỏi bột dƣợc liệu khối lƣợng cắn không tăng Vậy thời gian chiết tốt dung môi lần lƣợt là: n-hexan – 10h, diclometan – 10h, etyl acetat - 8h 3.3 Kết xác định thành phần hóa học hợp chất cắn chiết bột diệp hạ châu Tiến hành chiết soxhlet với 20g bột dƣợc liệu, dung môi n-hexan với thể tích dung mơi dùng 300ml, thời gian chiết 10h 800C Dịch chiết thu đƣợc sau 27 chiết soxhlet đƣợc đuổi dung môi bếp cách thủy khoảng 10ml Sau gửi mẫu đến trung tâm đo lƣờng chát lƣợng kĩ thuật, số – Ngô Quyền để đo GC – MS Tiến hành tƣơng tự với dung môi lại diclometan etyl acetat thời gian tốt dung môi 3.3.1 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexan Kết sau đo GC – MS với dịch chiết n-hexan đƣợc thể hình 3.1 hợp chất có dịch chiết n-hexan đƣợc trình bày bảng 3.7 Hình 3.4 Sắc kí đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết n-hexan Bảng 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexan STT Thời gian lƣu Tên Cấu trúc hóa học Tỷ lệ (%) DUNG MÔI N-HEXAN 10.560 Cinnamaldehyde, (E) O H 0.13 28 O Ethanol,1-(2hydroxy-414.318 methoxyphenyl) H3C 0.11 HO O CH3 2,naphthalenemet hanol, decahydro.alpha.,.alpha.,4atrimethyl-819.468 methylene-, [2R(2.alpha.,4a.alpha ,8a.beta.)]- 0.10 Benzen, 1,2,4 triethyl 20.576 0.07 Bicyclo[3.1.1]hept ane, 2,6,6 24.148 trimethyl,(1.alpha., 2.beta.,5.alpha) Phytol CH3 CH3 H3C 0.35 H3C 30.589 H3C H3C H3C H3C OH 0.59 Gamma-tocopherol 41.392 1.21 Vitamin E 41.938 1.98 29 Campesterol 42.686 1.10 Stigmasterol 10 42.950 1.74 Beta-sito sterol 11 43.471 3.46 Lanosterol 12 44.729 0.64 Nhận xét: Trong dịch chiết n-hexan có 12 cấu tử, hợp chất chiếm tỷ lệ cao beta-sitosterol (3,46%), có hợp chất hàm lƣợng thấp Benzen, 1,2,4 triethyl (0.07%) Beta - sitosterol đƣợc biết đến chất hỗ trợ việc làm giảm cholesterol máu có tác dụng việc điều trị bệnh tuyến tiền liệt 3.3.2 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết diclometan Kết sau đo GC-MS với dịch chiết diclometan đƣợc thể hình 3.2 hợp chất có dịch chiết diclometan đƣợc trình bày bảng 3.8 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết diclometan Bảng 3.8 Thành phần hóa học dịch chiết diclometan STT Thời gian lƣu Tên Cấu trúc hóa học Tỷ lệ (%) DUNG MÔI DICLOMETAN 13 43.471 Beta-sito sterol 1.30 Nhận xét: Trong dịch chiết diclometan định danh đƣợc hợp chất betasitosterol với tỷ lệ 1,30% 3.3.3 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat Kết sau đo GC – MS với dịch chiết etyl acetat đƣợc thể hình 3.3 hợp chất có dịch chiết etyl acetat đƣợc trình bày bảng 3.9 31 Hình 3.6 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat Bảng 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết etyl acetat STT Thời gian lƣu Tên Tỷ lệ (%) Cấu trúc hóa học DUNG MÔI ETYL ACETAT CH3 Limonene 14 5.826 0.21 H3C CH2 Eucalyptol 15 5.880 0.16 O Estragole 16 CH3 7.326 2.77 H2C 32 1,2,3-propanetriol, monoacetate 17 9.127 0.20 Nhận xét: Trong dịch chiết etyl acetat có hợp chất có hoạt tính sinh học, hợp chất chiếm tỷ lệ cao estragole với 2.77%, hợp chất có hàm lƣợng thấp eucalypyol với 0.16% Trong đó, estragole hợp chất kháng khuẩn thiên nhiên, limonene có tác dụng chống ho tốt, giảm đờm, kháng khuẩn 3.4 Kết thử hoạt tính sinh học cắn chiết diệp hạ châu Tiến hành chiết soxhlet với 20g bột diệp hạ châu ngọt, dung môi chiết nhexan với thể tích dung mơi dùng 250ml, thời gian chiết 10h 800C Dịch chiết thu đƣợc sau chiết soxhlet đƣợc đuổi dung môi bếp cách thủy 800C thu đƣợc cắn Gửi cắn đến phịng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa học Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội để xác định hoạt tính sinh học cắn chiết thu đƣợc từ diệp hạ châu Trong phạm vi đề tài này, thử hoạt tính kháng sinh hoạt tính độc tế bào với dòng ung thƣ gan Hep 3.4.1 Thử hoạt tính kháng sinh Kết thử hoạt tính kháng sinh đƣợc trình bày bảng 3.10 (trích lọc phụ lục 3) Bảng 3.10 Kết thử hoạt tính kháng sinh Nhận xét: Mẫu thử khơng có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định nồng độ thử nhỏ 128 g/mg 33 3.4.2 Thử hoạt tính độc tế bào Kết thử hoạt tính độc tế bào đƣợc trình bày bảng 3.11 ( trích lọc phụ lục 4) Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính độc tế bào STT Tên mẫu Giá trị IC50 (g/ml) Dịng tế bào HepG2 Chó đẻ cƣa 57.26 Chất tham khảo Ellipticine 0.35 Nhận xét: Mẫu thử khơng có khả gây độc tế bào với dòng tế bào ung thƣ gan Hep 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu thực nghiệm cho kết nhƣ sau: - Bột diệp hạ châu có: độ ẩm 4.67%, hàm lƣợng tro 1.69%, kim loại Hg, As, Pb nằm tiêu chuẩn cho phép - Đã khảo sát thời gian xác định thời gian chiết tốt :  Dung môi n-hexan: 10h  Dung môi diclometan: 10h  Dung môi etyl acetat: 8h - Bằng phƣơng pháp GC – MS xác định đƣợc thành phần hóa học dịch chiết từ dung môi: n-hexan, diclometan, etyl acetat Dung mơi diclometan có hợp chất với hợp chất beta-sitosterol, dung mơi có nhiều hợp chất n-hexan với 12 cấu tử, cịn dung mơi etyl acetat có cấu tử Trong dung mơi nhexan diclometan có beta-sitosterol nhƣng n-hexan có hàm lƣợng cao So sánh dung môi, ta nhận thấy rằng, hoạt chất beta-sitosterol n-hexan có hàm lƣợng cao (3,46%), estragole etyl acetat (2,77%); hợp chất có hàm lƣợng thấp hợp chất có hàm lƣợng thấp Benzen, 1,2,4 triethyl (0.07%) Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để tách cấu tử có hoạt tính sinh học cáo diệp hạ châu để tìm hiểu hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bùi Xuân Vững (2010), Phân tích cơng cụ hóa học, Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng [2] Dƣợc điển Việt Nam IV, NXB Hà Nội [3] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học , Hà Nội, tr 97,98 [4] Ngô Đức Trọng, Nghiên cứu hóa học nhận dạng số nhóm chất có chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.,Euphorbiaceae) [5]PGS.TS Nguyễn Văn Đậu, Nghiên cứu hóa thực vật chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.,Euphorbiaceae) Trang web [6]http://luanvan.co/luan-van/de-tai-xay-dung-tieu-chuan-cho-duoc-lieu-cho-derang-cua-28066/ [7]http://nld.com.vn/suc-khoe/cay-cho-de-chua-benh-gan-20130323085950941.htm [8] http://thitruongduoc.vn/san-pham/-benh-gan-mat/1649/diep-ha-chau-bvp [9]http://thuocdongduoc.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/278-cay-thuoc-vi-thuoc/638-caycho-de-rang-cua.html [10] http://thuocviet.vn/products/view/2/LIVSIN-94.html [11]http://thuocviet.vn/faqs/view/70/Viem-gan-do-virus-va-thuoc-chua.html [12]http://thuvien24.com/cac-hop-chat-lignan-va-flavonoit-tu-cay-cho-de-rang-cua-phyllanthus-urinaria-l o-viet-nam-92935.html 36 [13] http://trongraulamvuon.com/cach-trong-rau/cong-dung-tri-benh-cua-cay-cho- de/ [14]http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=2597 [15]http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%B n_bi.E1.BB.87t [16]http://www.hoahocngaynay.com/vi/phat-trien-ben-vung/an-toan-hoa-chat/232kim-loai-nang-va-anh-huong-cua-no-doi-voi-con-nguoi.html [17]http://www.quangnam.gov.vn/CMSPages/BaiViet/Default.aspx?IDBaiViet=154 28 [18]http://www.thaoduoc.edu.vn/xua-tan-noi-lo-benh-lau-voi-cay-thao-duoc-diepha-chau.html [19]http://www.thegioicaythuoc.com/tri-cac-benh-nhu-lau-lo-loet-soi-mat-camcum-bang-cay-diep-ha-chau.html [20]http://www.thuocbietduoc.com.vn/hoi-dap-1-0-1178/hoi-ve-liv-94.aspx [21]http://yhocbandia.vn/hoat-dong-vien/nghien-cuu/liver-voi-viem-gan-sieu-vi-bsu-tro-giup-dang-ke-tu-y-hoc-ban-dia.html 37 PHỤ LỤC Phụ lục 1:Kết đo AAS khoa Sinh, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng Phụ lục 2: Kết đo kim loại Hg Trung tâm Khí tƣợng Thủy văn, 660 Trƣng Nữ Vƣơng, Đà Nẵng Phụ lục 3: Kết thử hoạt tính kháng sinh Phụ lục 4: Kết thử hoạt tính độc tế bào ...ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HOÁ  NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU NGỌT Ở QUẢNG NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA... chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết từ diệp hạ châu Quảng Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình chiết tách hợp chất có diệp hạ châu - Xác định thành phần hóa học, cơng... Kết xác định thành phần hóa học hợp chất cắn chiết bột diệp hạ châu 27 3.3.1 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexan 28 3.3.2 Kết xác định thành phần hóa học dịch chiết