Độ dài miễn dịch của cá tra sau khi tiêm vaccine sốc nhiệt phòng bệnh gan thận mủ

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá độ dài đáp ứng miễn dịch của cá tra sau khi tiêm vaccine bất hoạt sốc nhiệt phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra. Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ thu tại các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. E. ictaluri được nhân sinh khối sau đó được gây sốc nhiệt và sản xuất vaccine bất hoạt.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA SAU KHI TIÊM VACCINE SỐC NHIỆT PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ Lê Hồng Phước1, Võ Hồng Phượng1, Nguyễn Thị Hiền1, Ngơ Thị Bích Phượng1, Nguyễn Phạm Hồng Huy1, Chung Minh Lợi1 TĨM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá độ dài đáp ứng miễn dịch cá tra sau tiêm vaccine bất hoạt sốc nhiệt phòng bệnh Edwardsiella ictaluri gây cá tra Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ thu tỉnh thuộc Đồng sông Cửu Long E ictaluri nhân sinh khối sau gây sốc nhiệt sản xuất vaccine bất hoạt Cá tra với trọng lượng 20-25 gram gây miễn dịch hai quy trình (1) Tiêm vaccine hai lần (2) Ngâm vaccine kết hợp với tiêm Đối với quy trình tiêm vaccine hai lần cá tiêm vaccine lần với liều x109 CFU/cá tiêm vaccine lần hai cách lần thứ 14 ngày Mỗi tháng sau tiêm vaccine lần 2, cá gây nhiễm với E ictaluri liều 1,5 x 104 CFU/cá Đối với quy trình ngâm vaccine kết hợp với tiêm chuẩn bị tương tự khác quy trình cá ngâm vaccine lần với liều x108 CFU/ml 30 phút sau tiêm vaccine lần thứ hai cách lần ngâm 14 ngày, bước lại tiến hành tương tự quy trình tiêm vaccine lần Kết nghiên cứu cho thấy quy trình tiêm vaccine lần cho hiệu kéo dài thời gian miễn dịch tốt so với quy trình ngâm vaccine kết hợp với tiêm Thời gian hiệu vaccine kéo dài đến tháng với số RPS từ 40-58% Có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ chết nhóm đối chứng nhóm tiêm vaccine (p < 0,05) Từ khóa: Cá tra, vaccine, Edwarsiella ictaluri I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, ngồi việc mở rộng diện tích ni việc đa dạng đối tượng ni quan tâm đáng kể Nhiều đối tượng nuôi nghiên cứu phát triển thích ứng với vùng địa lý khác Bên cạnh đó, vấn đề giải sản phẩm đầu trở nên quan trọng định đến phát triển loài ưu tiên Đến cá tra xem đối tượng nuôi chủ lực nước tập trung chủ yếu khu vực Đồng sông Cửu Long Theo Tổng Cục Thủy Sản, tình hình ni cá tra gặp nhiều khó khăn giá thị trường tiêu thụ tháng đầu năm 2013 Trong tháng 4/2013, sản lượng cá tra An Giang ước tính đạt 18 nghìn tấn, giảm 18% so với kỳ năm 2012 Ngoài ra, dịch bệnh cá tra tránh khỏi làm ảnh hưởng phần đến sản lượng thu hoạch Bệnh gan thận mủ xem bệnh thường xuất nguy hiểm cá tra Bệnh gan thận mủ cá tra xuất lần Việt Nam vào cuối năm 1998 (Ferguson ctv., 2001) Đến vài năm sau đó, bệnh Ferguson ctv trường đại học Stirling phối hợp với trường đại học Cần Thơ nghiên cứu cho kết ban đầu vào năm 2001 với tác nhân gây bệnh vi khuẩn Bacillus sp (Feguson ctv., 2001) Đến năm 2002 nhóm nghiên cứu đính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra vi khuẩn E ictaluri (Crumlish ctv., 2002) Hiện bệnh Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường & Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản E-mail: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 93 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN gan thận mủ bệnh gây thiệt hại cá tra nuôi thương phẩm Bệnh thường xuất vào thời điểm giao mùa mưa nhiều nhiệt độ nước giảm thấp 28oC Tùy thuộc vào mức độ bệnh nặng hay nhẹ, dấu hiệu bệnh lý đặc trưng bên xuất đốm trắng với mật độ nhiều hay Ở Việt Nam, tại, chưa có loại vaccine thương mại ứng dụng cá có vài nghiên cứu vaccine phịng bệnh gan thận mủ cá tra dạng đề tài nghiên cứu thực Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản hay trường Đại Học Vaccine bất hoạt thường cho thời gian bảo hộ khoảng dài định Qua nghiên cứu cho thấy protein sốc nhiệt (heat shock protein: Hsp) làm tăng cường đáp ứng miễn dịch đối tượng thủy sản Protein sốc nhiệt hay Hsp loại protein sinh trình sốc nhiệt yếu tố khác thay đổi đột ngột yếu tố môi trường sống (pH, độ mặn, ) Theo Lindquist Craig (1988), Hsp tìm thấy hầu hết thể sinh vật Hsp chiếm từ 5-10% tổng protein tế bào bình thường tăng lên gấp 2-3 lần gặp phải yếu tố gây sốc nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ơxy nhiễm bệnh (Pockley, 2003) Ấu trùng Artemia nuôi 28°C gây sốc 37°C 30 phút 6h hồi phục cho thấy khả đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio campbellii Tỷ lệ sống tăng gấp đơi nhóm gây sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ HSP70 có vai trị bảo vệ Artemia tác nhân gây bệnh (Yeong ctv., 2007, 2008) Một nghiên cứu khác cho thấy Artemia tiếp nhận Hsp cách thụ động thông qua thức ăn cho thấy làm tăng khả kháng vi khuẩn gây bệnh (Yeong ctv., 2009) Hsp60 Hsp70 chiết xuất từ Escherichia coli có khả kích thích tăng hàm lượng kháng thể cá hồi sau tiêm Hsp70 Vì Hsp xem chất làm tăng cường hiệu 94 vaccine (Plant ctv., 2009) Mặc dù vậy, chưa có nghiên cứu ứng dụng vaccine sốc nhiệt đối tượng thủy sản Hơn nữa, nghiên cứu vaccine trước đưa ứng dụng rộng rãi việc đánh giá hiệu mức kéo dài hiệu cần thiết Từ việc biết độ dài miễn dịch thiết kế thí nghiệm liên quan đến quy trình sử dụng vaccine cho có hiệu Nghiên cứu nhằm mục đích kiểm tra độ dài đáp ứng miễn dịch cá tra E ictaluri sau tiêm vaccine bất hoạt sốc nhiệt vi khuẩn II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu: Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Gly 09M) phân lập từ cá tra bệnh thu ĐBSCL sử dụng làm nguồn nguyên liệu tạo vaccine sốc nhiệt (HS) vaccine không sốc nhiệt (NHS), cá tra (20-25g/con khỏe mạnh, không bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri) Thiết bị: Nồi lên men (10 lít), máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, máy ly tâm, tủ ấm, tủ cấy vi sinh, tủ mát 40C, tủ lạnh -20oC, -70oC, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, bể kính (80 lít), … Hóa chất môi trường: - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Brain Heart Infusion Broth (BHIB), môi trường thạch máu Blood Agar (BA) 5% máu cừu - Dung dịch formaline bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê số hóa chất thông dụng khác gồm: nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Clorine, … 2.2 Phương pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 2.2.1 Phương pháp vi ngưng kết xác định hiệu giá kháng thể Nguyên tắc: Phản ứng vi ngưng kết thực TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN nhựa 96 giếng tượng kết hợp kháng nguyên (KN ) (nồng độ tương đương 109 CFU/ml) kháng thể đặc hiệu thể dạng hạt nhìn thấy Chuẩn bị KN: Cấy vi khuẩn từ ống giữ giống sang môi trường thạch máu BA 5% 3648 28-30ºC Chọn khuẩn lạc cấy vào bình tam giác chứa sẵn 100ml môi trường BHIB, nuôi cấy lắc 28-30ºC 17-18 Đo OD bước sóng 550nm pha loãng xác định mật độ vi khuẩn Bất hoạt vi khuẩn cách trộn với dung dịch formaline 0,4% (theo thể tích) Ly tâm 7000 vịng/phút 10 phút, thu tế bào rửa lần với dung dịch đệm 1X PBS pH 7,5 Huyền phù tế bào vi khuẩn 100ml PBS để mật độ vi khuẩn khoảng 108-109 CFU/ml Vi khuẩn trước sử dụng nhuộm thuốc nhuộm Coomassive Brilliant Blue R-250 (0,1% thể tích) theo phương pháp Millesimo ctv (1996), đun dịch vi khuẩn 100ºC 10 phút để ngăn tượng tự ngưng kết vi khuẩn Pha loãng huyết thanh: Hút 50 µl dung dịch PBS vào giếng từ giếng đến 12, giếng thứ gồm 90 µl dung dịch PBS 10 µl huyết thanh, độ pha loãng huyết giếng 1:10, trộn Hút 50 µl dung dịch từ giếng chuyển qua giếng đến giếng 12 Như pha loãng bậc hai liên tiếp huyết từ độ pha loãng Phản ứng ngưng kết: Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào tất giếng Trộn hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể Ủ qua đêm 4ºC Quan sát tượng ngưng kết trực tiếp mắt hay qua kính lúp Hiệu giá huyết số nghịch đảo độ pha loãng cao mà có tượng ngưng kết Hình 3.1 Hiện tượng ngưng kết kháng nguyên – kháng thể giếng chữ U đĩa 96 giếng Ghi chú: giếng A1, A2: có phản ứng ngưng kết, tạo mạng ngưng kết bao phủ đáy giếng Giếng A3, A4: phản ứng ngưng kết yếu Giếng A5: khơng có phản ứng ngưng kết, KN lắng xuống đáy giếng Giếng B1-5: giếng đối chứng khơng có tượng ngưng kết 2.2.2 Phương pháp gây sốc vi khuẩn tạo vaccine Phương pháp gây sốc chuẩn bị gồm bước chuẩn bị sau: Bước 1: Chuẩn bị vi khuẩn gây sốc cách cấy vi khuẩn lên môi trường thạch máu ủ 28oC 36 Tiến hành chọn khuẩn lạc điển hình tăng sinh môi trường canh dinh dưỡng BHIB đến OD550 = 0,5-0,6 tiến hành gây sốc vi khuẩn Mẫu đối chứng chuẩn bị tương tự không cấy vi khuẩn Bước 2: Hai bể điều nhiệt chỉnh nhiệt độ sẵn trước tiến hành gây sốc vi khuẩn Bể gia nhiệt trì 60 – 65ºC, bể điều chỉnh ổn nhiệt 41ºC Khi hai bể ổn định nhiệt độ tiến hành gây sốc vi khuẩn cách cho bình tam giác chứa dịch vi khuẩn bình tam giác đối chứng có gắn nhiệt kế vào bể điều nhiệt (60 – 65ºC), lắc đồng thời quan sát nhiệt kế ghi nhận đến lúc nhiệt độ đạt 41ºC chuyển bình tam giác sang bể điều nhiệt thứ (41ºC) Trong bể điều nhiệt thứ lắc bình tam giác trì nhiệt độ 41ºC thời gian 30 phút Sau hạ nhiệt xuống cách chuyển bình tam giác vào bể nước lạnh 4ºC TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 95 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Vi khuẩn sau sốc nhiệt giết formaline (Merck) cho đạt nồng độ cuối 0,4%, để tủ lạnh 4ºC qua đêm để bất hoạt vi khuẩn Kiểm tra vi khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn cách hút 100 µl dịch vi khuẩn trãi đĩa thạch BA, ủ 30ºC 48 (lặp lại lần) Nếu khơng có vi khuẩn mọc đĩa thạch chứng tỏ toàn vi khuẩn bất hoạt Dịch vi khuẩn dùng trực tiếp làm vaccine Vaccine bất hoạt bảo quản chai nhựa 20 ml 4ºC 2.2.3 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm a Cá thí nghiệm điều kiện ni: Cá tra giống khỏe trọng lượng tương đối khoảng 20-25 g/con mua từ trại sản xuất giống chuyển ni phịng thí nghiệm ướt Viện NCNTTSII đến tiến hành thí nghiệm Cá ni bể composite m3 30 ngày Sau đó, cá phân bố ngẫu nhiên vào bể kính 100 L (20-30 cá/bể) nuôi tuần Sử dụng trực tiếp nguồn nước sinh hoạt làm nước nuôi cá, nhiệt độ nước từ 28-30°C Hệ thống ni bể kính dạng bán tuần hoàn, nước lọc liên tục thay 50% nước hàng tuần Sử dụng thức ăn viên thương mại (GB 628, hạt có đường kính mm, Grobest & I-Mei Industrial, Đồng Nai) cho cá ăn lần ngày vào lúc sáng, 12 trưa chiều Trước tiến hành thí nghiệm cá thu mẫu kiểm tra để đảm bảo không bị nhiễm E ictaluri trước tiến hành gây nhiễm b Chuẩn bị vi khuẩn Vi khuẩn lấy từ ống giữ giống (-700C) cấy môi trường thạch máu (BA) ủ nhiệt độ 280C thời gian 24 sau tiếp tục đưa vi khuẩn vào môi trường BHIB 96 (pH 7, nhiệt độ 280C ni lắc 200 vịng/phút) tăng sinh 24 giờ, đo mật độ OD xác định mật độ tế bào trước công vào cá tra với liều 0,2 ml dịch vi khuẩn/cá c Gây bệnh thực nghiệm phương pháp tiêm Gây mê cá thí nghiệm EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml EGME lít nước) 3-5 phút Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm mm dùng cho cá 10-40 g để đảm bảo an tồn cho cá thí nghiệm Mũi kim tiêm vào xoang bụng cá vị trí hai vây bụng cá tra chếch góc 45° Thể tích tiêm vào cá 0,2 ml với liều 1,5 x 104 CFU/cá 2.2.4 Phương pháp đánh giá hiệu lực vaccine Đánh giá hiệu lực vaccine qua giá trị RPS relative percent survival (tỷ lệ sống tương đối) theo công thức Amend (1981): Tỷ lệ % số cá vaccine chết RPS (%) = (1- -) x 100 Tỷ lệ % số cá đối chứng chết 2.2.5 Bố trí thí nghiệm quy trình tiêm vaccine lần Cá tiên vaccine lần (ngày thứ ngày thứ 14 với liều x 109 CFU/cá)) Cứ tháng sau tiêm vaccine lần tiến hành gây bệnh thực nghiệm để đánh giá tỷ lệ chết Thí nghiệm kéo dài tháng với nghiệm thức vaccine heat shock (HS) Non-heat shock (NHS) Ngoài việc ghi nhận tỷ lệ chết theo dõi diễn biến hàm lượng kháng thể huyết cá tiêm vaccine HS NHS tháng qua phản ứng vi ngưng kết Mẫu huyết thu trước tiêm vaccine, sau tiêm vaccine lần trước công vi khuẩn nghiệm thức TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Bảng Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch cá tra với quy trình tiêm vaccine lần Số lượng Tổng số cá Vaccin HS Nghiệm thức 18 bể x 30 con/bể 540 cá Vaccine NHS 18 bể x 30 con/bể 540 cá Đối chứng 18bể x 30 con/bể 540 cá III KẾT QUẢ 3.1 Kết thử nghiệm quy trình tiêm vaccine lần Kết theo dõi tỷ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm tháng 1, cho thấy 2.2.6 Bố trí thí nghiệm quy trình ngâm kết hợp với tiêm vaccine: nghiệm thức tiêm vaccine có tỷ lệ chết Tương tự bố trí thí nghiệm cho quy trình tiêm vaccine lần, thí nghiệm theo dõi thời gian tháng Cách bố trí theo dõi thí nghiệm tương tự trên, khác ngâm vaccine kết hợp với tiêm Tất cá thí nghiệm đựợc ngâm vaccine HS NHS ngày thứ với mật độ 5x108 CFU/ ml có sục khí Sau thời gian 30 phút, cá chuyển sang bể composite ni theo nghiệm thức thí nghiệm Bể đối chứng ngâm với môi trường BHIB chuyển sang bể sau 30 phút nghiệm thức Sau thời gian 14 ngày, lấy mẫu máu cá cho phản ứng vi ngưng kết tiếp tục tiêm vaccine HS, NHS với mật độ 3x109 CFU/cá Cứ tháng sau tiêm vaccine lần cá lấy máu 10 con/ nghiệm thức công vi khuẩn với liều 1,5x104 CFU/ml khoảng 82-92% (đồ thị 4.1) Tỷ lệ chết khoảng 33-48% Nhóm đối chứng tỷ lệ chết có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm vaccine cho thấy hiệu mang lại từ việc tiêm vaccine cho cá Ở tháng thứ 4, tỷ lệ chết mức < 40% nhóm cá tiêm vaccine Tuy nhiên tháng thứ thứ tỷ lệ chết cá tăng cao đạt mức gần 60%, khơng khác biệt nhiều so với nhóm cá đối chứng Kết theo dõi số RPS (%) bảng 4.1 cho thấy từ tháng thứ đến tháng thứ hai nghiệm thức HS NHS > 50% khơng có khác biệt đáng kể nghiệm thức Tuy nhiên tỷ lệ RPS(%) giảm dần có tỷ lệ bảo hộ thấp tháng thứ (32,09% HS 30,86% NHS) Bảng Tỷ lệ chết cộng dồn tỷ lệ RPS (%) Nghiệm thức HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng Số cá chết cộng dồn ngày sau tiêm ngày 11 52 33 16 27 21 26 30 32 75 22 29 47 ngày 25 30 74 17 22 71 23 34 66 32 35 55 54 56 87 46 46 66 ngày 29 33 74 28 34 78 37 41 81 40 38 70 56 59 87 50 54 78 14 ngày 31 34 74 37 39 83 40 43 83 41 43 80 58 60 87 55 56 81 Tỷ lệ chết cộng dồn trung bình (%) 34,44 ± 6,93 37,78 ± 10,7 82,22 ± 6,9 41,11 ± 1,92 43,33 ± 8,81 92,22 ± 1,9 44,44 ± 7,7 47,78 ± 7,7 92,22 ± 7,7 45,56 ± 1,9 47,78 ± 5,09 88,89 ± 8,3 64,44 ± 5,09 66,67 ± 3,33 96,67 ± 3,33 61,11 ± 5,09 62,22 ± 3,85 90 ± 3,33 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 11/2013 RPS (%) 58,10 54,05 55,42 53,01 51,8 48,19 48,75 46,25 33,33 31,03 32,09 30,86 97 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Kết log2 hiệu giá kháng thể bảng 4.2 cho thấy hiệu giá kháng thể hai loại vaccine HS NHS có giá trị giảm dần 1-6 tháng Trong tháng tháng hiệu giá kháng thể cao từ 8,12-8,62 vaccine HS 8,129,52 với vaccine NHS Hiệu giá kháng thể tháng có khác biệt đáng kể so với nghiệm thức cịn lại Ngồi ra, với nghiệm thức đối chứng kiểm tra trước, sau 14 ngày tiêm vaccine lần trước cơng vi khuẩn có giá trị chứng tỏ cá trước thí nghiệm khơng bị nhiễm E ictaluri Bảng Hiệu giá kháng thể xác định phương pháp vi ngưng kết Tháng Nghiệm thức Trung bình Log2 (hiệu giá kháng thể) HS (3 x 109 CFU/cá) 8,12 ± 0,63 NHS (3 x 109 CFU/cá) 9,52 ± 1,22 HS (3 x 10 CFU/cá) 8,62 ± 0,48 NHS (3 x 10 CFU/cá) 8,12 ± 0,78 HS (3 x 109 CFU/cá) 6,72 ± 1,64 NHS (3 x 109 CFU/cá) 6,72 ± 1,77 HS (3 x 10 CFU/cá) 5,52 ± 1,13 NHS (3 x 10 CFU/cá) 5,32 ± 1,24 HS (3 x 109 CFU/cá) 4,62 ± 1,7 NHS (3 x 109 CFU/cá) 3,72 ± 2,77 HS (3 x 10 CFU/cá) 4,88 ± 1,99 NHS (3 x 10 CFU/cá) 5,82 ± 1,5 9 9 9 Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm với E ictaluri cá tra tiêm vaccine 1, tháng 98 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm với E ictaluri cá tra tiêm vaccine 4, tháng 3.2 Kết thử nghiệm quy trình ngâm kết hợp với tiêm vaccine dồn bắt đầu tăng dần tử tháng thứ đạt giá trị 50% hai nghiệm thức Kết tỷ lệ chết thí nghiệm từ 1–3 Kết tỷ lệ chết vaccine HS NHS tháng vaccine HS NHS thể đồ thị 4.3 cho thấy với phương pháp kết hợp ngâm tiêm vaccine hiệu nghiệm thức tháng với tỷ lệ chết trung bình vaccine HS dao động khoảng 4044% NHS 34- 49% Tuy nhiên, từ tháng thứ trở đồ thị tỷ lệ chết tăng cao gần so tử - tháng thể đồ thị 4.4 với nhóm cá đối chứng (đồ thị 4.4) Tỷ lệ RPS 14% Từ kết thí nghiệm cho thấy quy trình vaccine HS tháng thứ thứ 50%, RPS NHS tháng thứ đạt 56,94% tháng thứ đạt 46,98% Tuy nhiên, xử lý số liệu thống kê khơng thấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê vaccine ngâm kết hợp với tiêm thấy hiệu tháng HS NHS thời điểm Tỷ lệ chết cộng so với quy trình tiêm vaccine lần Như tỷ lệ chết từ tháng thứ đến tháng thứ tăng đáng kể so với tháng 1- 3, tỷ lệ chết gần với tỷ lệ chết nhóm đối chứng Tỷ lệ chết cộng dồn nghiệm thức HS NHS khoảng 74 - 93%, hệ số RPS nhỏ thứ Từ tháng thứ trở hiệu vaccine giảm dần điều cho thấy khả kéo dài thời gian miễn dịch quy trình thấp TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 99 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bảng Tỷ lệ chết cộng dồn tỷ lệ RPS (%) quy trình ngâm kết hợp với tiêm Nghiệm thức HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng HS tháng NHS tháng Đối chứng Số cá chết cộng dồn ngày sau tiêm ngày 14 ngày 0 48 18 0 36 33 67 36 45 46 10 52 26 30 79 29 31 61 55 59 82 62 63 75 70 74 77 21 25 70 38 41 81 43 46 70 75 80 86 64 71 76 80 80 81 35 31 72 40 44 83 47 48 71 77 84 86 67 74 78 80 80 81 Kết log2 hiệu giá kháng thể bảng 4.4 cho thấy hiệu giá kháng thể hai loại vaccine HS NHS sau 14 ngày ngâm có giá trị thấp so với quy trình tiêm vaccine lần, có giá trị HS 6,92 ± 0,51 NHS 6,66 ± 0,48 Tương tự quy trình lần tiêm hiệu giá kháng thể Tỷ lệ chết cộng dồn trung bình (%) RPS (%) 40 ± 0,33 34,44 ± 5,09 80 ± 6,6 44,44 ± 5,09 48,88 ± 3,84 92,22 ± 1,92 52,22 ± 5,09 53,33 ± 3,33 78,88 ± 5,09 85,55 ± 7,69 93,33 ± 6,67 95,55 ± 3,84 74,44 ± 6,9 82,22 ± 16,4 86,87 ± 8,88 88,88 ± 10,18 88,88 ± 6,9 90 ± 8,8 50 56,94 51,8 46,98 33,8 32,39 10,46 2,3 14,1 5,12 1,23 1,23 giảm dần giảm dần thời điểm 1-6 tháng Trong tháng tháng thứ hiệu giá kháng thể tương đối cao trung bình 8,7-10,22 vaccine HS 9,1-9,8 với vaccine NHS Giá trị hiệu giá kháng thể tháng có khác biệt đáng kể so với nghiệm thức lại Bảng Hiệu giá kháng thể xác định phương pháp vi ngưng kết (quy trình ngâm kết hợp với tiêm) Nghiệm thức Trung bình Log2 (hiệu giá kháng thể) 14 ngày sau ngâm vaccine lần HS (3 x 109 CFU/cá) tháng Trước công vi khuẩn 10,22 ± 1,1 NHS (3 x 10 CFU/cá) tháng 9,8 ± 1,4 HS (3 x 109 CFU/cá) tháng 8,7 ± 1,34 NHS (3 x 109 CFU/cá) tháng 9,1 ± 0,78 HS (3 x 109 CFU/cá) tháng 5,55 ± 2,9 NHS (3 x 109 CFU/cá) tháng HS (3 x 109 CFU/cá) tháng NHS (3 x 109 CFU/cá) tháng HS: 6,92 ± 0,51 NHS: 6,66 ± 0,48 ĐC: 0,0 6,08 ± 2,2 6,6 ± 1,25 5,4 ± 2,2 HS (3 x 109 CFU/cá) tháng 5,8 ± 0,84 NHS (3 x 109 CFU/cá) tháng 5,9 ± 1,26 HS (3 x 10 CFU/cá) tháng 5,5 ± 2,2 NHS (3 x 109 CFU/cá) tháng 5,08 ± 2,2 100 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm với E ictaluri cá tra ngâm tiêm vaccine 1, tháng Đồ thị Tỷ lệ chết cộng dồn sau gây nhiễm với E ictaluri cá tra ngâm tiêm vaccine 4, tháng IV THẢO LUẬN Từ kết thí nghiệm cho thấy quy trình tiêm vaccine lần cho thời gian kéo dài đáp ứng miễn dịch dài so với quy trình ngâm kết hợp với tiêm Có lẽ tiêm vaccine cá thể cá nhận lượng vaccine trực tiếp đồng tiêm ngâm việc hấp thụ vaccine thơng qua da, mang trạng thái thể cá lúc ngâm vaccine Chính vaccine thương mại cá hồi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 101 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN có dạng vaccine tiêm cho cá thể nhiều thời gian tiêm vaccine mang lại hiệu cao Đối với quy trình tiêm vaccine lần cho thấy hiệu kéo dài thời gian miễn dịch đến tháng Theo Nguyễn Hữu Thịnh ctv (2009) nghiên cứu nhiều nghiệm thức cấp vaccine khác gây nhiễm sau thời gian thí nghiệm tháng cho thấy nghiệm thức cho ăn ngâm vaccine lần cho tỷ lệ chết cao (80-82%) gần nhóm đối chứng khơng tiêm vaccine (90%) Điều giải thích hiệu vaccine kéo dài khoảng thời gian định Nghiên cứu loại vaccine thương mại (AquaVac®ERM AquaVac®RELERATM) phịng bệnh Yersinia ruckeri gây cá hồi Deshmukh ctv (2012) cho thấy RPS sau tháng vaccine với AquaVac®ERM 13,529,5, vaccine AquaVac®RELERATM 42,5-52 Nghiên cứu vaccine tái tổ hợp phòng bệnh Aeromonas hydrophila gây cá chép Poobalance ctv (2010) thực thí nghiệm tiêm vaccine cho cá, sau 35 ngày tiến hành thí nghiệm gây nhiễm với chủng Aeromonas hydrophila có độc lực cao Kết RPS từ 56-87% cho thấy loại vaccine thành công sử dụng cá chép Kết thử nghiệm vaccine nhược độc phòng bệnh Flavobacterium columnare gây cá nheo Mỹ cho thấy RPS từ 74-94% (Shoemaker ctv., 2011) Nghiên cứu khác thực Maiti ctv (2011) Nhóm tác giả nghiên cứu vaccine tái tổ hợp protein màng phòng bệnh Edwardsiella tarda gây bệnh cá chép Kết sau gây bệnh thực nghiệm cho thấy RPS 54,3% Nghiên cứu Nguyễn Hữu Thịnh ctv (2009) với nhiều công thức vaccine khác kết hợp vaccine cách ngâm cho ăn để phòng bệnh gan thận mủ Edwardsiella tarda gây cá tra cho số RPS = 47% Đây nghiệm thức cho thấy có hiệu so với nghiệm thức 102 khác Trong nghiên cứu nhóm tác giả không thu mẫu máu xác định hiệu giá kháng thể mà so sánh nghiệm thức vaccine thông qua tỷ lệ chết Ở ngày 48 thí nghiệm, tiến hành gây nhiễm cá tra với E ictaluri kết cho thấy tỷ lệ chết thấp nhóm ngâm kết hợp với cho ăn 42%, nhóm ngâm vaccine lần (65%) nhóm cho ăn vaccine có tỷ lệ chết 74% Chỉ số RPS nhóm nghiệm thức 52, 25 15 Từ kết nghiên cứu cho thấy RPS cao hay thấp tùy thuộc vào loại vaccine sử dụng biến động từ 40-90% Nhìn chung, RPS biến động theo đối tượng nghiên cứu, chất vaccine, tác nhân gây bệnh khác kiểu đưa vaccine vào thể cá Theo Phạm Công Thành (2010) cá gây nhiễm lần hiệu giá kháng thể giảm đáng kể từ tháng thứ sau gây nhiễm với vi khuẩn Trong nghiên cứu này, hiệu giá kháng thể giảm theo thời gian sau tiêm vaccine mà mức cao có khác biệt có ý nghĩa so với cá đối chứng không tiêm vaccine Log2 hiệu giá kháng thể sau gây nhiễm với E ictaluri lần thứ đạt cao mức 5,1 sau 40 ngày, hiệu giá kháng thể giảm dần gần nhóm đối chứng sau 90 ngày thí nghiệm Kết nghiên cứu nhóm tác giả chưa thấy mối liên hệ chặt chẽ hiệu giá kháng thể RPS Nghiên cứu khả kích thích miễn dịch cá tra đối chủng E ictaluri mang gen chondroitinase đột biến cách ngâm, Lê Thượng Khởi (2012) tìm thấy hiệu giá kháng thể bắt đầu tăng vào tuần thứ tuần thứ Tuy nhiên cao dao động mức 4-5 Sự khác biệt so với nghiên cứu chế hấp thu vaccine cách ngâm tiêm khác dẫn đến khả kích thích sinh miễn dịch khác TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Trong nghiên cứu chúng tơi thử nghiệm quy trình (1) Tiêm vaccine lần (2) Ngâm vaccine kết hợp với tiêm Các nghiên cứu vaccine cá thực với nhiều quy trình cách đưa vaccine vào thể cá khác Ví dụ theo nghiên cứu Nguyễn Hữu Thịnh ctv (2009) chọn phương pháp ngâm kết hợp với cho ăn thức ăn có vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ cá tra Shoemaker ctv (2011) thử nghiệm vaccine phòng bệnh Flavobacterium columnare gây cá nheo Mỹ cách ngâm vaccine nhược độc Poobalane ctv (2010) thử nghiệm vaccine cá chép cách tiêm vaccine lần sau cơng cường độc đánh giá hiệu vaccine Nghiên cứu khác Deshmukh (2012) cá hồi phòng bệnh Yersinia ruckeri ngâm vaccine Pridgeon ctv (2011) thử nghiệm vaccine nhược độc phòng bệnh Edwardsiella ictaluri gây cá tra phương pháp ngâm tiêm vaccine lần V KẾT LUẬN Vaccine bất hoạt sốc nhiệt protein có khả kích thích miễn dịch bảo vệ cho cá Quy trình tiêm vaccine lần cho thấy hiệu tốt so với quy trình ngâm kết hợp với tiêm; Độ dài miễn dịch cá tra sau tiêm hai lần vaccine bất hoạt sốc nhiệt protein phòng bệnh gan thận mủ cá tra kéo dài tháng, log2 hiệu giá kháng thể khoảng thời gian dao động từ 5,52 đến 9,52; Quy trình ngâm kết hợp với tiêm cho hiệu tháng thứ tháng thứ sau tiêm vaccine; Kết nghiên cứu cho thấy chưa có khác biệt có ý nghĩa thống kê hiệu vaccine sốc nhiệt so với vaccine không sốc nhiệt thực tế từ kết đợt cho thấy có vài trường hợp tỷ lệ chết giảm 3-10% nhóm sốc nhiệt so với nhóm khơng sốc nhiệt TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thượng Khởi, 2012 Xác định khả kích thích miễn dịch cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) chủng Edwardsiella ictaluri mang gen chondroitinase đột biến Luận văn Cao học Trường Đại Học Cần Thơ Phạm Công Thành, 2010 Khảo sát đáp ứng miễn dịch cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Luận văn Cao học trường Đại Học Nông Nông Tp.HCM Crumlish, M., Dung, T., Turnbull, J., Ngoc, N and Ferguson, H., 2002 Identification of E ictaruli from the diseased freshwater catfish Pangasius hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 25:733736 Deshmukha, S., Raidaa, M.K., Dalsgaardb, I., Chettria, J.K., Kaniaa, P.W., Buchmanna, K., 2012 Comparative protection of two different commercial vaccines against Yersinia ruckeri serotype O1 and biotype in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Veterinary Immunology and Immunopathology 145: 379– 385 Ferguson, H W., Turnbull, J F., Shinn, A., Thompson, K., Dung, T T and Crumlish M., 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 24:509-513 Lindquist, S and Craig, E A., 1988 The heat shock proteins Annual Review Genetic 22: 631-637 Maiti, B., Shetty, M., Shekar, M., Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2011 Recombinant outer membrane protein A (OmpA) of Edwardsiella tarda, potential vaccine candidate for fish, common carp Microbiological Research 167: 1-7 Plant, J., 2009 A mutation in Thermosensitive Male Sterile 1, encoding a heat shock protein with DnaJ and PDI domains, leads to thermosensitive gametophytic male sterility in Arabidopsis Mar 57(5): 870-82 Pockley, A G., 2003 Heat shock proteins as regulators of the immune response Lancet 362: 469-476 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 103 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Pridgeon, J.W., Klesius, P.H., 2011 Development of a novobiocin-resistant Edwardsiella ictaluri as a novel vaccine in channel catfish (Ictalurus punctatus) Vaccine 29: 5631– 5637 Poobalanea, S., Thompsona, K.D., Ardób, L., Verjanc, N., Hanc, H-J., Jeney, G., Hironoc, I., Aokic, T., Adamsa, A., 2010 Production and efficacy of an Aeromonas hydrophila recombinant S-layer protein vaccine for fish Vaccine 28: 3540–3547 mortality caused by Edwardsiella ictaluri Fish & Shellfish Immunology 27: 773–776 Yeong, Y S., Van Damme, E J M., Sorgeloos, P., and Bossier, P., 2007 Non-lethal heat shock protect gnotobiotic Artemia franciscana larvae against virulent Vibrios Fish & Shellfish Immunology 22: 318-326 Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Drennan, J.D., Evans, J.J., 2011 Efficacy of a modified live Flavobacterium columnare vaccine in fish Fish & Shellfish Immunology 30: 304-308 Yeong, Y S., Pineda, C., MacRae, T H., Sorgeloos, P and Bossier, P., 2008 Exposure of gnotobiotic Artemia franciscana larvae to abiotic stress promotes heat shock protein 70 synthesis and entăngces resistance to pathogenic Vibrio campbellii Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66 Thinh, N.H., Kuob, T.Y., Hung, L.T., Loc, T.H., Chen, S.C., Evensen, O., Schuurman, H.J., 2009 Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasianodon hypophthalmus) confers protection against Yeong, Y S., Dhaene, T., Defoirdt, T., Boon, N., MacRae, T H., Sorgeloos, P and Bossier, P., 2009 Ingestion of bacteria overproducing DnaK attenuates Vibrio infection of Artemia franciscana larvae Cell Stress Chaperones 14: 603-609 104 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 ... kết hợp với tiêm; Độ dài miễn dịch cá tra sau tiêm hai lần vaccine bất hoạt sốc nhiệt protein phòng bệnh gan thận mủ cá tra kéo dài tháng, log2 hiệu giá kháng thể khoảng thời gian dao động từ 5,52... nhược độc phòng bệnh Edwardsiella ictaluri gây cá tra phương pháp ngâm tiêm vaccine lần V KẾT LUẬN Vaccine bất hoạt sốc nhiệt protein có khả kích thích miễn dịch bảo vệ cho cá Quy trình tiêm vaccine. .. tiêm vaccine lần cho thời gian kéo dài đáp ứng miễn dịch dài so với quy trình ngâm kết hợp với tiêm Có lẽ tiêm vaccine cá thể cá nhận lượng vaccine trực tiếp đồng tiêm cịn ngâm việc hấp thụ vaccine