Bài thảo luận: Thử nghiệm vắcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh docx

Bài thảo luận: Thử nghiệm vắcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh Kết quả đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin đối với cá tra nuôi thươngphẩm cho thấy vắcxin ALPHAJECT®Panga 1 là an toàn, việc tiêm vắcxin không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cá, đồng thời tiêm vắcxin vào xoang bụng cá đã kích thích hình thành miễn dịch đặc hiệu chống vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bảo hộ được cá khi bệnh xảy ra. Cho đến nay, kháng sinh vẫn là biện pháp được áp dụng nhiều nhất ở Việt Nam để đi ều trị bệnh do vi khuẩn. Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, không đúng cách có thể dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Hơn nữa, dư lượng kháng sinh còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người. Theo nghiên cứu của Dung và CTV, hơn 70% các chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra đã kháng với trimethoprim, oxytetracycline và streptomycin. Nhóm quinolon như fumequin, oxolinic acid và enrofoxacin cũng đã giảm tác dụng (Dung et al., 2008, 2010). Việc ứng dụ ng vắcxin ngày càng rộng ở các quốc gia đã giảm đáng kể lượng kháng sinh để điều trị bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản, thậm chí một số quốc gia hầu như không còn cần đến kháng sinh nữa (Sommerset et al., 2005). Hiện nay, trên thế giới đã có khoảng 36 loại vắcxin phòng bệnh do vi khuẩn và 2 loại vắcxin phòng bệnh do virút được sử dụng rộng rãi cho nhiều loài cá nuôi. Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ “Bacillus Necrosis Pangasius” (BNP) là tác nhân nguy hiểm, gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho cá tra nuôi công nghiệp ở Việt Nam (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Vi khuẩn E. ictaluri có dạng hình que ngắn, Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae, là loại vi khuẩn đặc thù gây bệnh trên cá nheo nuôi công nghiệp, lần đầu tiên phân lập từ cá nheo Mỹ (Ictalurus furcatus) gây bệnh nhiễm trùng máu “Enteric Septicemia of Catfsh” (ESC), cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan và một số loài cá nheo khác (Inglis et al., 1993). Tuy nhiên, ở Việt Nam, đến nay vẫn chưa có vắcxin phòng bệnh cho cá, ngay cả cá nuôi công nghiệp với sản lượng cao như cá tra ở Đồng b ằng sông Cửu Long. Chính vì thế, nỗ lực tìm ra vắcxin phòng bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra là hết sức cần thiết nhằm giảm tỉ lệ cá chết, từ đó nâng cao thu nhậpchongườinuôi, góp phần đảm bảo VSATTP, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, nâng cao giá trị hình ảnh cá tra Việt Nam trên thị trường thế giới, hướng đến một nền công nghiệp cá tra phát triển bền vững. Từ các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về tính an toàn và tính hiệu quả của vắcxin ALPHAJECT® Panga 1, Cục Thú Y Bộ NN&PTNT đã đồng ý để Công ty PHARMAQ AS và Bayer Vietnam phối hợp với trường Đại học Cần Thơ triển khai thử nghiệm sử dụng vắcxin cho cá nuôi trong ao thương phẩm để đ ánh giá tác dụng thực địa của vắcxin ALPHAJECT® Panga 1 phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU a) Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện trên 3 ao ở 3 tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre, với tổng số 360.991 cá giống, liều tiêm 0,05 ml vắcxin ALPHAJECT® Panga 1/cá (Hình 2.1) và 358.636 cá đối chứng. Cá có trọng lượng 28-58g, sau khi tiêm bố trí nuôi hai nhóm cá riêng rẽ trong cùng 1 ao nuôi và theo dõi liên tục 170 ngày. Ghi chép hằng ngày các chỉ tiêu môi trường, tỷ lệ cá chết và các biểu hiện bấ t thường của cá. b) Đánh giá tính an toàn của vắcxin Sau khi tiêm vắcxin, theo dõi vớt đếm cá chết mỗi ngày 2 lần. Số cá chết trong 21 ngày đầu trong mỗi nhóm cá là tiêu chí so sánh để đánh giá tính an toàn của vắcxin - Theo dõi tăng trưởng của cá: Thu mẫu tối thiểu 30 con trong mỗi nhóm cá tiêm vắcxin và đối chứng. Bắt cá ngẫu nhiên bằng vợt hoặc chài sau 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 110, 140 và 170 ngày từ khi tiêm vắcxin. Mẫu được gây mê và cân đo. - Quan sát phản ứng của cơ thể cá bằng mắ t thường: Thu mẫu ngẫu nhiên 30 cá thể sau 60, 110 và 170 ngày từ khi tiêm để mổ, quan sát và đánh giá các phản ứng trong cơ thể cá tra với vắcxin bằng mắt thường. Ghi nhận các phản ứng kết dính các cơ quan nội tạng với nhau hoặc với thành bụng, sự hình thành sắc tố melanin trong xoang bụng và thành bụng, dư lượng vắcxin (ở dạng tự do và ở dạng hạt). - Quan sát sư thay đôi cấu trúc mô: Để đánh giá phả n ứng của cơ thể cá với vắcxin ở mức độ tế bào, sau khi tiêm vắcxin 5,10, 20 và 60, 110, 170 ngày; thu khoảng 10 mẫu mô trong mỗi lô thí nghiệm, bao gồm tim, gan, thận, lách, màng treo ruột, một phần da và mô ngay vị trí tiêm, cố định mẫu trong formaline 10%. Các mẫu này sau đó được xử lý, cắt, nhuộm, phân tích tại Đại học Khoa học Thú y, Na Uy và trường Đại học Cần Thơ. Phương pháp mô học bao gồm: nhuộm Hematoxyline – Eosin (Ferguson 2006) và nhuộm hóa mô miễn dịch (Evensen & Olesen 1997). c) Đánh giá tính hiệu quả của vắcxin Xác định hiệu giá kháng thể trong máu cá Ngoài việc thu mẫu máu xác định kháng thể cá trước khi tiêm vắcxin, còn lấy mẫu máu định kỳ với kho ảng 20 cá thể trong mỗi nhóm tại các thời điểm 10, 20, 30, 40, 50, 80, 110, 140 và 170 ngày sau khi tiêm vắcxin. Phương pháp vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể trên đĩa 96 giếng của Roberson (1990). Tỉ lệ chết tich luy do E. ictaluri Thu mẫu cá và xác định nguyên nhân gây chết: Khi cá có các dấu hiệu bệnh hoặc cá chết tăng bất thường trong ao thí nghiệm, tiến hành lấy mẫu vi khuẩn từ ít nhất 20 con có triệu chứng lâm sàng và 20 con còn khỏe trong mỗi nhóm thí nghiệm để phân tích nguyên nhân. Cá bệnh do vi khuẩn E. ictaluri khi trên gan, thận, lách có những đốm mủ màu trắng đặc trưng và phân lập thấy có sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri. Cá được lấy mẫu vi khuẩn (ở gan, thận và tỳ tạng) cấy trên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) và ủ ở 28oC trong 24 - 48 giờ. Sau khi tách ròng (thuần), vi khuẩn được định danh theo Ferichs and Millar (1993). Việc thu mẫu vi khuẩn và ký sinh trùng định kỳ cũng được thực hiện thông qua những đợt thu mẫu cá đánh giá tính an toàn của vắcxin vào các thời điểm 60, 110 và 170 ngày sau khi tiêm vắ cxin. Cách tính tỉ lệ chết của cá Tỉ lệ chết được ghi nhận hằng ngày. Số liệu trong suốt giai đoạn xảy ra bệnh do E. ictaluri được xử lý thống kê và tính hệ số bảo hộ RPS (Relative Percentage Survival). Tỉ lệ cá chết tích lũy ở các nhóm cá trong thời gian bộc phát bệnh do E. ictaluri được ghi nhận bằng cách mổ tất cả cá chết để quan sát sự hiện diện của hạt vắcxin và phân biệt cá thu ộc nhóm vắcxin hay đối chứng. Hệ số bảo hộ RPS trong giai đoạn xảy ra bệnh do vi khuẩn E. ictaluri được tính theo công thức: RSP = (1-(A/B)) x 100 A: Phần trăm cá chết ở nhóm vắcxin do E. ictaluri B: Phần trăm cá chết ở nhóm đối chứng do E. Ictaluri Hình 3.2: (A) Vắc xin dạng hạt tồn lưu trong xoang bụng cá; (B) Túi vắc xin trong màng treo xoang nội quan (mũi tên) (H&E)(100X) Xử lý số liệu Tương quan chiều dài, trọng lượng, dư lượng vắcxin dạng hạt trong thí nghiệm an toàn được xử lý thống kê bằng các chương trình InStat for windows (version 3.06), T-test, ANOVA một nhân tố với P = 0,05, Mann-Whiney test và Kruskall-Wallis test. Sự khác biệt về tỷ lệ chết và định lượng kháng thể trong huyết thanh giữa các nhóm cá tiêm vắcxin và nhóm không tiêm vắcxin được xử lý bằng Chi-square test. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tính an toàn Tỷ lệ chết tich lũy trong 21 ngày sau khi tiêm văcxin Tỉ lệ chết tích lũy sau 21 ngày tiêm vắcxin từ 0,7 – 3,0% và không khác biệt giữa nhóm cá tiêm vắcxin và nhóm đối chứng. Theo một số điều tra từ người nuôi, tỉ lệ chết sau khi vận chuyển và thả giống vào ao nuôi thương phẩm dao động từ 2 – 5%. Số liệu khảo sát từ 89 trại nuôi khác nhau trong khu vực Đồng B ằng Sông Cửu Long cũng cho thấy tỉ lệ chết trong 7 ngày đầu sau khi thả giống là khoảng 7% (Phan et al., 2009). Như vậy, tỉ lệ chết ở 3 trại thí nghiệm sau khi vận chuyển và tiêm vắcxin là thấp. Nói cách khác, tiêm vắcxin không làm tăng đột biến tỷ lệ chết tích lũy của cá. Tăng trưởng của cá thí nghiệm Mức độ tăng trưởng của cá ở các ao thí nghiệm khác nhau tùy theo chế độ cho ăn, chă m sóc và quản lý. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa về chiều dài và trọng lượng giữa nhóm tiêm vắcxin và nhóm đối chứng các điểm thí nghiệm (Hình 3.1). Quan sát bằng mắt thường Quan sát thấy vắcxin dạng hạt phân bố ở khắp các cơ quan nội tạng, tập trung nhiều nhất ở vùng 2 (gần vị trí tiêm) của xoang bụng cá và giảm dần theo thời gian. Không hình thành sắc tố melanin trong xoang bụng cá. Rất ít kết dính cơ quan nội tạng với thành bụng, chỉ quan sát thấy ở 11 trên tổng số 450 mẫu (2,44%) cá vắcxin ở mức độ nhẹ. Như vậy, so với một số loài cá khác, độ dính ở cá tra có tỉ lệ nhỏ và ở mức độ thấp. Quan sát ở mức tế bào Quan sát ở mức tế bào không có biểu hiện khác thường trên các nội quan như tim, gan, thận, lách và da giữa cá tiêm vắcxin và đối chứng, nhưng có hình thành các u hạt (hạt v ắcxin) trên màng treo ruột cùng với sự tập trung các tế bào lympho, không hình thành melanin trong tổ chức cơ quan nội tạng của cá tiêm vắcxin (Hình 3.2). Tính hiệu quả của vắcxin Kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri Kháng thể của cá trước khi tiêm vắcxin là rất thấp, trung bình từ 0,1 - 1,2. Sau khi tiêm, kháng thể của cá tiêm vắcxin ở cả 3 trại thí nghiệm đều tăng cao khác biệt ngay ở lần thu mẫu đầu tiên (10 ngày sau khi tiêm) vào khoảng 300 điểm độ ngày. Kết quả còn cho thấy kháng thể ở nhóm cá vắcxin luôn duy trì ở mức cao hơn 7, trong khi ở nhóm đối chứng chỉ đạt tối đa bằng 4 và nhanh chóng suy giảm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê ở tất cả các ao trong suốt thời gian thí nghiệm (P<0,001) (Hình 3.3). Các kết quả này tương tự với nghiên cứu về mức độ kháng thể trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra của Th ắng (2009) và Thành (2010). Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm trước đây đạt được bảo hộ sau 14 ngày tiêm ở 26 - 280C (380 độ ngày) với chỉ số RPS60 = 82. Cá đã được gây nhiễm vào thời điểm 20 tuần sau khi tiêm vắcxin đạt hệ số bảo hộ RPS60 là 72 và hiệu giá kháng thể ở 20 tuần là 7. Các kết quả nghiên cứu thực địa này đã một lần nữa khẳng định các kết quả đó. Tóm lại, kết quả về hiệu giá kháng thể đặc hiệu có được từ việc tiêm vắcxin ALPHAJECT® Panga 1 cho phép nhận xét đáp ứng miễn dịch trong cá không phụ thuộc vào: (1) nguồn cá; (2) những đợt bệnh trước đó; (3) hàm lượng kháng thể lúc tiêm vắcxin; (4) bệnh ngay sau khi tiêm vắcxin. Nhận định này phù hợp với nghiên cứu tổng hợp về vắcxin dạng nhũ dầu của Midtlyng (1996) ngoài thực địa ở Na Uy. Tỷ lệ chết Bệ nh do vi khuẩn E.ictaluri xảy ra sau khi cá đã có đáp ứng miễn dịch ở địa điểm Đồng Tháp (từ ngày 48 - 83) và An Giang (từ ngày 65 – 99) sau khi tiêm vắcxin. Trong giai đoạn này có đến 95% cá chết là do vi khuẩn E.ictaluri ở Đồng Tháp, còn ở An Giang có 80% cá chết do vi khuẩn E. ictaluri, còn lại là do những nguyên nhân khác như vàng da, xuất huyết, ký sinh trùng. Tỉ lệ cá chết tích lũy trong suốt thời gian thí nghiệm ở 2 điểm trên được thể hiện trong Bảng 3.1. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỉ lệ chết trong giai đoạn trước và sau khi xảy ra bệnh gan thận mủ ở các ao thử nghiệm. Ở Đồng Tháp, tổng số cá chết trong thời gian xả y ra bệnh chiếm 2,87% ở nhóm vắcxin và 7,46% ở nhóm đối chứng. Trong đó, số cá chết tích lũy do E. ictaluri của nhóm vắcxin là 2,57%, thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng 7,30% (P<0,0001). Hệ số bảo hộ tương đối của vắcxin đối với bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri, RPS = 64,7. Ở An Giang, tổng số cá chết trong thời gian xảy ra bệnh là 1,60% ở nhóm vắcxin và 2,84% ở nhóm đối chứng. Trong đó số cá ch ết tích lũy do E. ictaluri của nhóm vắcxin là 1,18%, thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng 2,36% (P<0,0001). Hệ số bảo hộ tương đối của vắcxin đối với bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri là RPS = 50,0. KẾT LUẬN Kết quả thí nghiệm cho phép kết luận vắcxin ALPHAJECT® Panga 1 là an toàn và tiêm vắcxin không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cá tra trong ao nuôi thương phẩm. Vắcxin ALPHAJECT® Panga 1 tiêm vào xoang bụng cá tra đã kích thích hình thành miễn dịch đặc hiệ u chống lại vi khuẩn E.ictaluri và bảo hộ được cá khi bệnh xảy ra trong thời gian thí nghiệm. . Bài thảo luận: Thử nghiệm vắcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh Kết quả đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin đối với cá tra nuôi thươngphẩm cho thấy vắcxin. có khoảng 36 loại vắcxin phòng bệnh do vi khuẩn và 2 loại vắcxin phòng bệnh do virút được sử dụng rộng rãi cho nhiều loài cá nuôi. Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ “Bacillus Necrosis. giá tác dụng thực địa của vắcxin ALPHAJECT® Panga 1 phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU a) Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện trên