Tạo tôm càng xanh toàn đực Macrobrachium rosenbergii nhờ bất hoạt gen insulin like tuyến đực qua công nghệ can thiệp RNA

Nhu cầu cấp thiết về nguồn tôm giống càng xanh toàn đực (Macrobrachium rosenbergii) đang là mối quan tâm hàng đầu của người dân nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Giải pháp công nghệ sinh học mới có thể đáp ứng được nhu cầu thị trường và xã hội hóa là công nghệ can thiệp RNA nhằm bất hoạt việc giải mã hormone được sinh ra từ tuyến đực cho mục đích tạo ra con tôm cái giả (neo-female) để sản xuất con giống tôm càng xanh toàn đực.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠO TÔM CÀNG XANH TOÀN ĐỰC Macrobrachium rosenbergii NHỜ BẤT HOẠT GEN INSULIN-LIKE TUYẾN ĐỰC QUA CÔNG NGHỆ CAN THIỆP RNA Bùi Thị Liên Hà1, Nguyễn Đức Minh1, Lê Thị Hoài Oanh1, Trần Thanh Võ1, Nguyễn Điền1, Lê Chính1, Nguyễn Viết Dũng2, Nguyễn Văn Hảo3 TÓM TẮT Nhu cầu cấp thiết nguồn tơm giống xanh tồn đực (Macrobrachium rosenbergii) mối quan tâm hàng đầu người dân nuôi trồng thủy sản Việt Nam Giải pháp công nghệ sinh học đáp ứng nhu cầu thị trường xã hội hóa cơng nghệ can thiệp RNA nhằm bất hoạt việc giải mã hormone sinh từ tuyến đực cho mục đích tạo tôm giả (neo-female) để sản xuất giống tơm xanh tồn đực Kết đạt nghiên cứu tổng hợp thành công sợi đôi double-stranded RNA (dsRNA) trình tự mRNA mã hố gen tuyến đực Androgenic Gland Hormone Tơm post xanh tồn đực có độ tuổi nhỏ hiệu chuyển cao Tơm chuyển thành cơng sau 3,5 tháng tính từ thời điểm bắt đầu tiêm thành thục sinh dục tham gia sinh sản Tỷ lệ chuyển sau 2,5 – tháng tiêm đạt 88-92%, tần xuất tiêm sợi đôi dsRNA cho hiệu chuyển cho tỷ lệ sống cao tuần/lần Từ khóa: tơm xanh, chuyển giới, can thiệp gen I ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) đối tượng thủy sản nước có giá trị kinh tế cao Việt Nam Việc ni tơm xanh tồn đực mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi đối tượng này; nhu cầu giống cho việc ni đại trà lớn Chính mà việc tìm kiếm giải pháp công nghệ tạo nguồn tôm giống toàn đực ưu tiên hàng đầu nhà nghiên cứu nuôi trồng thủy sản Việc khám phá chế xác định giới tính tơm góp thêm giải pháp đầy tiềm phục vụ sản xuất tơm ni Chuyển đổi giới tính tơm ni có lợi ích vượt bậc như: chọn giới tính có biểu tăng trưởng vượt trội, đạt kích thước thương phẩm lớn, tăng sản lượng thu hoạch Tôm xanh đối tượng kiểu mẫu cho ứng dụng chuyển giới tạo quần thể đơn tính thuận lợi mặt giải phẫu học tuyến đực Cơ sở nghiên cứu sản xuất nguồn tơm giống tồn đực tạo tơm neo-female (con tơm chuyển đổi giới tính từ đực) Trên tảng cấu trúc đặc biệt quan sinh sản tơm xanh nói chung nhóm giáp xác Decapod nói chung: tinh sào quan chuyên tạo tinh, tuyến đực (androgenic gland – AG), quan biệt lập khác có chức tiết hormone, tuyến thường nằm cận cuối bám nhẹ vào ống dẫn tinh, tham gia vào biệt hóa giới tính phát triển đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước tăng trưởng (Sagi, 1995) Tuyến đực chứng minh có vai trị điều chỉnh biệt hố tính đực tạo tinh tơm (Charniaux - Cotton Peyen Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: lienha09@gmail.com Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 1988) Sự cắt bỏ tuyến đực tôm xanh Macrobrachium rosenbergii giai đoạn sớm gây đảo giới hồn tồn, với hố tính trạng sinh dục sơ cấp thứ cấp vật sinh sản (Sagi ctv 1989, 1997a) Thêm vào đó, cấy ghép tuyến đực vào tuyến có tác động đực hố tơm (Nagamine ctv 1980, 1987) Như ý tưởng cho việc tạo tôm neofemale thực can thiệp thành công vào tuyến đực tôm xanh đực giai đoạn sớm Giải pháp tạo tôm neo-female can thiệp phương pháp vật lý nhằm loại bỏ tuyến đực Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (Viện TS 2) thực thành công công nghệ vi phẫu loại bỏ tuyến đực nhằm sản xuất giống tơm xanh tồn đực từ năm 2004 Trên tảng thành công đạt từ công nghệ vi phẫu loại bỏ tuyến đực, Viện TS tiếp tục thăm dò đạt kết thử nghiệm thành công bước đầu giải pháp khác việc tạo tôm neo-female Đây giải pháp công nghệ can thiệp vào tuyến đực phương pháp sinh học Công nghệ gọi can thiệp vào sợi RNA thông tin (RNA interference – iRNA) nhằm bất hoạt việc giải mã hormone sinh từ tuyến đực Interference RNA (iRNA) gene, tạm dịch can thiệp gene RNA Cơ chế công nghệ iRNA dùng trình tự RNA đặc biệt (siRNA), small interfering RNA, để can thiệp biểu gene đích siRNA đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotide phát từ lâu di truyền vi sinh vật, động vật, thực vật người Trong tế bào, siRNA cho mang vai trò quan trọng việc điều tiết tiết phân giải mRNA Khi đoạn mạch đôi siRNA kết hợp với diện phức hợp RISCs, RNA-induced silencing complexes, tháo xoắn thực trình iRNA Quá trình xảy phức hợp đoạn mạch đơn siRNA RISCs tiến đến trình tự bổ sung RNA Tại dây, phức hợp cắt phân hủy đầu điều khiển hoạt động RNA (cognate RNA) Kết khơng có RNA cho trình giải mã tổng hợp protein hay hormone gene Cơng nghệ can thiệp iRNA bất hoạt sợi RNA thơng tin mã hóa gen tuyến đực insuline–like tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like androgeneic gland, Mr–IAG) nghiên cứu cơng bố nhóm tác giả Ventura ctv năm 2009 Mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp Mr - IAG RNA mạch đôi dsRNA (sợi đôi RNA Insulin-like Gene tạo hormone tuyến đực quy định giới tính tơm xanh) nhằm ứng dụng việc chuyển giới tôm xanh tạo tơm neo-female cho mục đích sản xuất quần thể tơm tồn đực II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu * Thời gian thực hiện: từ ngày 01 tháng 05 năm 2012 đến ngày 01 tháng 11 năm 2013 * Địa điểm nghiên cứu: - Phịng thí nghiệm Di truyền Phân tử - Phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, 116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đa Kao, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh - Cơ sở Nghiên cứu Thực nghiệm Sản xuất Thủy sản Thủ Đức, địa 658 Kha Vạn Cân, quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu Tôm hệ thống thí nghiệm: Tơm post xanh tồn đực Pl l0-25: 2.000 sử dụng cho thí nghiệm tiêm sợi dsRNA; tôm cung cấp từ Cơ sở Nghiên cứu Thực nghiệm Sản xuất Thủy sản Thủ Đức (TP.HCM) thí nghiệm tiêm tơm thực sở Tơm thí nghiệm ni hệ thống nước tuần hồn RAS; tơm cho ăn thức ăn thương mại dạng viên Tomboy, có bổ sung thêm thức ăn tươi: trùn chỉ, gan đầu mực; ngày cho ăn hai lần vào buổi sáng chiều, định kỳ tuần làm siphon, vệ sinh bể lần để loại bỏ bớt chất thải TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình Hệ thống RAS cho hai bể tơm thí nghiệm: bể tơm mẹ ni sau tháng thí nghiệm bể tơm tiêm sợi đơi dsRNA (có giai nắp xanh) Tổng hợp sợi đôi dsRNA Mr-IAG - Vật liệu DNA mẫu cho việc tổng hợp sợi đơi dsRNA Mr-IAG chủng E.coli JM109 có chứa vector pGEM–T Easy mang trình tự cDNA mạch khn (JM109 (pGEMT-cDNA)) Bảng Trình tự mồi hỗn hợp phản ứng Thứ tự Primer - Quy trình tổng hợp sợi đôi dsRNA MrIAG: sợi đôi dsRNA Mr-IAG tổng hợp kit T7 Express Promega Sequence primer Forward (5’→3’) Reverse(5’→3’) Mr–IAG Sense T7P (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3) ATGGGATACTGGAATGCCGG CTGGAACTGCAGGTGTTAAG Mr–IAG Antisense ATGGGATACTGGAATGCCGAG T7P (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3) CTGGAACTGCAGGTGTTAACG Khuếch đại số lượng sợi sense antisense DNA: thành phần chuẩn bị cho eppendorf phản ứng PCR: 48 µl Go Taq colorless master Mix – Promega 1µl mạch khn (vector pGEM–T Easy mang trình tự cDNA mạch khn) cho hai eppendorf; 0,5 µl mồi T7 sense forward reverse cho ống khuếch đại sợi sense; 0,5 µl antisense T7 reverse forward primer cho ống khuếch đại số lượng sợi antisense Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: chu kì (x1) 94oC phút, chu kì (x 35) 94oC 30 giây, 57oC 30 giây, 72oC phút, chu kì (x1) 72oC 10 phút, giữ sản phẩm 4oC Kết sản phẩm khuyếch đại khoảng 560bp Tổng hợp sợi đơn sense antisense RNA thành phần phản ứng lai cho tube sợi sense antisense RNA từ sợi sense antisense DNA tinh (The Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up kit – Promega): Ribomax Express Buffer 10 µl, T7 DNA mạch khn (sense antisense) µl, Enzyme Mix T7 µl Điện di gel agarose 1.5 %, 100V, 40 phút để kiểm tra diện sợi sense, antisense RNA trước lai tadsRNA sau lai sợi sau xử lý với loại enzymetheo thứ tự RNase, DNase, hỗn hợp RNase, DNase, RNase III TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Các tube sợi sense antisense RNA ủ 37oC qua đêm sau đem trộn chung ống sense ống antisense, heat nhiệt 70oC 10 phút để lai hai mạch lại với máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad), làm lạnh xuống 4oC Xử lý hỗn hợp tạo thành µl theo thứ tự loại enzyme DNase, RNase, RNase III, ủ 37oC phút Tiêm dsRNA vào tôm: Trong thí nghiệm tơm tiêm dsRNA với nồng độ 5μg/g trọng lượng tôm lô đối chứng tiêm nước muối sinh lý 9‰ Mỗi nghiệm thức gồm 10 – 15 tôm post, trọng lượng khoảng 0,01g đến 0,1g nuôi giai lưới 2mx2m Tiến hành tiêm dsRNA cho tôm liên tục với tần suất tiêm (½ tuần/lần, tuần/lần tuần/lần) khoảng thời gian tháng Tôm xanh đực có lỗ sinh dục đực nằm bên cạnh đốt gốc đôi chân ngực thứ chọn vị trí tiêm dsRNA vào tơm vị trí xoang gốc chân bị thứ (Ventura, 2009) DsRNA tiêm vào tôm kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan) thể tích tối đa kim 10µl, thể tích tiêm dsRNA vào tơm tùy vào nồng độ tùy theo trọng lượng Kiểm tra tơm: Sau tháng thí nghiệm tất tôm (kể lô đối chứng) kiểm tra giới tính dựa vào đặc điểm hình thái nó, trưởng thành việc phân biệt dễ dàng chủ yếu vào nhú lồi sinh dục đực gốc chân ngực số Ngồi tơm đực cịn có nhánh phụ đực nằm kế nhánh chân bụng thứ (chỉ có chân bụng thứ có nhánh phụ đực cịn chân khác khơng có), khơng có nhánh Sau ba tháng thí nghiệm, thơi ngưng tiêm dsRNA tiếp tục nuôi dưỡng điều kiện tốt để kiểm tra chuyển tơm thí nghiệm Những chuyển giới thành công tiêm sợi đôi dsRNA đánh dấu phẩm màu flourence để dễ theo dõi giai đoạn sau Xử lý số liệu: sử dụng thống kê Fisher exact test (two-tailed) so sánh kết tỷ lệ chuyển thành công nghiệm thức thí nghiệm tiêm tơm III KẾT QUẢ 3.1 Tổng hợp Mr-IAG dsRNA 3.1.1 Tổng hợp sợi đơn sense antisense RNA Sản phẩm sợi đơn sense antisense RNA kích thước 560 bp sau tinh trước cho vào lai ủ để tạo sợi đơi dsRNA Hình Sợi sense antisen RNA Bên trái thang DNA sản phẩm sau tinh sạch: giếng S sợi sense, giếng AS sợi antisense Bên phải thang DNA sản phẩm trước tinh sạch:giếng S sợi sense, giếng AS sợi antisense 3.1.2 Kiểm tra chất lượng sợi đôi dsRNA Ở bước này, nghiên cứu kiểm chứng lại lần trình tự gen đích (dsRNA/MrIAG) có tổng hợp thành cơng để chuyển thành sợi đôi dsRNA hay không Các mẫu pha loãng 50 lần để thực bước kiểm tra chất lượng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN kiểm tra xử lý sợi single - stranded RNA (sense antisense) với RNase, sợi bị phân hủy enzyme nên điện di không cho vạch xuất gel Nhưng xử lý với DNase khơng bị phân giải có băng hình xuất gel với kích thước khoảng 560 bp Khi xử lý với hỗn hợp hai enzyme DNase RNase có diện RNase nên kết sau điện di khơng cho băng hình bảng gel Hình Kết xử lý sợi sense, antisense, sRNA loại enzyme, mẫu pha loãng 50 lần Các giếng bên trái thang DNA giếng thể phản ứng kiểm tra sợi đơn Giếng S sợi đơn RNA sense, giếng D sợi đơn RNA sense xử lý với DNase, giếng R sợi đơn RNA sense xử lý với RNase, giếng D + R sợi sense xử lý với hai loại enzyme DNase Rnase Bên phải thang DNA thử nghiệm kiểm tra sợi đôi double – stranded RNA (dsRNA) Giếng DS sợi đôi dsRNA sau lai hai mạch sense antisense, giếng D sợi đôi dsRNA xử lý với DNase, giếng R sợi đôi dsRNA xử lý với RNase, giếng D + R sợi đôi dsRNA xử lý với hai enzyme DNase RNase, giếng RIII sợi đôi dsRNA xử lý với RNase III, giếng C Positive control Khi xử ký kiểm tra sợi dsRNA sợi đơi nên khơng bị phân giải RNase Tuy sợi đơi chất khơng phải DNA nên khơng bị phân giải DNase Khi xử lý hỗn hợp hai enzyme DNase RNase khơng bị phân giải Cho nên tất giếng cho băng hình kích thước khoảng 560 bp agrose 1.5% Tuy nhiên xử lý RNase III - loại enzyme có khả phân giải RNA sợi đơi gel điện di khơng cho băng hình sản phẩm double – stranded RNA Positive control cho kết gel điện di với kích thước khoảng 1000 bp Bên trái thang DNA thử nghiệm kiểm tra sợi đơn single - stranded RNA (ss RNA) Khi 3.2 Thử nghiệm tiêm sợi đôi dsRNA vào tôm Kết thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA vào tơm post xanh toàn đực thể theo độ tuổi tơm post tồn đực khác nhau: PL17, PL25 PL10 thể bảng số hình ảnh tơm thí nghiệm chuyển minh họa hình Trong thí nghiệm tiêm tơm tuổi PL17, tổng số lượng tôm tiêm 36 chia nghiệm thức tiêm Số lượng tôm chuyển lại đến tháng thứ sau loại trừ số tôm hao hụt tôm chuyển không thành cơng 20 Tương tự cho trường hợp thí nghiệm tiêm tôm tuổi PL25, tổng số lượng tôm tiêm 45 con, số tôm chuyển cuối 16 Nhìn chung, kết tỷ lệ chuyển thành cơng hai thí nghiệm có khác biệt (tỷ lệ khoảng 55% thí nghiệm tơm PL17 35% thí nghiệm tơm PL25) Tuy nhiên sử dụng thống kê Fisher exact test (two-tailed) so sánh kết hai thí nghiệm tiêm tơm PL17 PL25 thấy khơng khác biệt có ý nghĩa (P = 0,1147) Khi so sánh kết thí nghiệm tiêm tơm tuổi tơm PL17 PL10 thống kê Fisher exact test (two-tailed) cho kết tỷ lệ chuyển thành cơng hai thí nghiệm khác biệt có ý nghĩa (P = 0,0291) Đồng thời kết tỷ lệ chuyển thành cơng hai thí nghiệm tuổi tơm PL25 PL10 có khác biệt có ý nghĩa lớn (P < 0,0001) Căn yếu tố tần suất tiêm hai thí nghiệm tơm PL17 PL25 khơng có khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức tiêm (P > 0,05) Chỉ thí nghiệm tiêm tơm tuổi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN PL10 có khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức tần suất tiêm tuần/lần tuần/lần (P = 0,0355) Như tần suất tiêm có ảnh hưởng đến khả chuyển Bảng Kết thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA vào tơm post xanh tồn đực Tuổi tơm PL17 PL25 PL10 Thời gian thí nghiệm Đối chứng Tần suất tiêm (tuần/lần) ½ tuần tuần tuần Tổng số Ban đầu 10 12 12 12 Tháng thứ 10 10 10 11 Tháng thứ 10 11 Tháng thứ 3: ngưng tiêm 7 20 Số tôm chuyển sau tháng ngưng tiêm 7 20 Ban đầu 13 15 15 15 45 Tháng thứ 13 15 10 15 Tháng thứ 10 13 15 Tháng thứ 3: ngưng tiêm 10 10 21 Số tôm chuyển sau tháng ngưng tiêm 16 100 100 200 67 81 148 67 81 148 Ban đầu 100 Tháng thứ 2,5: ngưng tiêm Số tôm chuyển sau tháng ngưng tiêm 36 Hình Tôm chuyển thành công A: quan sát nhú lồi vị trí chân bị số B: quan sát gai sinh dục đực chân bơi số kính hiển vi Tơm chuyển khơng thành cơng C: nhú lồi vị trí chân bị số D: gai sinh dục đực chân bơi số E: chân bơi số tơm chuyển có dấu hiệu bất thường TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN IV THẢO LUẬN Sản phẩm sợi đơi dsRNA Mr-IAG cho kết kích thước khoảng 550bp trình tự tương đồng cao (99%: phân tích giải trình tự từ kết trước đề tài) với trình tự cơng bố tác giả Ventura (2009) Đồng thời qua việc kiểm tra chất lượng dsRNA Mr-IAG ( kiểm tra, xử lý loại enzyme đặc thù) cho thấy sản phẩm sợi đôi dsRNA Mr-IAG tổng hợp RNA mạch đơi đứng trình tự công bố sẵng sàng cho việc thử nghiệm tiêm sợi dsRNA vào tôm Kết tiêm tôm cho thấy, ba thí nghiệm độ tuổi tơm post tồn đực khác nhau: PL17, PL25 PL10 cho kết chuyển Tuy nhiên độ tuổi lớn PL25 hiệu chuyển thấp (ở không báo cáo số liệu chi tiết số tôm không chuyển tôm bị hao hụt phần tôm chuyển bị quay trở lại giới tính ban đầu tơm đực – ‘lại đực’) Tuy nhiên q trình thí nghiệm, tơm lớn PL25, dễ tiêm, tỷ lệ sống cao, hao hụt tơm tuổi có dấu hiệu biệt hố giới tính nên khả ức chế hoạt động phát triển hormone sinh dục đực sợi dsRNA không đạt hiệu cao Ngược lại, tơm nhỏ PL10, tiêm có số liệu tơm hao hụt cịn tỷ lệ ‘lại đực’ gần khơng có Trong thí nghiệm tiêm tơm PL10, khác biệt có ý nghĩa hai tần suất tiêm chủ yếu giảm tần suất tiêm giảm tỷ lệ hao hụt tiêm nhiều lần, tôm yếu dễ chết dẫn đến tỷ lệ tơm cịn lại chuyển thành cơng thấp V KẾT LUẬN Chất lượng sợi đơi dsRNA có hiệu chuyển đổi giới tính cho tơm xanh hậu ấu trùng đực Tuổi tôm ảnh hưởng lớn đến chuyển tơm thí nghiệm tiêm sợi đơi dsRNA, tuổi tơm nhỏ hiệu chuyển cao tỷ lệ tôm lại đực không xảy Tần suất tiêm không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ tôm chuyển thành công, tần suất tiêm dày tơm phát triển tăng tỷ lệ chết tôm yếu tiêm nhiều lần LỜI CÁM ƠN Nhóm thực đề tài xin chân thành cám ơn đến Vụ KHCN&MT, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước Nam Bộ thành viên đề tài tận tình định hướng kịp thời, đóng góp ý kiến chiến lược để đề tài có kết thành công TÀI LIỆU THAM KHẢO Aigner A., 2007 Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering RNAs Curr Opin Mol Ther 9, pp 345–352 Davis M.E., Zuckerman, Chung Hang J., Choi, David Seligson, Anthony Tolcher, Christopher A., Alabi, Yun Yen, Jeremy D., Heidel & Antoni Ribas, 2010 Evidence of IRNA in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles Nature 2010 Apr 15; 464(7291):1067–70 Epub 2010 Mar 21 Fingerman M., 1997 Role of neurotransmitters in regulating reproductive hormon release and gonadal maturation in decapods crustaceans, Invertebrate Reproduction and Development 31, pp 47– 74 Galvani A., and Sperling L., 2002 RNA interference by feeding in Paramecium Trends Genet 18, 11–12 Guan, Haoji, 2006 Double–stranded RNA induced gene silencing of neuropeptide genes in sand shrimp, Metapenaeus ensis and development of crustacean primary cell culture Hong Kong University Nagamine C., Knight W., Maggeneti A., and Paxman, G., 1980 Masculinization of female Macrobrachium rosenbergii (de Man) (Decapoda, Palaemonidae) by androgeneic gland implantation, General and comparative endrocrinology 31(4), 442–457 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ongvarrasopone C., Roshorm Y., and Panyim S., 2007 A Simple and Cost Effective Method to Generate dsRNA for IRNA Studies in Invertebrates Science Asia 33, 35–39 Sagi Amir, Snir Eviatar and Khalaila Isam, 1995 Sexual differentiation in decapods crustaceans: role of the androgeneic gland Invertenrate Reproduction an Development 31 (1–3), 55 – 61 Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E., Hannon G.J., Conklin D.S., 2002 Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence–specific silencing in mammalian cells Genes Dev 16, 948–958 Sagi A., and Ra`ana Z., 1988 Morphotypic differentiation of males of freshwater prawn Macrobrachium rosengergii: changes in the midgut glands and the reproductive system Journal of crustacean biology 8, 43–47 Peng Y., Lu J.X., Shen X.F., 2007 shRNA driven by Pol II/T7 dual–promoter system effectively induce cell–specific RNA interference in mammalian cells Biochem Biophys Res Commun 360, 496–500 Plasterk, 2002 RNA silencing: the geneome’s immune system Science 17 May 2002: Vol 296 no 5571 pp 1263–1265 Sachiko Suzuki, 1999 Androgeneic gland hormon is a sex–reversing factor but cannot be a sex– determining factor in the female Crustacean Isopods  Armadillidium vulgare General and comparartive endrocrinology 115(3), 370–378 Sagi A., and Afalo E.D., 2005 The androgeneic gland and monosex culture of freshwater prawn Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a biotechnological perspective Aquaculture Research 36, 231–237 Sagi Amir, Cohen Dan, Milner Yoram, 1989 Effect of androgene gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, General and comparative endocrinology 77, 15 – 22 Sagi A., Milstein A., Eran Y., Joseph D., Khaila I., Abdu U., Harpaz S., and Karplis I., 1997 Culture of the Australian redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus) in Israel, II Second growout season of overwintered populations Israelli Journal of Aquaculture–Bamidgeh 59, 222–229 Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G., and Karplus I., 1996 Intersex red claw crayfish, Cherax quadricarinatu (Von martens): functional males with pre–viellogeneic ovaries Biol.Bull 190, 16–23 10 Sanders B., 1983 Insulin–like peptides in the lobster Homarus americanus.I insulin immunoreactivity General and Comparative Endocrinology 50, 366–373 Spence R Malecha, Patricia, Nevin A., Phyllis Ha, Loena E Barck, Yara Lamadrid–Rose, Scott Masuno and Dennis Hedgecock, 1992 Sex– ratios and sex–determination in progeney from crosses of surgically sex–reversed freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture 105(3–4), pp 201–218 Tabara H., Grishok, A., Mello, C., 1998 IRNA in C.elegans: Soaking in the Geneome Sequence Science 16 October 1998: Vol 282 no 5388, pp 430–431 The Nobel Prize in Physiology ỏ Medicin, 2006 RNA interference, pp 1–10 T., Ramos L., Huberman A., 2007 Effect of RNA interference on gene functions of aquatic organisms Biotecnologia Aplicada Vol 24, No Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S., Glazer L., and Sagi A., 2009 Temporal silencing of an androgeneic gland–specific insulin–like gene affecting phenotypical geneder differences and spermatogenesis Department of Life General Endocrinology 150, 1278–1286 Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., and Bartel D.P., 2000 IRNA: Double–stranded RNA directs the ATP–dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101, 25–33 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ALL MALE REPRODUCTION OF Macrobrachium rosenbergii BY INSULINLIKE GENE SILENCING IN THE ANDROGENIC GLAND THROUGH RNA INTERFERENCE Bui Thi Lien Ha1, Nguyen Duc Minh1, Le Thi Hoai Oanh1, Tran Thanh Vo1, Nguyen Dien1, Le Chinh1, Nguyen Viet Dung2, Nguyen Van Hao3 ABSTRACT Within the aquaculture industry in Vietnam, the demand of the all male prawn Macrobrachium rosenbergii seed is one of overriding importance.  Macrobrachium rosenbergii is an important freshwater prawn species having commercial importance in Vietnam The all male prawn farming brings most highly profitable for farmers; therefore seed demand for popular culture is always very high Lasted technology called RNA interference for creating neo-female is inactivated a single IAG-encoding gene of male insulin-like prawn (Macrobrachium rosenbergii insulin-like androgeneic gland, Mr-IAG) for producing all male seed is being successfully implemented at the Research Institute for Aquaculture No The currently result has achieved with double-stranded RNA (dsRNA) synthesis to mRNA encodes Androgenic Gland The important factor for success is very young shrimp age at the time of the first injection, period and time of injections Sex reversal rate after two to three months injection is 88-92% female, dsRNA of injection time around months; frequency of dsRNA injection is weeks Keywords: fresh water prawn, sex-reversal, iRNA Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 10/02/2014 Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014 Ngày duyệt đăng: 01/4/2014 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No Email: lienha09@gmail.com Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No Research Institute for Aquaculture No TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 6/2014 11 ... protein hay hormone gene Công nghệ can thiệp iRNA bất hoạt sợi RNA thông tin mã hóa gen tuyến đực insuline? ?like tơm xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin? ? ?like androgeneic gland, Mr–IAG) nghiên cứu... tuyến đực phương pháp sinh học Công nghệ gọi can thiệp vào sợi RNA thông tin (RNA interference – iRNA) nhằm bất hoạt việc giải mã hormone sinh từ tuyến đực Interference RNA (iRNA) gene, tạm dịch can. .. tuyến có tác động đực hố tôm (Nagamine ctv 1980, 1987) Như ý tưởng cho việc tạo tôm neofemale thực can thiệp thành công vào tuyến đực tôm xanh đực giai đoạn sớm Giải pháp tạo tôm neo-female can