Tạo giống lúa kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -  - LÊ THỊ NHƯ TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2 LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, tháng 11/2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -  - Lê Thị Như TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2 LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BƠNG Chun ngành: Di truyền học Mã sớ : 8420101.21 Cán hướng dẫn: TS Khổng Ngân Giang TS Trần Đức Long Hà Nội, tháng 11/2019 Lê Thị Như – K26CH LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực hiện, số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2020 Lê Thị Như i Lê Thị Như – K26CH LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Khổng Ngân Giang Với kiên nhẫn hiểu biết mình, người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ suốt q trình tơi học tập thực khóa luận Phòng thí nghiệm « Nghiên cứu di truyền chức hệ gen lúa, cà phê tương tác với vi sinh vật » (LMI-RICE2), Viện Di truyền Nông nghiệp Tôi xin cảm ơn TS Tạ Kim Nhung kiến thức chun mơn động viên, khuyến khích với tơi từ ngày đầu tơi đến thực tập LMI Tôi cảm thấy may mắn biết ơn làm việc hỗ trợ hai cô Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình tất anh chị, bạn bè làm việc phòng thí nghiệm LMI-RICE2 Xin cảm ơn thầy Stephane Jouannic, chị Phạm Thị Mai, chị Nguyễn Thị Mỹ Lệ nhóm « Cấu trúc bơng lúa », học nhiều điều kiến thức chuyên môn vấn đề sống Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS Trần Đức Long, môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Thầy người giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cho kiến thức để thực khóa luận Tơi xin cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), Trung tâm Nghiên cứu phát triển (IRD) Pháp, Quỹ học bổng NAGAO hỗ trợ kinh phí cho tơi q trình thực khóa luận Nghiên cứu nằm khn khổ đề tài « Nghiên cứu liên kết tồn hệ gen tính trạng ảnh hưởng đến suất tập đoàn lúa Việt Nam, phục vụ chương trình chọn tạo giống lúa địa » mã số 106-NN.02-2016.60 Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ Cuối cùng, muốn bày tỏ lời cảm ơn tới động viên, thấu hiểu ủng hộ từ gia đình, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Học viên cao học (ký tên) ii năm Lê Thị Như – K26CH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc lúa 1.1.1 Cấu trúc bơng hình thành bơng từ mô phân sinh 1.1.2 Các nghiên cứu sở di truyền kiểm soát cấu trúc lúa 1.2 Phương pháp phân tích liên kết tồn hệ gen (GWAS), công cụ hữu hiệu để nghiên cứu sở di truyền tính trạng nơng học 1.3 Tổng quan motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 lúa 1.3.1 Motif ankyrin 1.3.2 Phân tích tin sinh gen ANK1, ANK2 1.4 Nghiên cứu chức gen thực vật phương pháp chuyển gen 10 1.5 Bất hoạt gen công cụ CRISPR/Cas9 14 1.5.1 Hệ thống CRISPR/Cas9 14 1.5.2 Chỉnh sửa đa điểm cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu………………………………………………………………………19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Plasmid 19 2.1.3 Các chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy 20 2.2 Phương pháp 20 2.2.1 Phương pháp khử trùng hạt 20 2.2.2 Thiết kế mồi 20 2.2.3 Tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA 23 2.2.4 Phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 24 2.2.5 Đưa đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T Easy 25 2.2.6 Ghép nối đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE 26 2.2.7 Thiết kế cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bất hoạt gen ANK1, ANK2 27 2.2.8 Chuyển gen vào giống lúa Kitaake sử dụng Agrobacterium 31 iii Lê Thị Như – K26CH 2.2.9 Phân tích chuyển gen mang cấu trúc tăng cường biểu ANK1, ANK2 33 2.2.10 Chọc lọc dòng chuyển gen đột biến cơng nghệ CRISPR/Cas9 34 2.2.11 Các kỹ thuật khác 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Tạo vector chuyển gen tăng cường biểu gen ANK1, ANK2 39 3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 39 3.1.2 Nhân dòng trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector nhân dòng pGEM-T Easy 40 3.1.3 Ghép nối trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE 42 3.2 Thiết kế cấu trúc PTG nhằm gây đột biến gen ANK1, ANK2 công nghệ CRISPR/Cas9………………………………………………………………………44 3.2.1 Tạo mảnh thành phần mang cấu trúc gRNA gây bất hoạt ANK1, ANK2 44 3.2.2 Sàng lọc cấu trúc PTG 45 3.3 Chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 46 3.4 Chọn lọc dòng chuyển gen tăng cường biểu gen ANK1, ANK2 47 3.4.1 Sàng lọc dòng T0 chuyển gen, đánh giá hiệu chuyển gen 47 3.4.2 Chọn lọc dòng T1 đồng hợp tử mang T-DNA 48 3.4.3 Đánh giá mức độ biểu gen ANK1, ANK2 dòng chuyển gen 50 3.5 Chọn lọc dòng chuyển gen đột biến gen ANK1, ANK2 công nghệ CRISPR/Cas9………………………………………………………………………52 3.5.1 Sàng lọc dòng chuyển gen T0 mang cấu trúc chuyển gen 52 3.5.2 Sàng lọc dòng chuyển gen T0 đột biến gen ANK1, ANK2 53 3.5.3 Chọn lọc dòng T1 đột biến đồng hợp 55 KẾT LUẬN .59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 68 iv Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ANK Ankyrin cDNA complementary DNA (DNA bổ sung) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) DNA Deoxyribonucleic acid (AND) GBS Genotyping by sequencing (Giải trình tự) gDNA Genomic DNA (AND hệ gen) gRNA guide RNA (ARN dò) GWAS Genome wide association study (Nghiên cứu liên kết toàn hệ gen) NST Nhiễm sắc thể PAM Protospacer adjacent motif (vùng AND nằm cạnh trình tự đích) PCR Polymerase chain reaction (Chuỗi phản ứng khuếch đại) PTG Polycistronic tRNA-gRNA (Đoạn xen kẽ tARN ARN dò) qRT-PCR quantitative real-time PCR (Phản ứng PCR định lượng) QTL Quantitive trait loci (lơ-cút tính trạng số lượng) RNA Ribonucleic acid (ARN) SBN Secondary branch number (Số nhánh thứ cấp) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) SpN Spikelet number (Số hoa) v Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc bơng lúa (A) thay đổi qua q trình hóa (B) [46] Hình Các giai đoạn hình thành bơng lúa non [40] Hình Tương tác di truyền kiểm soát phát triển bơng lúa [17] Hình Biểu ANK1, ANK2 hai nhóm lúa có cấu trúc bơng tương phản Hình Sơ đồ mô cấu trúc kiểu protein ANK1 (A), ANK2 (B) tạo từ mRNA khác 10 Hình Chỉnh sửa gen với hệ thống CRISPR/Cas9 [43] 16 Hình Cấu trúc PTG cho phép sản xuất nhiều gRNA [42] 18 Hình Cấu trúc vector pGEM-T Easy (A), PC5300.OE (B), pGTR (C) vector pRGEB32 (C) 20 Hình Sơ đồ vị trí gắn mồi dùng phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 (A), ANK2 (B) 25 Hình 10 Phản ứng tái tổ hợp vector pGEM-T_CDS_ANK vector PC5300.OE 26 Hình 11 Vị trí cặp mồi sử dụng giải trình tự vector PC5300.OE 26 Hình 12 Nguyên tắc tạo cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) Golden Gate [42] 29 Hình 13 Các bước q trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium lúa 32 Hình 14 Vị trí cặp mồi nhằm xác định đột biến xảy dòng chuyển gen Cas9-ANK1, Cas9-ANK2 35 Hình 15 Sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 ANK2 từ mẫu non giống Nipponbarre 40 Hình 16 Kiểm tra vector pGEM-T tái tổ hợp PCR cắt enzyme giới hạn 41 Hình 17 Kết phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vector pGEMT Easy tái tổ hợp 42 Lê Thị Như – K26CH Hình 18 Kiểm tra vector PC5300.OE tái tổ hợp PCR (A, C) cắt enzyme giới hạn EcoRI (B,D) 43 Hình 19 Kết PCR khuếch đại mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 bất hoạt đồng thời ANK1 ANK2 44 Hình 20 Kết sàng lọc dòng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1, ANK2 bất hoạt đồng thời ANK1 ANK2 45 Hình 21 Hình ảnh chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa Kitaake 47 Hình 22 Kết sàng lọc chuyển gen T0 mang cấu trúc tăng cường biểu gen ANK1, ANK2 48 Hình 23 Kết đánh giá mức độ biểu gen ANK1 dòng chuyển gen T1 51 Hình 24 Kết đánh giá mức độ biểu gen ANK2 dòng chuyển gen T1 52 Hình 25 Sàng lọc dòng chuyển gen T0 PCR 53 Hình 26 Sàng lọc đột biến PCR 54 Hình 27 Sự thay đổi trình tự DNA (A), trình tự protein (B) cấu trúc protein (C) dòng đột biến gen ANK1 56 Hình 28 Sự thay đổi trình tự DNA(A), trình tự protein (B) cấu trúc protein dòng đột biến gen ANK2 57 Hình 29 Sự thay đổi trình tự DNA, trình tự protein cấu trúc protein dòng đột biến Cas9-ANK(1+2) 58 Lê Thị Như – K26CH DANH MỤC BẢNG Bảng Danh sách mồi sử dụng đề tài 21 Bảng Trình tự gRNA-spacer 27 Bảng Các mồi sử dụng để tạo cấu trúc PTG 28 Bảng Các mảnh PCR thành phần cần tổng hợp với cặp mồi tương ứng 30 Bảng Kết giải trình tự dòng plasmid mang cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 bất hoạt đồng thời ANK1 ANK2 46 Bảng Kết đánh giá số T-DNA dòng lúa chuyển gen T1 PC5300.OE-ANK1 49 Bảng Kết đánh giá số T-DNA dòng lúa chuyển gen T1 PC5300.OE-ANK2 50 Bảng Kết phân tích đột biến gen ANK1, ANK2 chuyển gen hệ T0 55 Lê Thị Như – K26CH alen bp bp exon gen ANK1, T0.Cas9ANK1_2.32 đồng hợp tử 1bp so với đối chứng, T0.Cas9-ANK1_5.1 có kiểu gen dị hợp tử alen khơng bị đột biến alen 13 bp (Bảng 8) Hình 26 Sàng lọc đột biến PCR A : dòng T0.Cas9-ANK1, B : dòng T0.Cas9-ANK2 ; C : dòng T0 Cas9ANK(1+2) Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific) Đối với dòng Cas9-ANK2, phân tích kết điện di sản phẩm PCR (Hình 26B) giải trình tự cho thấy số 15 dòng dương tính có dòng mang đột biến đoạn từ 59-78 bp vùng exon đột biến dị hợp (Bảng 8) Đối với dòng chuyển gen với cấu trúc Cas9-ANK(1+2), phản ứng PCR thực để sàng lọc đột biến với cặp mồi sử dụng sàng lọc cấu trúc đơn Từ hình ảnh điện di thấy bốn dòng (22.61 60.12; 60.23; 60.27) có băng DNA với kích thước khác biệt so với đối chứng (Hình 26C) Hai dòng 22.61 60.12 giải trình tự, khơng phân tích kết hình ảnh bị nhiễu Các dòng phân tích giải trình tự lại hệ 54 Lê Thị Như – K26CH Bảng Kết phân tích đột biến gen ANK1, ANK2 chuyển gen hệ T0 Dòng chuyển gen T0 Kiểu gen Dị hợp (-2 bp/-3 bp) T0.Cas9-ANK1_1.8 Đồng hợp (-1 bp/-1 bp) T0.Cas9-ANK1_2.32 T0.Cas9-ANK1_5.1 Dị hợp (-13 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_2.1 Dị hợp (-60 bp/-59 bp) T0.Cas9-ANK2_4.131 Dị hợp (-59 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_5.10 Dị hợp (-59 bp/-78 bp) T0.Cas9-ANK(1+2)_22.61 T0.Cas9-ANK(1+2)_60.12 Chưa xác định T0.Cas9-ANK(1+2)_60.23 T0.Cas9-ANK(1+2)_60.27 WT: wild-type, không mang đột biến 3.5.3 Chọn lọc dòng T1 đột biến đồng hợp Các dòng chuyển gen hệ T0 mang đột biến hầu hết tồn trạng thái dị hợp tử (trừ dòng T0.Cas9-ANK1_2.32), dòng tiếp tục phân tích hệ T1 kỹ thuật PCR giải trình tự hệ T0 để tìm kiếm dòng đột biến đồng hợp tử Đối với gen ANK1, thu bốn dòng T1 đột biến đồng hợp tử (ank1-1.8.4, ank1-2.32.12, ank1-5.1.3, ank1-5.1.8) từ bp đến bp (Hình 27A) Phân tích cấu trúc protein thể đột biến cho thấy dòng ank1-5.1.3, ank1-5.1.8, ank1-2.32.12 xuất mã kết thúc sớm sau axit amin thứ 127, 126, 125 (Hình 27B) Protein thể đột biến motif ankyrin cuối so với protein thể khơng đột biến, lại motif ankyrin cấu trúc vị trí liên kết 55 Lê Thị Như – K26CH với phân tử peptide khác Đối với dòng ank1-1.8.4 (mất bp trình tự DNA, axit amin thứ 125 trình tự protein) protein tạo bảo tồn motif ankyrin protein không bị đột biến (Hình 27C) Hình 27 Sự thay đổi trình tự DNA (A), trình tự protein (B) cấu trúc protein (C) dòng đột biến T1.Cas9-ANK1 Đối với gen ANK2, kết phân tích có ba dòng đột biến đồng hợp tử , 50-70 bp trình tự DNA Dòng đột biến ank2-2.1.8 60 bp DNA, loại bỏ 20 axit amin trình tự protien, nhiên số lượng motif ANK TPR protein không bị thay đổi so với protein không đột biến Dòng ank25.10.1 59 bp, tạo mã kết thúc sớm chuỗi mã hóa protein Protein đột biến motif ankyrin sau motif TPR, khơng thể tạo vị trí bám với peptide khác Dòng đột biến ank2-5.10.6 78bp trình tự mã hóa, dẫn đến thiếu hụt 26 axit amin trình tự chuỗi polypeptide, làm motif ankyin số Sự vắng mặt motif ankyrin số làm tăng khoảng cách motif số số 5, có khả cấu trúc khơng gian phân tử protein khơng thể hình thành vị trí liên kết với phân tử sinh học khác (Hình 28) 56 Lê Thị Như – K26CH Hình 28 Sự thay đổi trình tự DNA(A), trình tự protein (B) cấu trúc protein dòng đột biến T1.Cas9-ANK2 Đối với hai dòng chuyển gen mang cấu trúc có khả gây đột biến đồng thời hai gen ANK1, ANK2 (22.61.1 60.21.1), kết phân tích trình tự hai gen cho thấy dòng 60.21.1 khơng có đột biến hai gen ANK1, ANK2 Trong dòng ank12-22.61.1 có đột biến đồng hợp hai gen, bp exon gen ANK1 20 bp exon gen ANK2 Cả hai đột biến tạo hai protein xuất mã kết thúc sớm Protein ANK1 motif ankyrin đầu tiên, protein ANK2 motif ankyrin cuối motif TPR Cả hai protein vị trí liên kết với phân tử sinh học khác (Hình 29) Các dòng đột biến tạo protein khơng hồn chỉnh sử dụng cho nghiên cứu 57 Lê Thị Như – K26CH Hình 29 Sự thay đổi trình tự DNA, trình tự protein cấu trúc protein dòng đột biến T1.Cas9-ANK(1+2) 58 Lê Thị Như – K26CH KẾT LUẬN Đề tài thu kết sau: Đã phân lập, nhân dòng giải trình tự đẩy đủ gen ANK1, ANK2 Thiết kế cấu trúc vector tăng cường biểu gen ANK1, ANK2 kiểm soát promoter Ubiquitin chuyển thành công vào giống lúa Kitaake Thiết kế thành công cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt riêng rẽ đồng thời hai gen ANK1, ANK2 công nghệ CRISPR/Cas9 chuyển thành công vào giống lúa Kitaake Chọn lọc ba dòng chuyển gen tăng cường biểu gen ANK1 đồng hợp tử, mang bảo T-DNA, biểu gen ANK1 tăng 6-5400 lần so với dòng đối chứng Tuy nhiên chọn dòng tăng cường biểu gen ANK2 với mức độ biểu tăng lần so với đối chứng Chọn lọc dòng đột biến gen ANK1 đồng hợp, ba số tạo protein khơng hồn chỉnh vị trí liên kết với phối tử Đồng thời thu dòng đột biến gen ANK2 đồng hợp, dòng tạo protein khơng hồn chỉnh vị trí tương tác với protein Chỉ chọn dòng đồng hợp đột biến gen ANK1, ANK2, protein đột biến vị trí liên kết với protein khác 59 Lê Thị Như – K26CH KIẾN NGHỊ Từ kết thu đề tài, chúng tơi tiến hành đánh giá kiểu hình cấu trúc bơng dòng chuyển gen tăng cường biểu gen ANK1, ANK2 dòng đột biến để làm sáng tỏ vai trò gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông, đặc biệt tính trạng số gié thứ cấp/bơng số hoa/bơng Bên cạnh đó, biểu gen ANK1, ANK2 mô phân sinh cấu trúc nghiên cứu phương pháp lai chỗ (in situ hybridization) dòng chuyển gen dòng đối chứng Tương tác protein ANK1, ANK2 với phối tử dự đốn sở phân tích tin sinh kiểm định phương pháp lai miễn dịch để từ hiểu sâu chế hoạt động protein ANK1, ANK2 Phần lớn SNPs, Indels tìm thấy vùng promoter gen ANK1, ANK2 nên nghiên cứu phân tích chức promoter gen tiến hành 60 Lê Thị Như – K26CH TÀI LIỆU THAM KHẢO Begum, Hasina, Jennifer E Spindel, Antonio Lalusin, Teresita Borromeo, Glenn Gregorio, Jose Hernandez, Parminder Virk, Bertrand Collard, Susan R McCouch 2015 “Genome-Wide Association Mapping for Yield DNA Other Agronomic Traits in an Elite Breeding Population of Tropical Rice (Oryza Sativa)” PLOS One 10 (3) Linda Breeden, Kim Nasmyth 1987 “Similarity between Cell-Cycle Genes of Budding Yeast DNA Fission Yeast DNA the Notch Gene of Drosophila” Nature 329 (6140) Butt, Haroon, Muhammad Jamil, Jian You Wang, Salim Al-Babili, Magdy Mahfouz 2018 “Engineering plant architecture via CRISPR/Cas9-mediated alteration of strigolactone biosynthesis” BMC Plant Biology 18 Chen, Yingnan, Xiaorong Fan, Wenjing Song, Yali Zhang, Guohua Xu 2012 “Over-Expression of OsPIN2 Leads to Increased Tiller Numbers, Angle DNA Shorter Plant Height through Suppression of OsLAZY1” Plant Biotechnology Journal 10 (2) Chinenov, Yurii, Tonya Schmidt, Xiu-Ying Yang, Mark E Martin 1998 “Identification of Redox-Sensitive Cysteines in GA-Binding Protein-α That Regulate DNA Binding DNA Heterodimerization” Journal of Biological Chemistry 273 (11) Choi, Man Soo, Min Chul Kim, Jae Hyuk Yoo, Byeong Cheol Moon, Sung Cheol Koo, Byung Ouk Park, Ju Huck Lee 2005 “Isolation of a Calmodulin-Binding Transcription Factor from Rice (Oryza Sativa L.)” The Journal of Biological Chemistry 280 (49) Crowell, Samuel, Pavel Korniliev, Alexandre Falcão, Abdelbagi Ismail, Glenn Gregorio, Jason Mezey, Susan McCouch 2016 “Genome-Wide Association DNA High-Resolution Phenotyping Link Oryza Sativa Panicle Traits to Numerous Trait-Specific QTL Clusters” Nature Communications (1) 61 Lê Thị Như – K26CH Dong, Xinnian 2004 “The Role of Membrane-Bound Ankyrin-Repeat Protein ACD6 in Programmed Cell Death DNA Plant Defense” Science’s STKE: Signal Transduction Knowledge Environment 2004 (221) Doyle 1987 “A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissue” 10 Elmendorf, Heidi G., Sally C Rohrer, Rasha S Khoury, Rachel E Bouttenot, Theodore E Nash 2005 “Examination of a Novel Head-Stalk Protein Family in Giardia Lamblia Characterised by the Pairing of Ankyrin Repeats DNA Coiled-Coil Domains” International Journal for Parasitology 35 (9) 11 Garcion, Christophe, Jocelyne Guilleminot, Thomas Kroj, Franỗois Parcy, Jộrụme Giraudat, Martine Devic 2007 AKRP DNA EMB506 are two ankyrin repeat proteins essential for plastid differentiation DNA plant development in Arabidopsis” The Plant journal: for cell DNA molecular biology 48 12 Hashemi, Seyed M., Thomas J Hund, Peter J Mohler 2009 “Cardiac ankyrins in health DNA disease” Journal of molecular DNA cellular cardiology 47 (2) 13 He, Qin, Lin Yang, Wei Hu, Jia Zhang, Yongzhong Xing 2018 “Overexpression of an Auxin Receptor OsAFB6 Significantly Enhanced Grain Yield by Increasing Cytokinin DNA Decreasing Auxin Concentrations in Rice Panicle” Scientific Reports (1) 14 Huang, Jian, Feng Chen, Cecilia Del Casino, Antonella Autino, Mouhua Shen, Shuai Yuan, Jia Peng 2006 “An Ankyrin Repeat-Containing Protein, characterized as a Ubiquitin Ligase, Is Closely Associated with MembraneEnclosed Organelles DNA Required for Pollen Germination DNA Pollen Tube Growth in Lily” Plant Physiology 140 (4) 15 Huang, Jianyan, Xiaobo Zhao, Huihui Yu, Yidan Ouyang, Lei Wang, Qifa Zhang 2009 “The Ankyrin Repeat Gene Family in Rice: Genome-Wide 62 Lê Thị Như – K26CH Identification, Classification DNA Expression Profiling” Plant Molecular Biology 71 (3) 16 Huang, Xianzhong, Qian Qian, Zhengbin Liu, Hongying Sun, Shuyuan He, Da Luo, Guangmin Xia, Chengcai Chu, Jiayang Li, Xiangdong Fu 2009 “Natural Variation at the DEP1 Locus Enhances Grain Yield in Rice” Nature Genetics 41 (4) 17 Huang, Xuehui, Xinghua Wei, Tao Sang, Qiang Zhao, Qi Feng, Yan Zhao, Canyang Li 2010 “Genome-Wide Association Studies of 14 Agronomic Traits in Rice LDNAraces” Nature Genetics 42 (11) 18 Ikeda-Kawakatsu, Kyoko, Masahiko Maekawa, Takeshi Izawa, Jun-Ichi Itoh, Yasuo Nagato 2012 “ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 2/RFL, the Rice Ortholog of Arabidopsis LEAFY, Suppresses the Transition from Inflorescence Meristem to Floral Meristem through Interaction with APO1” The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 69 (1) 19 Jiang, Yingnan, Xiuhua Chen, Xiaodong Ding, Yongsheng Wang, Qiang Chen, Wen-Yuan Song 2012 “The XA21 binding protein XB25 is required for maintaining XA21-mediated Disease Resistance.” The Plant journal: for cell DNA molecular biology 73 20 Khanday, Imtiyaz, Shri Ram Yadav, Usha Vijayraghavan 2013 “Rice LHS1/OsMADS1 Controls Floret Meristem Specification by Coordinated Regulation of Transcription Factors DNA Hormone Signaling Pathways” Plant Physiology 161 (4) 21 Komatsu, M., M Maekawa, K Shimamoto, J Kyozuka 2001 “The LAX1 DNA FRIZZY PANICLE Genes Determine the Inflorescence Architecture of Rice by Controlling Rachis-Branch DNA Spikelet Development” Developmental Biology 231 (2) 22 Kumagai, Hirotaka, Tsuneo Hakoyama, Yosuke Umehara, Shusei Sato, Takakazu Kaneko, Satoshi Tabata, Hiroshi Kouchi 2007 “A Novel Ankyrin-Repeat Membrane Protein, IGN1, Is Required for Persistence of 63 Lê Thị Như – K26CH Nitrogen-Fixing Symbiosis in Root Nodules of Lotus Japonicus” Plant Physiology 143 (3) 23 Kurakawa, Takashi, Nanae Ueda, Masahiko Maekawa, Kaoru Kobayashi, Mikiko Kojima, Yasuo Nagato, Hitoshi Sakakibara, Junko Kyozuka 2007 “Direct Control of Shoot Meristem Activity by a Cytokinin-Activating Enzyme” Nature 445 (7128) 24 Kyozuka, Junko, Hiroki Tokunaga, Akiko Yoshida 2014 “Control of Grass Inflorescence Form by the Fine-Tuning of Meristem Phase Change” Current Opinion in Plant Biology 17 25 Lee, Sung Chul, Wen-Zhi Lan, Beom-Gi Kim, Legong Li, Yong Hwa Cheong, Girdhar K PDNAey, Guihua Lu, Bob B Buchanan, Sheng Luan 2007 “A Protein Phosphorylation/Dephosphorylation Network Regulates a Plant Potassium Channel” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 (40) 26 Li, Meiru, Xiaoxia Li, Zejiao Zhou, Pingzhi Wu, Maichun Fang, Xiaoping Pan, Qiupeng Lin, Wanbin Luo, Guojiang Wu, Hongqing Li 2016 “Reassessment of the Four Yield-Related Genes Gn1a, DEP1, GS3, DNA IPA1 in Rice Using a CRISPR/Cas9 System” Frontiers in Plant Science 7: 377 27 Ma, Xiaosong, Fangjun Feng, Yu Zhang, Ibrahim Eid Elesawi, Kai Xu, Tianfei Li, Hanwei Mei 2019 “A Novel Rice Grain Size Gene OsSNB Was Identified by Genome-Wide Association Study in Natural Population” PLOS Genetics 15 (5) 28 Ma, Xuefeng, Zhijun Cheng, Ruizhen Qin, Yang Qiu, Yueqin Heng, Hui Yang, Yulong Ren 2013 “OsARG Encodes an Arginase That Plays Critical Roles in Panicle Development DNA Grain Production in Rice” The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 73 (2) 29 McCouch, Susan R., Mark H Wright, Chih-Wei Tung, Lyza G Maron, Kenneth L McNally, Melissa Fitzgerald, Namrata Singh 2016 “Open 64 Lê Thị Như – K26CH Access Resources for Genome-Wide Association Mapping in Rice” Nature Communications (1) 30 Miles, Melissa, Michelle Janket, Elizabeth Wheeler, Ansuman Chattopadhyay, Biswanath Majumder, Jeremy Dericco, Elizabeth Schafer, Velpandi Ayyavoo 2005 “Molecular DNA functional characterization of a novel splice variant of ANKHD1 that lacks the KH domain DNA its role in cell survival DNA apoptosis” The FEBS journal 272 31 Mosavi, Leila K., Daniel L Minor, Zheng-Yu Peng 2002 “ConsensusDerived Structural Determinants of the Ankyrin Repeat Motif” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (25) 32 Mou, Shaoliang, Zhiqin Liu, Deyi Guan, Ailian Qiu, Yan Lai, Shuilin He 2013 “Functional Analysis DNA Expressional Characterization of Rice Ankyrin Repeat-Containing Protein, OsPIANK1, in Basal Defense against Magnaporthe Oryzae Attack” PLOS One (3) 33 Nakagawa, Mayu, Ko Shimamoto, Junko Kyozuka 2002 “Overexpression of RCN1 DNA RCN2, Rice TERMINAL FLOWER 1/CENTRORADIALIS Homologs, Confers Delay of Phase Transition DNA Altered Panicle Morphology in Rice” The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 29 (6) 34 Nodzon, Lisa A., Wei-Hui Xu, Yongsheng Wang, Li-Ya Pi, Pranjib K Chakrabarty, Wen-Yuan Song 2004 “The Ubiquitin Ligase XBAT32 Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis” The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 40 (6) 35 Park, Chang-Jin, Tong Wei, Rita Sharma, Pamela C Ronald 2017 “Overexpression of Rice Auxilin-Like Protein, XB21, Induces Necrotic Lesions, up-regulates Endocytosis-Related Genes, DNA Confers Enhanced Resistance to Xanthomonas Oryzae Pv Oryzae” Rice (New York, N.Y.) 10 (1) 36 Pfaffl M W 2001 “A New Mathematical Model for Relative Quantification in Real-Time RT-PCR” Nucleic Acids Research 29 (9) 65 Lê Thị Như – K26CH 37 Sedgwick, S G., S J Smerdon 1999 “The Ankyrin Repeat: A Diversity of Interactions on a Common Structural Framework” Trends in Biochemical Sciences 24 (8) 38 Shan, Qiwei, Yanpeng Wang, Jun Li, Yi Zhang, Kunling Chen, Zhen Liang, Kang Zhang 2013 “Targeted Genome Modification of Crop Plants Using a CRISPR-Cas System” Nature Biotechnology 31 (8) 39 Si, Lizhen, Jiaying Chen, Xuehui Huang, Hao Gong, Jianghong Luo, Qingqing Hou, Taoying Zhou 2016 “OsSPL13 Controls Grain Size in Cultivated Rice” Nature Genetics 48 (4) 40 Ta K N, H Adam, Y M Staedler, J Schönenberger, T Harrop, J Tregear, N V Do, P Gantet, A Ghesquière, S Jouannic 2017 “Differences in Meristem Size DNA Expression of Branching Genes Are Associated with Variation in Panicle Phenotype in Wild DNA Domesticated African Rice” EvoDevo 8: 41 Ta K N, Ngan Giang Khong, Thi Loan Ha, Dieu Thu Nguyen, Duc Chung Mai, Thi Giang Hoang, Thi Phuong Nhung Phung 2018 “A Genome-Wide Association Study Using a Vietnamese LDNArace Panel of Rice (Oryza Sativa) Reveals New QTLs Controlling Panicle Morphological Traits” BMC Plant Biology 18 (1) 42 Xie, Kabin, Bastian Minkenberg, Yinong Yang 2015 “Boosting CRISPR/Cas9 Multiplex Editing Capability with the Endogenous TRNAProcessing System” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112 (11) 43 Xie, Kabin, Yinong Yang 2013 “RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPR-Cas System” Molecular Plant (6) 44 Ya-fang, ZHANG, MA Yu-yin, CHEN Zong-xiang, ZOU Jie, CHEN Tianxiao, LI Qian-qian, PAN Xue-biao, ZUO Shi-min 2015 “Genome-Wide Association Studies Reveal New Genetic Targets for Five Panicle Traits of International Rice Varieties” Rice Science 22 (5) 66 Lê Thị Như – K26CH 45 Yoshida, Akiko, Yoshihiro Ohmori, Hidemi Kitano, Fumio TaguchiShiobara, Hiro-Yuki Hirano 2012 “Aberrant Spikelet DNA Panicle1, encoding a TOPLESS-Related Transcriptional Co-Repressor, Is Involved in the Regulation of Meristem Fate in Rice” The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 70 (2) 46 Yoshida, Hitoshi, Yasuo Nagato 2011 “Flower Development in Rice” Journal of Experimental Botany 62 (14) 47 Zeng, Zhengming, Fangjie Xiong, Xiaohong Yu, Xiaoping Gong, Juntao Luo, Yudong Jiang, Haochi Kuang, Bijun Gao, Xiangli Niu, Yongsheng Liu 2016 “Overexpression of a Glyoxalase Gene, OsGly I, Improves Abiotic Stress Tolerance DNA Grain Yield in Rice (Oryza Sativa L.)” Plant Physiology DNA Biochemistry: PPB 109 48 Zhang, H., D C Scheirer, W H Fowle, H M Goodman 1992 “Expression of Antisense or Sense RNA of an Ankyrin Repeat-Containing Gene Blocks Chloroplast Differentiation in Arabidopsis” The Plant Cell (12) 49 Zhang, Hui, Jinshan Zhang, Pengliang Wei, Botao Zhang, Feng Gou, Zhengyan Feng, Yanfei Mao 2014 “The CRISPR/Cas9 System Produces Specific DNA Homozygous Targeted Gene Editing in Rice in One Generation” Plant Biotechnology Journal 12 (6) 50 Zhang, Yuwen, Yan Liu, Jie Zhang, Guoying Wang, Jianhua Wang, Yunjun Liu 2015 “Assessment of transgene copy number DNA zygosity of transgenic maize overexpressing Cry1Ie gene with SYBR® Green qRTPCR” In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 51 67 Lê Thị Như – K26CH PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG Môi trường Thành phần AGlucose 5g/l ; Difco bacto agar 15 g/l; AB Buffer (K2HPO4 AB 60g/L; NaH2PO4 20g/L); muối AB (NH4Cl 20g/L; MgSO4.7H2O 6g/L; KCl 3g/L; CaCl2 0.2g/L; FeSO4.7H2O 50mg.L-1); Kanamycin 50mg/l; Rifampicin 25 mg/l LB Nền môi trường NB NB-IND Bacto-trypone 10g/l; Bacto-yeast extract 5g/l; NaCl 5g/l; pH = Muối ion N6 (Chu c.s 1975), muối vitamines B5 (Gamborg, Miller, Ojima 1968), 30 g/l sucrose Nền NB + mg/l 2,4 – D, 500 mg/l proline, 500 mg/l glutamine, 300 mg/l casein hydrosate, 4.5 g/l phytagel, Ph = 5.8 Nền NB + 2.5 mg/l 2,4-D, 500 mg/l proline, 500 mg/l glutamine, NB-S 300 mg/l casein hydrolysate,Myo-inositol 100mg/l, 40 mg/l hygromycin, 400 mg/l cefotaxime, 100 mg/l vancomycine, 4.5 g/l agarose, pH = 5.8 Nền môi Muối, vitamines nguồn ion R2, 2.5 mg/l 2,4-D trường R2 R2-CL R2-S R2-CS Nền R2 + 10 g/l glucose, 100mM acetosyringone, pH = 5.2 Nền R2 + 30 g/l sucrose, 40 mg/l hygromycin, 400 mg/l cefotaxime, 100 mg/l, vancomycine, g/l agarose, pH = 5.8 – R2-CL + g/l agarose Nền NB + 500 mg/l proline, 500 mg/l RN glutamine, 300 mg/l casein hydrolysate, Myo-inositol 100mg/l, cytokinine, auxin, 4.5 g/l Phytagel, pH 5.8 Nền môi Muối ion MS trường MS MS-NK Muối nguồn ion MS, 20 g/l sucrose, 0.25 mg/l NAA, 2.5 mg/l kinetin, g/l phytagel, pH = 5.8 68 ... hai gen Các kết nghiên cứu cho thấy ANK1, ANK2 có liên quan đến cấu trúc bơng lúa Để nghiên cứu chức gen này, thực đề tài : Tạo giống lúa Kitaake tăng cường biểu bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan. .. mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 bất hoạt đồng thời ANK1 ANK2 44 Hình 20 Kết sàng lọc dòng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1, ANK2 bất hoạt đồng thời ANK1 ANK2 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -  - Lê Thị Như TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2 LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BƠNG Chun ngành: Di truyền học Mã sớ : 8420101.21