Ảnh hưởng của Catecholamine stress hormones lên độc lực của vi khuẩn vibrios gây bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

Nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng của catecholamine stress hormone Norepinephrine và Dopamine lên độc lực của 4 chủng vi khuẩn bao gồm Vibrio harveyi BB120, Vibrio campbellii LMG21363, Vibrio anguillarum HI610 và Vibrio anguillarum NB10 gây bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ẢNH HƯỞNG CỦA CATECHOLAMINE STRESS HORMONES LÊN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN VIBRIOS GÂY BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (MACROBRACHIUM ROSENBERGII) Nguyễn Thảo Sương1 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng catecholamine stress hormone Norepinephrine Dopamine lên độc lực chủng vi khuẩn bao gồm Vibrio harveyi BB120, Vibrio campbellii LMG21363, Vibrio anguillarum HI610 Vibrio anguillarum NB10 gây bệnh ấu trùng tôm xanh Nghiên cứu in vitro cho thấy, Norepinephrine Dopamine nồng độ 100 µM khơng làm gia tăng độc lực bao gồm khả dung huyết, khả sinh enzyme ngoại bào caseinase, chitinase chủng Vibrio khảo sát Tuy nhiên, việc bổ sung catecholamines làm tăng mạnh khả di động tất chủng Vibrio môi trường thạch mềm Luria- Bertani (LB) có chứa 0,3% agar Trong thí nghiệm in vivo, vi khuẩn V harveyi tăng sinh với catecholamines stress hormone 24 giờ, sau rửa trước đem cảm nhiễm với ấu trùng tôm xanh nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp catecholamines lên ấu trùng Kết cho thấy, việc nuôi cấy V harveyi với Dopamine không làm gia tăng tỉ lệ chết ấu trùng tôm xanh so sánh với lô đối chứng Ngược lại, vi khuẩn V harveyi nuôi cấy với Norepinephrine 100 μM làm gia tăng đột ngột tỉ lệ chết ấu trùng Đây báo cáo ảnh hưởng stress hormone lên vi khuẩn Vibrio gây nhiễm đối tượng tôm xanh M rosenbergii Từ khóa: Macrobrachium rosenbergii, stress hormones, Vibrio I ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng stress sinh vật chủ từ lâu biết đến nhân tố gây ảnh hưởng đến kết trình tương tác vật chủ-vi khuẩn thông qua việc làm suy giảm hệ thống miễn dịch Gần đây, nhiều chứng cho thấy, vi khuẩn gây bệnh đường ruột tồn hệ thống đặc hiệu nhằm phát hormone tiết sinh vật chủ bị stress việc phát hormone làm vi khuẩn gia tăng độc lực (Lyte, 2004) Nhiều thí nghiệm in vitro rằng, stress hormone làm thay đổi khả di động, gia tăng mật độ vi khuẩn, đẩy nhanh trình hình thành màng sinh học (biofilm) (hoặc) làm gia tăng độc lực vi khuẩn gây bệnh (Verbrugghe, 2012) Vì trực tiếp ảnh hưởng lên trình gây bệnh vi khuẩn lên sinh vật chủ Các cơng trình nghiên cứu giới stress hormone khiêm tốn mặt số lượng đa phần thực với nhóm vi khuẩn đường ruột Escherichia coli Vi khuẩn Vibrio nhóm vi sinh vật gây bệnh quan trọng động vật thủy sản, đặc biệt cá giáp xác sống độ mặn cao (Barbieri ctv., 1999) Mặt khác, catecholamine stress hormones tìm thấy cả giáp xác động vật không xương sống (Ottaviani Franceschi, 1995) Bước đầu tìm hiểu mối liên hệ tác nhân gây bệnh Vibrio, stress hormone sinh vật chủ tơm xanh sâu để hồn thiện việc xác định chế gây bệnh, nhằm đề biện pháp phòng trị bệnh hiệu Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: thaosuong_86@yahoo.com.vn 122 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thí nghiệm in vitro 2.1.1 Chuẩn bị chủng vi khuẩn Bốn chủng vi khuẩn Vibrio cung cấp từ phịng thí nghiệm Artemia Reference Center, đại học Gent, Bỉ Các chủng vi khuẩn gây bệnh tăng sinh môi trường LB Broth bổ sung với 12g/l NaCl 24h, sau pha lỗng OD600 đạt giá trị khoảng 0,5 Trong tất thí nghiệm, 10 μl dịch vi khuẩn chuẩn bị nhỏ vào trung tâm đĩa thạch 2.1.2 Thí nghiệm khảo sát khả di động 12ppt, khử trùng 1210C, 20 phút) với mật độ 30 ấu trùng/ống Các ống nghiệm thủy tinh đặt bể hình chữ nhật có chứa nước cất với nhiệt độ trì 28 ± º C Ấu trùng cho ăn hai lần ngày với Artemia (giai đoạn instar II) mật độ Artemia/ ml /ngày Không tiến hành thay nước suốt q trình thí nghiệm Vi khuẩn V harveyi tăng sinh 24h mơi trường LB có bổ sung stress hormone Sau đó, stress hormone loại bỏ nhằm tránh ảnh hưởng tới ấu trùng thí nghiệm cách ly tâm dịch vi khuẩn tốc độ 5000 rpm phút hút bỏ dịch Phần sinh khối cịn lại vi khuẩn bổ sung mơi trường LB Ảnh hưởng catecholamine stress hormone lên di động vi khuẩn kiểm tra cách sử dụng đĩa thạch mềm LB (0,3% agar) bổ sung Dopamine Norepinephrine nồng độ 100 μM Môi trường thạch khơng bổ sung loại stress hormone đóng vai trò đối chứng Dịch vi khuẩn nhỏ lên trung tâm đĩa (10 μl), sau đem ủ tủ ấm 280C Đường kính vùng di động vi khuẩn đo sau 16h 24h Ấu trùng tôm xanh cảm nhiễm với V harveyi nồng độ 106 CFU/ml cách bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường nước nuôi Mỗi nghiệm thức lặp lại lần 2.1.3 Thí nghiệm khảo sát khả dung huyết, thủy phân casein thủy phân chitin LSI = Σ Si/N với Si giai đoạn phát triển ấu trùng tôm xanh thời điểm thu mẫu ( i = tới 12); N số ấu trùng Môi trường thạch máu LB (5% máu cừu), môi trường LB chứa 4% skim milk môi trường LB chứa 0,1% chitin bổ sung với Dopamine Norepinephrine nồng độ 100 μM sử dụng nhằm kiểm tra ảnh hưởng catecholamines stress hormone lên khả dung huyết, thủy phân casein thủy phân chitin chủng Vibrio Tỉ số đường kính vịng suốt xung quanh khuẩn lạc đường kính khuẩn lạc sau 48h dùng để xác định ảnh hưởng stress hormone lên yếu tố độc lực 2.2 Thí nghiệm in vivo Hai mươi bốn sau nở, ấu trùng tôm xanh chuyển vào nuôi ống nghiệm có chứa 100 ml nước biển (độ mặn Chỉ số phát triển giai đoạn ấu trùng (LSI) xác định dựa phương pháp Maddox Manzi (1976) cách thu mẫu ngẫu nhiên 30 ấu trùng từ nghiệm thức ngày kết thúc thí nghiệm LSI sau tính cơng thức: Tỉ lệ sống ấu trùng (%) = Số ấu trùng cịn sống ngày kết thúc thí nghiệm / số ấu trùng ban đầu Ngày kết thúc thí nghiệm xác định ngày tỉ lệ chết lô cảm nhiễm với vi khuẩn không bổ sung thêm stress hormone đạt 50% 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu sau thu thập xử lý one-way ANOVA (phần mềm SPSS 21.0) Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê đề nghị p < 0,05 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng catecholamines lên yếu tố độc lực Vibrios in vitro TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 123 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3.1.1 Ảnh hưởng catecholamines lên khả di động Khả di động yếu tố quan trọng trình gây bệnh Vibrio giúp vi khuẩn nhanh chóng bám vào bề mặt sinh vật chủ (Butler Camilli, 2005; Watnick ctv., 2001) Sử dụng môi trường thạch mềm LB, khảo sát ảnh hưởng catechol- amine stress hormone lên yếu tố độc lực Kết cho thấy, việc bổ sung 100 μM Dopamine Norepinephrine làm tăng mạnh khả di động tất chủng Vibro thử nghiệm với khác biệt ghi nhận sau 16h Đặc biệt, nồng độ, Norepinephrine có tác dụng mạnh so sánh với Dopamine (Bảng 1, 2) Bảng Đường kính vùng di động chủng vi khuẩn gây bệnh Vibrio (mm) sau 16 với bổ sung Dopamine 100 μM Vi khuẩn Đối chứng Dopamine 100 µM BB120 11,7 ± 0,6a 46,0 ± 1,0b LMG21363 26,0 ± 1,0a 45,0 ± 2,6b HI610 22,3 ± 1,2a 42,0 ± 1,0b NB10 29,7 ± 0,6a 51,0 ± 1,0b Số liệu biểu thị giá trị trung bình lần lặp lại độ lệch chuẩn (SD) Số liệu có kí hiệu chữ khác biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p