Mục tiêu chính của luận án là đưa ra cảnh báo nguồn và con đường lây nhiễm S.aureus trong thực phẩm đã chế biến, từ đó đề xuất giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại các bếp ăn tập thể trường tiểu học. Đề xuất giải pháp can thiệp để giảm thiểu mức độ phơi nhiễm Staphylococcus aureus và độc tố của chúng nhằm hạn chế tác hại do Staphylococcus aureus gây ra.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Giang ÁP DỤNG MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP MỚI ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Staphylococcus aureus TẠI CÁC BẾP ĂN TẬP THỂ CỦA MỘT SỐ TRƢỜNG TIỂU HỌC Ở HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Xuân Đà TS Phạm Thế Hải Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở chấm luận án tiến sĩ họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việc phát triển thể chất học sinh tiểu học gắn liền với chế độ dinh dưỡng an toàn thực phẩm Bữa ăn học sinh tiểu học ngày cải thiện đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm, mơ hình cịn nhiều tồn cần khắc phục xảy ngộ độc thực phẩm, nhân viên phục vụ bếp ăn chưa thực quy định người chế biến thực phẩm nên tiềm ẩn nguy lây nhiễm chéo Do vậy, ngộ độc thực phẩm ln nguy rình rập gia đình, bếp ăn tập thể bất chấp cố gắng, nỗ lực quyền nhằm cải thiện an tồn vệ sinh thực phẩm làm để khắc phục tình trạng này? Để giảm nguy ngộ độc thực phẩm, mơ hình kiểm sốt an tồn thực phẩm tiên tiến áp dụng giới mang lại hiệu thiết thực có bước phân tích đánh giá định lượng nguy mối nguy thực phẩm Cách tiếp cận giúp đánh giá mối liên quan mối nguy thực phẩm với rủi ro sức khỏe người, việc mà trước chưa làm Dựa khoa học phân tích mối nguy, quy trình định, phân tích nguy góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh thực phẩm gây liên tục cải thiện an tồn thực phẩm Vì nhiều nguyên nhân điều kiện kinh tế, xã hội, Việt Nam chậm nước việc áp dụng mơ hình phân tích đánh giá nguy để đảm bảo an toàn thực phẩm.Các nghiên cứu ngộ độc thực phẩm nước ta chủ yếu hồi cứu sau ngộ độc thực phẩm xảy để tìm ngun nhân mà chưa có cảnh báo định lượng nguy trước Phương pháp phân tích nguy kết hợp với mơ Monte Carlo đưa số liệu định lượng nguy dự báo nguy tiềm ẩn làm bật nguy tầm quan trọng việc xác định hạn chế mối nguy thực phẩm, làm tăng hiệu tập huấn truyền thông nguy giúp quan quản lý đưa sách cụ thể thiết thực nhằm hạn chế ngộ độc thực phẩm Xuất phát từ điểm phân tích trên, tiến hành luận án với nội dung “Áp dụng số phƣơng pháp để đánh giá định lƣợng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus bếp ăn tập thể số trƣờng tiểu học Hà Nội ” Mục tiêu luận án: - Đánh giá thực trạng ô nhiễm Staphylococcus aureus độc tố chúng chuỗi cung ứng, chế biến, tiêu thụ số thức ăn phổ biến có nguy cao bếp ăn tập thể số trường tiểu học bán trú địa bàn Hà Nội - Mô tả định lượng nguy ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus học sinh tiểu học sở phân tích thực trạng nhiễm S aureus phương pháp đánh giá nguy kết hợp với mô Monte Carlo - Đưa cảnh báo nguồn đường lây nhiễm S.aureus thực phẩm chế biến, từ đề xuất giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu ngộ độc thực phẩm S aureus bếp ăn tập thể trường tiểu học - Đề xuất giải pháp can thiệp để giảm thiểu mức độ phơi nhiễm Staphylococcus aureus độc tố chúng nhằm hạn chế tác hại Staphylococcus aureus gây Nội dung nghiên cứu: - Đánh giá thực trạng ô nhiễm S aureus độc tố chúng chuỗi cung ứng, chế biến, tiêu thụ số thức ăn phổ biến có nguy cao bếp ăn tập thể số trường tiểu học bán trú địa bàn Hà Nội - Đánh giá định lượng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus học sinh tiểu học sở phân tích thực trạng nhiễm S aureus phương pháp đánh giá nguy kết hợp với mô Monte Carlo - Đề xuất giải pháp can thiệp để giảm thiểu mức độ phơi nhiễm Staphylococcus aureus độc tố chúng nhằm hạn chế tác hại Staphylococcus aureus gây Những đóng góp Luận án - Đây cơng trình đánh giá định lượng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus bếp ăn tập thể số trường tiểu học Hà Nội thông qua việc áp dụng phân tích nguy vi sinh vật kết hợp với phương pháp mô Monte Carlo để tăng độ xác dự báo nguy khắc phục số hạn chế hai phương pháp áp dụng riêng rẽ - Đã đánh giá thực trạng ô nhiễm S aureus đưa cảnh báo nguy ngộ độc thực phẩm S aureus số loại thực phẩm nguy cao điều kiện chế biến tiêu thụ bếp ăn tập thể số trường tiểu học Hà Nội - Lần đưa dự báo phơi nhiễm S aureus độc tố chúng điều kiện bảo quản khác bếp ăn tập thể trường tiểu học; - Đưa cảnh báo nguồn đường lây nhiễm S.aureus thực phẩm chế biến, từ đề xuất giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu ngộ độc thực phẩm S aureus bếp ăn tập thể trường tiểu học; Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án: - Nghiên cứu cung cấp mơ hình đánh giá nguy ngộ độc thực phẩm S.aureus số nhóm thực phẩm nguy cao bếp ăn tập thể nói chung bếp ăn trường học nói riêng - Cung cấp chứng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus từ giúp quan quản lý lựa chọn biện pháp can thiệp, quản lý hiệu CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Staphylococcus aureus 1.1.1 Tổng quan Staphylococcus aureus Phân loại Tụ cầu (Staphylococcus) thuộc họ Micrococcaceae, Chi Staphylococcus phân loại thành ba mươi loài loài phân tích sinh hóa lai DNA-DNA Staphylococcus aureus loài chi Staphylococcus liên quan đến ngộ độc thực phẩm S aureus cầu khuẩn Gram dương (đường kính khoảng µm), đứng riêng rẽ, xếp đơi tụ thành đám hình chùm nho Staphylococcus aureus vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy tiện S aureus sinh trưởng dải nhiệt độ rộng (từ 7-48,5oC; tối ưu 30-37oC), pH (từ 4,2-9,3; tối ưu 7-7,50 nồng độ muối lên đến 15% NaCl S aureus sinh nhiều loại enzyme độc tố, enterotoxin độc tố ruột gây nôn tiêu chảy nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm S aureus gây ngộ độc thực phẩm độc tố ruột Các độc tố ngoại độc tố đường tiêu hóa mạnh Các độc tố ruột SEs có khả kháng nhiệt pH thấp vi khuẩn sinh chúng bị tiêu diệt, SEs kháng enzym phân giải protein trypsin pepsin chúng trì hoạt tính đường dày ruột sau thức ăn bị tiêu hóa Đặc điểm phân bố S aureus vi khuẩn gây bệnh hội cư trú bình thường da màng nhày người Ước tính 20 – 30% cư trú thường xuyên 60% cư trú khơng liên tục S aureus thường có bề mặt da khả chịu độ ẩm thấp nồng độ muối cao lên đến 15% Thực phẩm có nguy cao ngộ độc thực phẩm S aureus bao gồm thịt sản phẩm thịt, gia cầm, trứng sản phẩm, sữa sản phẩm sữa, salad, bánh phủ kem, sandwich thực phẩm cần có giai đoạn chuẩn bị tay giữ nhiệt độ cao 4°C thời gian dài sau chế biến 1.1.2 Ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus 1.1.2.1 Ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus Thế giới S aureus nguyên nhân hàng đầu gây hàng loạt vụ ngộ độc toàn giới Ở châu Âu, năm 2009 có 293 vụ Staphylococcus spp độc tố vi khuẩn (của Bacillus, Clostridium Staphylococcus ) gây S aureus nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm với khoảng 241 000 người mắc năm Nhật Bản, Hàn Quốc, S aureus vi sinh vật hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm 1.1.2.2 Ngộ độc thực phẩm S aureus Việt Nam S aureus nguyên nhân gây hàng loạt vụ ngộ độc thực phẩm khắp nước Trong năm 2011,tại thành phố Hồ Chí Minh, S aureus nguyên nhân gây vụ ngộ độc thực phẩm trường tiểu học 01 vụ bếp ăn tập thể khu công nghiệp Liên tiếp năm sau đó, S aureus nguyên nhân gây hàng loạt vụ ngộ độc thực phẩm Sơn la năm 2012, Hà Giang năm 2013 năm 2016, Phú Thọ, Hậu Giang năm 2017 làm hàng trăm học sinh bị ngộ độc 1.1.2.3 Triệu chứng ngộ độc thực phẩm S aureus Ngộ độc thực phẩm S aureus nhiều độc tố ruột gây Triệu chứng thường xuất nhanh (sau 2- giờ, sau 30 phút) bao gồm buồn nôn, nôn mửa dội, đau quặn bụng, có khơng tiêu chảy Trong tất trường hợp bị tiêu chảy kèm theo nôn Ngộ độc độc tố tụ cầu không kèm theo sốt Bệnh thường tự khỏi sau 24 - 48h, nhiên đơi phải nhập viên, đặc biệt với trẻ em, người già người suy giảm miễn dịch Ở vài trường hợp xuất triệu chứng đau đầu, co thay đổi mạch huyết áp thời gian ngắn Người bệnh thường hồi phục sau – ngày có tử vong (nói chung khoảng 0.03%) đơi xảy người già trẻ nhỏ (tỷ lệ chết 4.4%) 1.2 GIẢI PHÁP KIẾM SỐT AN TỒN THỰC PHẨM 1.2.1 Biện pháp kiểm sốt an tồn thực phẩm Thế giới Chính phủ nước phát triển thực bước để cải thiện tăng cường hệ thống quản lý an toàn thực phẩm Một số nước từ bỏ phương pháp truyền thống tập trung vào kiểm soát sản phẩm cuối q trình mà thay vào thực hoạt động dựa khoa học (phân tích mối nguy điểm kiểm sốt tới hạn-HACCP, đánh giá nguy cơ…) để đưa định công việc 1.2.2 Biện pháp kiếm sốt an tồn thực phẩm Việt Nam 1.2.2.1 Biện pháp kiểm sốt an tồn thực phẩm Trong năm qua, để tăng cường hiệu kiếm sốt an tồn thực phẩm, Chính phủ triển khai nhiều biện pháp: Về chế sách (ban hành Luật, thông tư, Nghị định…) Hệ thống tổ chức, quản lý ATVSTP (phân cấp quản lý Bộ Nghành), Các mơ hình điểm đảm bảo ATVSTP: 1.2.2.2 Các tồn kiểm soát ATTP Số sở vi phạm an toàn thực phẩm cao; Tình hình ngộ độc thực phẩm cịn diễn biến phức tạp đặc biệt số ca tử vong NĐTP cịn xảy có chiều hướng tăng bữa ăn hộ gia đình… Tỉ lệ BĂTT trường học đảm bảo điều kiện ATVSTP theo qui định Bộ y tế số tỉnh thấp dao động từ 30,9% - 53,1% Tỉ lệ mẫu bàn tay người chế biến thực phẩm nhiễm vi sinh vật (Coliforms) cao 50% 14,6% nhân viên bốc thức ăn tay có 40,7% nhân viên có móng tay dài, bẩn (tại số trường Hà Nội) Vẫn cịn tình trạng gian dối nguồn gốc thực phẩm, cung cấp thực phẩm không đảm bảo an toàn… 1.2.2.3 Biện pháp khắc phục tồn Để góp phần nâng cao hiệu cơng tác bảo đảm an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe cộng đồng, cần áp dụng biện pháp tiên tiến giới như: Xây dựng hệ thống cảnh báo nhanh phân tích nguy an tồn thực phẩm, Áp dụng phương pháp đại nghiên cứu, điều tra nguyên nhân ngộ độc thực phẩm 1.3 ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ VI SINH VẬT - CÁCH TIẾP CẬN MỚI/ ƢU VIỆT TRONG KIỂM SOÁT AN TỒN THỰC PHẨM Trong thập kỷ qua, Phân tích nguy - thuật ngữ trình bao gồm đánh giá nguy cơ, quản lý nguy truyền thơng nguy - trở thành mơ hình đại hiệu để tăng cường hệ thống kiểm soát thực phẩm với mục tiêu sản xuất thực phẩm an toàn hơn, giảm số lượng bệnh thực phẩm gây tạo thuận lợi cho giao thương thực phẩm nước quốc tế Cách tiếp cận giúp đánh giá mối liên quan mối nguy thực phẩm với rủi ro sức khỏe người, việc mà trước chưa làm Dựa khoa học phân tích mối nguy, quy trình định, phân tích nguy góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh thực phẩm gây liên tục cải thiện an toàn thực phẩm Tại Việt Nam, thực tế phân tích nguy nói chung đánh giá nguy nói riêng chưa áp dụng nhiều cịn nhiều hạn chế trình độ, nguồn lực lẫn kinh phí thực 1.3.1 Khái niệm đánh giá nguy Mối nguy (hazard): yếu tố sinh học, hóa học vật lý làm cho thực phẩm khơng an tồn sử dụng Nguy (Risk): nguy khả (mức độ) xảy ảnh hưởng bất lợi lên sức khỏe nhiều hay ít, nặng hay nhẹ Nguy (risk) = mối nguy (hazard) + phơi nhiễm (exposure) Đánh giá nguy (risk assessment): Đánh giá nguy gồm bốn bước chính: (i)Xác định (nhận dạng) mối nguy; (ii) mơ tả mối nguy (bao gồm phân tích liều- đáp ứng); (iii) đánh giá phơi nhiễm (iv) mô tả nguy 1.3.3 Phân loại đánh giá nguy vi sinh vật Có hai loại đánh giá nguy cơ: Đánh giá nguy định lượng đánh giá nguy định tính 1.3.4 Phƣơng pháp nhận dạng mối nguy đánh giá nguy vi sinh vật Nhận dạng mối nguy vi sinh vật nhận biết vi sinh vật độc tố vi sinh thực phẩm liên quan Các mối nguy xác định từ nguồn liệu liên quan Thông tin mối nguy thu từ tài liệu khoa học, từ sở nghành công nghiệp thực phẩm, quan quản lý tổ chức có liên quan thơng qua lấy ý kiến chuyên gia Thông tin liên quan bao gồm liệu lĩnh vực như: nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ điều tra, nghiên cứu động vật phịng thí nghiệm, điều tra đặc tính vi sinh vật, tương tác vi sinh vật môi trường thông qua chuỗi thực phẩm từ sản xuất ban đầu đến tiêu dùng nghiên cứu vi sinh vật tình tương tự 1.3.5 Phƣơng pháp mô tả mối nguy đánh giá nguy vi sinh vật Mơ tả định tính định lượng mức độ nghiêm trọng thời gian ảnh hưởng bất lợi bắt nguồn từ việc ăn vào vi sinh vật độc tố thực phẩm Việc đánh giá liều đáp ứng cần thực thu liệu Tính chất mơ tả mối nguy thiết lập mối quan hệ liều đáp ứng lý tưởng Khi thiết lập mối quan hệ tương quan, cần xem xét đến điểm kết thúc khác lây nhiễm bệnh tật Khi chưa biết mối quan hệ liều đáp ứng, cần sử dụng công cụ đánh giá nguy dùng tư vấn chuyên gia để xem xét yếu tố khác nhau, mức độ lây nhiễm để mô tả đặc trưng mối nguy 10 1.3.7 Đánh giá không chắn Trong tồn quy trình đánh giá nguy cơ, tất bước có không chắn kết bước Do vậy, kết đánh giá nguy đưa phải kèm theo không chắn (độ không đảm bảo đo) phương pháp CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Gồm người chế biến thực phẩm; sở hạ tầng, dụng cụ chế biến thực phẩm, số nhóm thực phẩm 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Các BĂTT trường tiểu học bán trú thuộc 12 Quận nội thành Hà Nội; Viện Kiểm nghiệm ATVSTPQG 2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 2.2.1 Hóa chất, mơi trƣờng, chủng chuẩn Các hóa chất dùng để nuôi cấy S aureus (Bair paker agar ), phân tích gen sinh độc tố (bộ KIT tách chiết, KIT Tetra…), phân tích đa dạng di truyền (EnzymeSmaI, XbaI…), chủng chuẩn từ ATCC) 2.2.2 Trang thiết bị Máy realtime PCR, máy chụp ảnh điện di trường xung, tủ ấm nuôi cấy… 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 phƣơng pháp thu thập mẫu để đánh giá ô nhiễm S aureus 2.3.1.1 Cỡ mẫu chọn mẫu Cỡ mẫu tính theo cơng thức Ssize WHO chọn mẫu theo tiêu chuẩn hành 2.3.1.2 Lấy mẫu thực phẩm: Theo quy định hành 12 2.3.1.3 Phương pháp lấy mẫu dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm, mẫu vệ sinh bàn tay: Thực theo TCVN 8129:2009 2.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng S aureus thực phẩm Thực theo TCVN 4830-1:2005 2.3.3 Phƣơng pháp phân tích gen sinh độc tố dựa kĩ thuật PCR Phân tích 05 gen độc tố sea, seb, sec, see, sed máy realtime PCR 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích độc tố ruột SEs Thực theo hướng dẫn KIT Tetra 3M, phân tích độc tố ruột SEA,SEB, SEC, SED, SEE 2.3.5 Phƣơng pháp điện di trƣờng xung PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Các chủng S aureus thuộc mẫu khác phân tích PFGE để so sánh mối quan hệ lồi từ xác định nguồn gốc lây nhiễm vào thực phẩm đa dạng chủng S aureus 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá định lƣợng nguy S aureus 2.3.6.1 Nhận dạng mối nguy (hazard identification): giúp chứng minh S aureus mối nguy sức khỏe người mối nguy bếp ăn tập thể trường học 2.3.6.2 Mô tả mối nguy: Xác định liều- phản ứng 2.3.6.3 Đánh giá phơi nhiễm S aureus thực phẩm: phương pháp thực kết hợp tiêu chuẩn, hướng dẫn, thực nghiệm để đưa tỉ lệ nhiễm, nồng độ nhiễm 2.3.6.4 Mô tả nguy sử dụng phần mềm @RISK để ước tính nguy ngộ độc thực phẩm S.aureus 13 2.3.7 Phƣơng pháp đánh giá phần điều tra kiến thức, thái độ, thực hành ATTP (KAP) 2.3.7.1 Điều tra phần: Để tính tần suất lượng thực phẩm tiêu thụ học sinh, giúp cho việc đánh giá phơi nhiễm, liều nhiễm S aureus 2.3.7.2 Điều tra KAP Thực điều tra câu hỏi dựng sẵn Mục đích để nhận dạng vấn đề tồn an tồn thực phẩm mối nguy có 2.3.7.3 Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 18,Epidata, @risk CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 THỰC TRẠNG NHIỄM STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ ĐỘC TỐ 3.1.1 Sự ô nhiễm S aureus độc tố chúng nguyên liệu chế biến thực phẩm Nhóm nghiên cứu thu thập 85 mẫu thực phẩm nguyên liệu sống tiến hành phân tích Staphylococcus aureus theo quy trình chuẩn TCVN 4830-1:2005 phân tích độc tố ruột tụ cầu (SETs) theo KIT ELISA với loại độc tố SEA, SEB, SEC, SED, SEE, kết thu bảng 3-.1 hình 3-1 Bảng 3-1 Kết xét nghiệm mẫu nguyên liệu nhiễm S aureus Loại thưc phẩm Thịt lợn Thịt bò Thịt gà Thực phẩm khác Tổng số mẫu Kết xét nghiệm S aureus (CFU/g) ngoại độc tố SETs Số số mẫu bị nhiễm SETs mean SD max mẫu S aureus 38 13 Âm tính 211 109 15 340 Âm tính 127 168 20 320 13 Âm tính 160 212 10 310 29 Âm tính 85 14 Kết (Bảng 3-1) cho thấy loại thực phẩm sống xét nghiệm có loại thịt lợn, bị, gà phát bị nhiễm S aureus với nồng độ nhiễm trung bình 211CFU/g; 127 CFU/g 160 CFU/g Tỉ lệ mẫu thực phẩm sống nhiễm S aureus 21,2% (n=85) thịt lợn, thịt bị thịt gà chiếm tỉ lệ 15,3%, 3,5% 2,4% (hình 3-1) So sánh với quy định 46/2007/QĐ-BYT, mức nhiễm S aureus tối đa cho phép 100 CFU/g Do vậy, mức nhiễm trung bình khơng đạt so với quy định Số mẫu thịt sống không đạt chiếm 14,1% (12/85 mẫu) 3.1.2 Sự ô nhiễm S aureus độc tố chúng thực phẩm sau chế biến trƣớc tiêu thụ Nhóm nghiên cứu thực lấy mẫu theo kế hoạch 36 trường thuộc 12 Quận nội thành Hà Nội, tổng số mẫu lấy 166 mẫu thực phẩm thuộc nhóm trứng, thịt, cá, sữa, ngũ cốc Kết thể bảng 3-2 hình 3-2 Bảng 3-2 Kết xét nghiệm S aureus ngoại độc tố mẫu thực phẩm sau chế biến trước tiêu thụ Kết xét nghiệm S aureus (CFU/g) ngoại độc tố SETs Thực phẩm tổng số số mẫu bị nhiễm mẫu S aureus thịt lợn 58 Trứng SETs mean SD Min Max Âm tính 290 500 100 1500 11 Âm tính 320 321 30 850 Bánh 16 Âm tính 2413 3376 25 4800 Thịt bị Âm tính 3000 Thịt gà 15 Âm tính 200 Phở, bún 11 Âm tính 6500 Thực phẩm Âm tính khác 48 Tổng 166 15 Kết (Bảng 3-2) cho thấy tổng số mẫu nhiễm S aureus 16 mẫu chiếm 9,64% (n=166) Nhóm mẫu bị nhiễm cao thịt lợn sau trứng So sánh kết mẫu bị nhiễm S aureus với quy định 46\2007\BYT cho thấy 100% mẫu không đạt trường hợp cảnh báo giới hạn ô nhiễm S aureus thực phẩm (Bảng 3-3) Kết (Bảng 3-3) cho thấy số 36 trường nghiên cứu 14 trường có mẫu thực phẩm khơng đạt S aureus theo quy định chiếm 38,9% 3.1.3 Sự ô nhiễm S aureus dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm bàn tay ngƣời chế biến thực phẩm Thực lấy mẫu bàn tay người chế biến thực phẩm 122 người trực tiếp chế biến thực phẩm 82 mẫu dụng cụ tiếp xúc,chứa đựng thực phẩm để xét nghiệm S aureus Tất mẫu sau lấy vận chuyển phịng thí nghiệm vi sinh vật Viện kiểm nghiệm tiến hành phân tích vịng 1-4 h Kết thu thể bảng 3.4 hình 3.4 16 Bảng 3-4: Tỉ lệ nhiễm S aureus dụng cụ bàn tay người chế biến thực phẩm Bàn tay Dụng cụ Tổng mẫu dương tính 28 34 Tổng số 122 82 204 22,35% 7,32% 16,67% tỉ lệ % Kết cho thấy tỉ lệ người chế biến thực phẩm mang S aurues bàn tay 22,35%, tỉ lệ dụng cụ chê biến, chứa đựng thực phẩm nhiễm S aureus 7,32% tỉ lệ nhiễm tính trung bình bàn tay dụng cụ 16,67% 3.1.4 Tỉ lệ chủng S aureus chứa gen gây độc chuỗi cung ứng, chế biến thực phẩm Thực phân tích PCR đa mồi với tổng số 68 mẫu dương tính với S aureus (34 mẫu từ bàn tay, dụng cụ chứa đựng chế biến thực phẩm; 18 mẫu từ thực phẩm sống; 16 mẫu từ thực phẩm chín) kết thu Hình 3.6 Hình 3-7: Kết điện di chủng dƣơng tính với gen sinh độc tố (sea-520bp; seb-163bp; sec-283bp) 17 Tỉ lệ mẫu chứa dương tính với gen sinh độc tố 20,6% (n=68), mẫu bàn tay, mẫu thớt, mẫu thực phẩm dương tính với gen độc tố chiếm 16,2%, 2,9% 1,5% tính tổng số nhóm mẫu phân tích (n=68) Các gen độc tố phân tích gồm sea, seb, sec, sed, see Kết cho thấy gen sec phát mẫu từ bàn tay, thức ăn chín, dụng cụ chiếm tổng số 92,8% tổng mẫu có gen độc tố phát (n=14), gen sea phát mẫu bàn tay chiếm 7,1% gen seb phát với gen sec mẫu bàn tay 3.2 SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC CHỦNG S aureus TRONG CHUỖI CUNG ỨNG THỰC PHẨM Trong chủng thu từ đối tượng mẫu trường, chúng tơi tiến hành phân tích PFGE xem mối quan hệ chủng thu trường lựa chọn: Dựa vào biểu đồ phân tích cho thấy chủng S aureus phân cắt thành số đoạn khác (≥ 12-20 đoạn) với độ tương đồng ≥ 80% có nhóm chủng (clusters) nhận dạng Kết cho thấy đa dạng cao chủng S aureus phân lập được, có nhóm chủng có quan hệ gần gũi (độ tương đồng ≥ 80% hay sai khác ≤ đoạn) nhóm có tương đồng 100% chứng tỏ chúng có lây nhiễm chéo đối tượng mẫu, thực phẩm dụng cụ chứa đựng thực phẩm (trường TH33), người chế biến-thực phẩm- dụng cụ chứa đựng thực phẩm (trường TH18), người chế biến với thực phẩm (TH8, TH25), thực phẩm với thực phẩm (trường TH35) 3.3 MÔ TẢ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Staphylococcus aureus 3.3.1 Nhận dạng mối nguy (Hazarard Identification) 3.3.1.1 Staphylococcus aureus mối nguy sức khỏe người Bằng phương pháp nghiên cứu tổng quan tài liệu từ báo cáo ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam tài liệu khoa học khác cho thấy S aureus mối nguy sức khỏe người 18 3.3.1.2 Staphylococcus aureus mối nguy bếp ăn tập thể trường tiểu học Hà Nội Thực nghiên cứu điều tra, khảo sát an toàn vệ sinh thực phẩm bếp ăn tập thể trường tiểu học nội thành Hà Nội năm 2015 cho thấy: Mặc dù kết cho thấy tỉ lệ bếp ăn trường học thực quy định hồ sơ pháp lý sổ sách ghi chép nguồn gốc thực phẩm, lưu mẫu thực phẩm đạt tỉ lệ cao > 94%, tỉ lệ BĂTT đạt điều kiện ATTP chung, điều kiện vệ sinh dụng cụ, vệ sinh sở, kiến thức ATTP người chế biến thực phẩm đạt ≥ 70% tình trạng nhiễm S aureus chuỗi sản xuất, chế biến thực phẩm trường tiểu học Hà Nội tồn tại, cụ thể: Cịn tình trạng nhiễm S aureus bàn tay người chế biến chiếm dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm, thực phẩm sống,thực phẩm chín 3.3.2 Mơ tả mối nguy (Hazard characerization) Trong đánh giá nguy sức khỏe S aureus ô nhiễm thực phẩm, nghiên cứu áp dụng mơ hình hàm số mũ, mơ tả Hass cộng (1999): Trong đó, P xác suất bị bệnh, d số lượng S aureus tiêu thụ (cfu/ phần ăn), r xác suất tế bào đơn S aureus gây bệnh Nhiều y văn kinh điển nghiên cứu chủ đề sử dụng hệ số r=7,64x10-8 3.3.3 Đánh giá phơi nhiễm (exposure assessment) Dựa vào phân tích đường phơi nhiễm S aureus bếp ăn tập thể, tiến hành đánh giá phơi nhiễm giai đoạn sau chế biến trước tiêu thụ 3.3.3.1 Tỉ lệ thức ăn chín (thịt lợn, trứng) bị nhiễm S aureus Tổng số mẫu thức ăn xét nghiệm nhiễm S aureus 69 mẫu, gồm 58 mẫu thức ăn từ thịt lợn 11 mẫu thức ăn từ trứng gia cầm Kết phân tích thể bảng 3.6 19 Bảng 3-8: nhiễm S aureus thức ăn chín bếp ăn tập thể trường học ết Thức ăn Số mẫu Thịt lợn Trứng gia cầm t nghiệm S aureus (CFU/g) Số Tỉ lệ mẫu (%) Mean SD Median Min Max (+) 58 12,1 390 500 400 100 1500 11 36,4 320 321 300 30 850 Kết bảng cho thấy: tỉ lệ nhiễm S aureus ăn chế biến từ thịt lợn 12,1% Trong mẫu có phát nhiễm nồng độ trung bình S aureus 390 CFU/g thức ăn dao động khoảng từ 100 – 1500 CFU/g 3.3.3.2 Mức tiêu thụ trứng gia cầm thịt lợn học sinh tiểu học Tổ chức kiểm tra hồ sơ xuất nhập, cân đong thực phẩm bếp ăn giai đoạn trước làm sạch, nấu chín, sau ăn cịn lại Số liệu phần nhập phần mềm Access phần mềm SPSS 18 với test thống kê y học để phân tích số liệu Kết thu thể bảng 3-9 Bảng 3-9 Mức tiêu thụ trứng gia cầm thịt lợn học sinh tiểu học STT Nhóm thực Bình qn tiêu thụ Tần suất tiêu thụ phẩm (gram/ngƣời/ ngày) [lần/tuần (5 ngày)] µ± SD Thịt lợn 95,7 ± 63,2 Trứng 15,9 ± 20,1 20 Bảng 3-9 cho thấy: Thịt lợn tiêu thụ với tần suất nhiều lần/tuần (5 ngày) với lượng 95,7 ± 63,2 (gram/người/ ngày), Trứng gia cầm tiêu thụ với tần suất lần/tuần (5 ngày) với lượng 15,9 ± 20,1 (gram/người/ ngày) 3.3.3.3 Liều nhiễm S aureus học sinh ăn thịt lợn trứng Từ kết đánh giá phơi nhiễm điều tra phần ăn giúp xác định liều nhiễm gặp phải học sinh ăn thịt lợn trứng gia cầm trường kết thể bảng 3-10 Bảng 3-10 Liều nhiễm S aureus lần ăn thịt lợn trứng gia cầm STT Nhóm thực Tỉ lệ nhiễm Liều nhiễm (d) phẩm (CFU/g) (CFU/khẩu phần ăn) Thịt lợn 390 37,3 Trứng 320 Kết bảng cho thấy: liều nhiễm S aureus lần ăn thịt lợn 37,3 (CFU/ phần ăn) cao so với ăn trứng (CFU/ phần ăn) lượng phần ăn thịt cao trứng 3.3.4 Mô tả nguy nhiễm độc S aureus học sinh ăn thịt lợn trứng gia cầm Bảng 3-11 Nguy nhiễm S aureus sau lần ăn thức ăn bị ô nhiễm Thực phẩm Nhỏ Trungbình Lớn Thịt lợn 3,4x10 33x10-4 Trứng 1,4x10-4 14x10-4 Trứng thịt lợn 4,9x10-4 37x10-4 -4 Kết nghiên cứu cho thấy, nguy nhiễm độc ăn thức ăn nhiễm S aureus thay đổi tùy theo mức độ ô nhiễm thức ăn khối lượng thức ăn vào Trong nghiên cứu này,nguy nhiễm độc trung bình 21 ăn thịt lợn bị ô nhiễm S aureus 3,4x10-4 , trứng bị ô nhiễm S aureus 1,4x10-4 (bảng 3-11)… Bên cạnh việc đánh giá riêng rẽ loại thức ăn, thực tế cho thấy trường hợp học sinh ăn trứng thịt bữa ăn gặp phải Với giả thuyết thịt lợn trứng chế biến ăn riêng biệt xác định nhiễm S aureus mô tả nghiên cứu Nguy nhiễm độc S aureus ăn thịt trứng bị ô nhiễm học sinh trung bình 4,85 x 10-4 , nghĩa 10000 học sinh ăn thức ăn bị nhiễm có gần em bị nhiễm độc (biểu đồ 3-5), khoảng tin cậy 90% 0,078 x 10-4 – 12,08 x10-4 Bảng 3-12 Nguy nhiễm độc S aureus tháng ăn thức ăn bị ô nhiễm Thực phẩm Nhỏ Trungbình Lớn Thịt lợn 41,1x10-4 402x10-4 Trứng 5,7x10-4 52,4x10-4 Trứng thịt lợn 19,4x10-4 134x10-4 Nhiễm độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm đơi xuất q trình nhiễm độc mạn tính lâu ngày Kết cho thấy, với mức độ ô nhiễm thức ăn tần suất ăn thịt lợn trứng học sinh nguy trung bình nhiễm độc thịt lợn trứng bị nhiễm S aureus 41,1x10-4 5,7x10-4 (bảng 3-3) 3.4 BÀN LUẬN Bằng cách sử dụng kết hợp phương pháp điều tra cắt ngang, lấy mẫu thực phẩm chín phân tích theo quy trình chuẩn (tiêu chuẩn Việt Nam) với phương pháp xác suất thống kê, mô Monte Carlo, với khoảng tin cậy 90% giá trị nguy cơ, nghiên cứu mô tả chi tiết giá trị trung bình nguy nhiễm độc học sinh ăn thực phẩm từ thịt lợn trứng bị nhiễm S aureus trường Đây điểm ưu việt mà nghiên cứu cắt ngang trước chưa thực 22 Ngồi ra, sử dụng mơ hình tốn học với mơ Monte-Carlo để mô tả nguy nhiễm độc học sinh ăn thức ăn bị ô nhiễm S aureus giúp khắc phục số hạn chế nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ, tỷ lệ dương tính mẫu không lớn, loại thức ăn chưa đa dạng Tuy nhiên, q trình áp dụng mơ hình đánh giá nguy nghiên cứu gặp số hạn chế, thuộc tính khơng chắn Tính khơng chắn thuộc tính vốn có đánh giá nguy nói chung đánh giá nguy S aureus nói riêng Do hạn chế nguồn liệu kinh phí nên nghiên cứu bắt buộc phải ứng dụng hệ số lây nhiễm S aureus mơ hình hàm số mũ theo kinh điển y văn Việc áp dụng đưa đến sai số định chủng S aureus phân lập từ nghiên cứu có độc tính khác nhiều so với chủng S aureus sử dụng đánh giá liều – đáp ứng kinh điển Ngoài ra, yếu tố đối tượng nghiên cứu yếu tố tạo không chắn Đối tượng nghiên cứu học sinh tiểu học Việt Nam có mức đáp ứng khác so với đối tượng mô tả thực nghiệm đánh giá liều đáp ứng kinh điển Mẫu thức ăn xét nghiệm nghiên cứu không thực đồng Cách chế biến loại thức ăn dù từ nguyên liệu thịt lợn cách chế biến luộc, rán phối hợp với thực phẩm khác đưa tới xác suất ô nhiễm khác nhau, dẫn tới nguy nhiễm độc khác cho người ăn Do điều kiện hạn chế kinh phí thời gian nên lượng mẫu nhỏ ảnh hưởng đến tính đại diện mẫu cho cộng đồng nghiên cứu Các yếu tố sinh lý học sinh đối tượng nghiên cứu tuổi, giới chưa mơ tả mơ hình Ngồi ra, nhiễm S aureus khơng có thịt lợn, trứng mà cịn xuất nhiều ăn khác học sinh bếp ăn tập thể trường học nhiều nguồn khác theo lý thuyết lây nhiễm chéo 23 chuỗi tiêu dùng thực phẩm Do vậy, nguy nhiễm độc học sinh S aureus thực tế cao 3.5 ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP CAN THIỆP Giải pháp đề xuất sau: (1) Thiết kế chương trình giáo dục, tuyên truyền cộng đồng giữ gìn an tồn thực phẩm vệ sinh cá nhân tảng việc ngăn ngừa vụ ngộ độc thực phẩm tụ cầu gây ra; (2) Thực áp dụng nghiêm ngặt hướng dẫn kiểm soát mối nguy chương trình kiểm sốt điểm trọng yếu (HACCP-Hazard Analysis and Critical Control Point), thực hành sản xuất tốt (GMPs- Good Manufacturing Practice) thực hành vệ sinh tốt (GHPs- Good hygienic Practices) phát triển tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quan quản lý thuốc-mỹ phẩm-thực phẩm Mỹ (FDA) Các chương trình kiểm soát mối nguy nên đưa vào quy định bắt buộc cho sở chế biến thực phẩm đặc biệt bếp ăn tập thể trường học: 24 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu “Áp dụng số phương pháp để đánh giá định lượng nguy ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus bếp ăn tập thể số trường tiểu học Hà Nội”, luận án có kết luận sau Thực trạng ô nhiễm Staphylococcus aureus độc tố chúng chuỗi cung ứng, chế biến số thức ăn phổ biến bếp ăn tập thể số trường tiểu học bán trú địa bàn Hà Nội: a Tỉ lệ ô nhiễm S aureus độc tố chúng nguyên liệu chế biến thực phẩm 21,17% (n=85), thực phẩm chín 9,64% (n=166) khơng đạt theo quy định 46/2007/BYT.khơng có độc tố SEA, SEB, SEC, SED b Tỉ lệ nhiễm S aureus dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm 7,32% người chế biến thực phẩm mang S aureus bàn tay 22,35% c Tỉ lệ chủng S aureus chứa gen gây độc (sea, seb, sec) chuỗi cung ứng, chế biến thực phẩm 20,2%% (n=70), bàn tay chiếm 36,7% (n=30), dụng cụ chế biến chiếm 66,7% (n=3) thực phẩm chín 6,25% (n=16) d Các chủng S aureus có đa dạng di truyền cao: có clusters với độ tương đồng ≥ 80%, có lây nhiễm chéo đối tượng mẫu, thực phẩm dụng cụ chứa đựng thực phẩm (trường TH33), người chế biến – thực phẩm – dụng cụ chứa đựng thực phẩm (trường TH18), thực phẩm với thực phẩm (trường TH35) (độ tương đồng 100%) Nguy ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus học sinh tiểu học ăn số thức ăn phổ biến (thịt trứng gia cầm) trường: Nguy ngộ độc trung bình học sinh tiểu học ăn thịt lợn trứng nhiễm S aureus xác định 3,4x10-4 1,4x10-4 4,9 x 10-4 ăn thịt lợn trứng bị ô nhiễm 25 Đề xuất biện pháp can thiệp Đã đề xuất biện pháp đào tạo áp dụng HACCP để nâng cao hiệu kiểm sốt an tồn thực phẩm bếp ăn tập thể nói chung KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Kiến nghị thực đánh giá nguy mối nguy vi sinh vật khác để có tranh toàn diện nguy ngộ độc thực phẩm vi sinh vật học đường để cung cấp chứng ATTP cho quan quản lý lựa chọn áp dụng biện pháp can thiệp, truyền thông nguy hiệu từ phịng ngừa giảm thiểu ngộ độc thực phẩm vi sinh vật học đường Xây dựng mơ hình điểm HACCP bếp ăn tập thể trường học đánh giá hiệu từ nhân rộng mơ hình tồn quốc 26 ... trên, tiến hành luận án với nội dung ? ?Áp dụng số phƣơng pháp để đánh giá định lƣợng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus bếp ăn tập thể số trƣờng tiểu học Hà Nội ” Mục tiêu luận án: - Đánh giá thực. .. mô tả nguy 1.3.3 Phân loại đánh giá nguy vi sinh vật Có hai loại đánh giá nguy cơ: Đánh giá nguy định lượng đánh giá nguy định tính 1.3.4 Phƣơng pháp nhận dạng mối nguy đánh giá nguy vi sinh vật... bàn Hà Nội - Đánh giá định lượng nguy ngộ độc thực phẩm S aureus học sinh tiểu học sở phân tích thực trạng nhiễm S aureus phương pháp đánh giá nguy kết hợp với mô Monte Carlo - Đề xuất giải pháp