Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV-TYPE 1

Mục tiêu nghiên cứu đề tài là điều tra được sự có mặt của các chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật Việt Nam thông qua pepsin, một protease aspartyl mang những đặc điểm tương đồng trong cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác với protease HIV-1. Thu nhận và tinh sạch được một số chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật. Xác định được cấu trúc, tính chất và đánh giá được cơ chế tác dụng của một số chất ức chế protease HIV-1 đã thu nhận được.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Dũng NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT NGUỒN GỐC THỰC VẬT ỨC CHẾ PROTEASE CỦA HIV-TYPE Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Bùi Phương Thuận Phản biện 1: ……………… Phản biện 2: ……………… Phản biện 3: ……………… Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi …giờ 00, ngày … tháng … năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam, - Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây virus gây suy giảm miễn dịch người (HIV) Virus có hai type HIV-1 HIV-2, nhóm xuất phổ biến nguyên nhân gây AIDS Cho đến nay, dù có chương trình hành động toàn cầu với phát triển phương pháp điều trị, AIDS đại dịch tồn nhân loại Theo chương trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2017), tính đến tháng năm 2017, giới có khoảng 36,7 triệu người mang bệnh HIV/AIDS, số đối tượng nhiễm 1,8 triệu người có khoảng triệu bệnh nhân chết AIDS năm 2016 Ở Việt Nam, theo số liệu Cục phòng chống HIV/AIDS, Bộ Y tế (Báo cáo số 958/BC-BYT Cục phòng chống HIV/AIDS, ngày 31/8/2017) tháng đầu năm 2017, số người x t nghiệm phát nhiễm HIV 4.541 người, số người nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS 2.321 người, số người nhiễm HIV t vong 799 Số người nhiễm HIV lũy tiến c n sống 209.591 người, số bệnh nhân AIDS 90.190 số t vong 90.980 người HIV-1 có hệ gen nằm phần lõi virus bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb có gen mã hóa cho 15 protein khác Trên sợi RNA có gen cấu trúc gag, pol env; gag có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol “polymerase” env “envelope” vỏ Các gen gag env mã hóa cho nucleocapsid glycoprotein màng virus; gen pol mã hóa cho enzyme reverse transcriptase, integrase protease Ngồi ra, HIV-1 cịn có gen (vif, vpu, vpr, tat, rev nef) vùng RNA kb (Hoffmann tập thể, 2007) Protease HIV-1 enzyme khơng thể thiếu chu trình sống virus Nó cắt chuỗi polypeptide gag, gag-pol vị trí định để tạo thành protein cấu trúc enzyme cần thiết cho virus hoàn chỉnh Các đột biến điểm làm bất hoạt protease dẫn đến tạo dịng virus HIV-1 khơng hồn chỉnh khơng có khả nhiễm vào tế bào chủ Vì có vai trị quan trọng q trình nhân lên HIV-1 nên protease xem đích quan trọng cho liệu pháp điều chế thuốc ức chế protease chống HIV1 Thuốc ức chế protease làm giảm hàm lượng HIV-1 máu, tăng số lượng tế bào lympho T CD4 mang lại nhiều hội sống sót cho bệnh nhân HIV-1 Tuy vậy, tỷ lệ đột biến axit amin protease khả tạo chủng HIV-1 cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc ức chế protease HIV-1 Ở mức độ In vitro, đột biến axit amin không ảnh hưởng quan trọng đến chất ức chế protease liệu pháp điều trị, đột biến lại ảnh hưởng từ 50-90% đến tăng hàm lượng thuốc ức chế protease (Bossi tập thể, 1999) Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu chất ức chế protease HIV-1 để có thuốc điều trị thích hợp cho bệnh nhân Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease HIV-TYPE 1” nhằm tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc tính chất số hợp chất thực vật có khả ức chế protease HIV -1, đóng góp sở cho việc điều chế thuốc điều trị HIV/AIDS Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Điều tra có mặt chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật Việt Nam thông qua pepsin, protease aspartyl mang đặc điểm tương đồng cấu trúc chế xúc tác với protease HIV-1 - Thu nhận tinh số chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật - Xác định cấu trúc, tính chất đánh giá chế tác dụng số chất ức chế protease HIV-1 thu nhận Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài: Chất ức chế protease HIV-1 từ nguồn thực vật Nội dung nghiên cứu luận án: - Sàng lọc thực vật có tác dụng ức chế enzyme tương tự protease HIV– (pepsin) - Tinh số chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật sàng lọc - Nghiên cứu số tính chất chất ức chế protease HIV-1 thu nhận Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án thực chủ yếu Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phần tinh chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật thực với hỗ trợ, hợp tác Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Trung ương Phần đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân thực Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phần giải phổ kiểm tra độc lập kết phổ Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đóng góp đề tài - Đã sàng lọc 156 dịch chiết thực vật khác khả ức chế enzyme tương tự protease HIV-1 (pepsin) phương pháp khuyếch tán đĩa thạch có chứa chất hemoglobin - Đã tinh chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật, bao gồm: axit maslinic từ Gối hạc, axit 24-hydroxyusolic từ Hồng, 21β-O-[(2E)6-hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl] pitheduloside G, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic pitheduloside G từ Rau gai thối Trong đó, lần phát tinh axit maslinic có hoạt tính ức chế protease HIV-1 từ Gối hạc, lần phát hiện, tinh sạch, nghiên cứu cấu trúc, định danh hợp chất saponin 21β-O-[(2E)-6hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl] pitheduloside G từ Rau gai thối Đồng thời lần phát hoạt tính ức chế protease HIV-1 hợp chất 24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic pitheduloside G Ứng dụng thực tiễn đề tài - Kết nghiên cứu đề tài sở xây dựng quy trình sàng lọc phân lập, tách chiết nghiên cứu tính chất chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc thực vật - Thành công đề tài tiền đề cho việc phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 Bố cục luận án Luận án gồm 112 trang bao gồm: Phần mở đầu (4 trang); Tổng quan tài liệu (31 trang); Đối tượng phương pháp nghiên cứu (11 trang); Kết thảo luận (47 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang), Các công trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang), với 147 tài liệu gồm thứ tiếng tiếng Việt (18 tài liệu) tiếng Anh (129 tài liệu) Luận án có bảng, 20 hình CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời type (HIV-1) protease HIV- Virus suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus HIV) nguyên nhân gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) virus gây bệnh nguy hiểm Theo tài liệu cơng bố, có hai type HIV HIV type (HIV-1) HIV type (HIV-2), HIV-1 ngun nhân gây AIDS tồn giới số virus gây bệnh nghiêm trọng HIV thuộc họ retrovirus, họ gây ung thư cho người động vật HIV-1 có nhóm M (main), N (new), O (outlier) (Plantier tập thể, 2009) Có tới 90% lây nhiễm HIV tồn giới thuộc nhóm M; nhóm có phân type ký hiệu chữ A-D, F-H, J, K nhiều dạng tái tổ hợp khác gọi tắt phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) (Liu tập thể, 2017) Ở Việt Nam nước Đông Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh c n có số phân nhóm B, C dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen tập thể, 2003; Ishizaki tập thể, 2009; Phan tập thể, 2010) Protease HIV type (protease HIV-1) mã hóa hệ gen HIV-1 aspartic protease, họ retropepsin A2, tạo q trình HIV nhiễm vào tế bào chủ, có chức thủy phân polypeptide gag, gag-pol env virus HIV thành protein trưởng thành có hoạt tính cần thiết cho chu trình sống virus Cụ thể HIV-1 protease nhận biết trình tự peptide khác polypeptide gag để tạo protein cấu trúc: matrix, capsid, nucleocapsid P6 HIV; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành enzyme: protease, reverse transcriptase intergrase cần thiết cho trình chép HIV thủy phân polypeptide env thành protein vỏ gp120 gp41 HIV (Darke tập thể, 1989) Protease HIV-1 không phân cắt protein thông thường nên việc xác định hoạt độ enzyme phải dựa chất tổng hợp đặc hiệu thiết kế với trình tự cắt giống trình tự protein gag gag-pol Phương pháp đo hoạt độ protease HIV-1 tùy thuộc vào đặc trưng chất s dụng 1.2 Các chất ức chế protease HIV ứng dụng điều trị AIDS Các thuốc tổng hợp hóa học ức chế protease HIV-1 dùng cho điều trị bệnh nhân HIV/AIDS phát triển s dụng rộng rãi điều trị HIV/AIDS Hiện liệu pháp điều trị kháng retrovirus (ART) hay liệu pháp điều trị kháng retrovirus hiệu lực cao (HAART) xem hiệu kiểm soát phát triển HIV/AIDS (Hoffmann tập thể, 2007) ART HAART dựa chủ yếu vào phối hợp chất ức chế enzyme, chất ức chế enzyme reverse transcriptase, integrase protease HIV Tuy nhiên, việc s dụng chất ức chế enzyme có chất ức chế protease HIV có nhược điểm dễ gây tác dụng phụ cho người bệnh s dụng thời gian dài (Hofmann et al., 2007) Chính vậy, bên cạnh thuốc tổng hợp hóa học, nhà khoa học giới khơng ngừng tìm kiếm chọn lọc chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease HIV-1 ((Singh tập thể, 2005; Cheenpracha tập thể, 2006; Magadula tập thể, 2010; Hattori tập thể, 2013; Han tập thể, 2014) Việc tìm tinh chế hợp chất tinh khiết có hoạt tính ức chế protease HIV-1 sở để thiết kế chất hóa học có cấu trúc tương tự cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu ức chế protease HIV-1 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nguyên liệu 2.1.1 Đối tượng Các mẫu thực vật s dụng nghiên cứu cung cấp từ hai nguồn Các mẫu thực vật Viện Dược liệu Trung ương cung cấp Các mẫu thực vật khác nhóm nghiên cứu Đại học Khoa học Tự nhiên thu địa phương khác H a Bình, Sơn La, Hải Dương, Bắc Giang Các mẫu định danh TS Đỗ Thị Xuyến – Bộ môn Thực vật học - hoa Sinh học, Trường Đại học hoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Mẫu nghiên cứu lưu giữ hoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Trường Đại học hoa học Tự nhiên 2.1.2 Nguyên liệu Các hóa chất s dụng cho nghiên cứu bao gồm: protease HIV-1 tái tổ hợp Sigma-Aldrich (Mỹ) protease HIV-1 tái tổ hợp sản phẩm đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02 công bố Nguyen tập thể (2015), pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), chất peptide L6525 (Lys-Ala-ArgVal-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) đặc hiệu cho protease HIV-1 SigmaAldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 s dụng chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ) Các hóa chất khác axit trichloroacetic (TCA), agar, urea, βmercaptoethanol… đạt độ tinh dành cho phân tích 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân tách hợp chất từ dịch chiết thực vật tách phân đoạn dung môi hữu (ethanol, n-hexane, ethyl axetate, n-butanol sắc ký qua cột silica gel 2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân tách phân tích phổ t ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng 2.3.3 Xác định hoạt tính ức chế pepsin phương pháp khuếch tán đĩa thạch có chứa chất hemoglobin 2.3.4 Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phương pháp Anson cải tiến s dụng quy trình mơ tả hãng Sigma Aldrich 2.3.5 Xác định hoạt tính protease HIV-1 s dụng chất peptide đặc hiệu theo Richards tập thể (1990) 2.3.6 Xác định hoạt độ protease HIV-1 chất huỳnh quang máy quang phổ kế huỳnh quang 2.3.7 Xác định kiểu ức chế chất ức chế protease HIV-1 thông qua đánh giá số động học Km Vmax 2.3.8 Th độc chất d ng tế bào HEK nuôi cấy CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc thuốc có tác dụng ức chế enzyme tƣơng tự protease HIV – 3.1.1 Thiết lập phƣơng pháp thử tác dụng ức chế mẫu nghiên cứu lên hoạt độ pepsin-enzyme tƣơng tự protease HIV-1 Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu chất cao, chất có mặt dịch chiết ảnh hưởng đến phép phân tích quang phổ kế nên gần s dụng enzyme bước sàng lọc sơ chất ức chế từ thực vật Một giải pháp thay s dụng enzyme pepsin pepsin thuộc họ protease aspartyl mang đặc điểm tương đồng cấu trúc chế xúc tác với protease HIV-1 Chính vậy, nhiều nghiên cứu, pepsin thường dùng enzyme đích để bước đầu sàng lọc chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật (Hinay Sarol, 2014; Rege tập thể, 2014; Singh tập thể, 2013) Trong nghiên cứu này, pepsin dùng thay cho protease HIV-1 để th nhanh tác dụng ức chế dịch chiết thực vật phương pháp khuếch tán đĩa thạch có chứa chất hemoglobin Chúng tơi tiến hành thí nghiệm để thiết lập phương pháp sàng lọc nhanh dịch chiết thực vật nhằm xác định điều kiện pH, nồng độ hòa tan thời gian phân giải thích hợp cho pepsin hemoglobin Chúng tơi thấy để thu vịng phân giải chất đĩa thạch có đường kính phù hợp (1,1-1,2 cm) nồng độ pepsin cần có mg/ml, s dụng 10 l/giếng mẫu, thời gian ủ 120 phút, điều kiện mơi trường thạch có pH 3,6 Mặc dù pH 3,6 pH tối ưu cho pepsin hoạt động (pH tối ưu pepsin 2), pH lựa chọn để đảm bảo pepsin hoạt động tương đối tốt giá trị pH tương đối gần với pH protease HIV-1 (pH= 4,6) 3.1.2 Thu nhận ịch chiết thực vật v chất tinh sẵn có Các mẫu thực vật lựa chọn điều tra nghiên cứu bao gồm nhóm Nhóm i; bao gồm lồi thực vật cơng bố có khả ức chế HIV-1 Otake tập thể (1995); Lã Đình Mỡi tập thể (2007); Đỗ Thế Lộc tập thể (2012); Trần Thị Chung Chiến tập thể (2012), Hattori tập thể (2013) Nhóm ii: bao gồm lồi thực vật thuốc q có tính đặc hữu Việt Nam cơng bố có nhiều tác dụng sinh học chống viêm, chống ung thư v.v cơng bố Đỗ Tất Lợi (2001); Đỗ Huy Bích tập thể (2006); Viện Dược liệu (2004); Ngô Vân Thu tập thể (2011); Võ Văn Chi tập thể (2012) Nhóm iii: bao gồm số lồi thực vật chọn ngẫu nhiên Sau thu mẫu, mẫu thực vật định danh, thu nhận dịch chiết đồng thời ethanol nước cất phương pháp ngâm chiết dung môi cất quay chân không Danh sách sàng lọc bao gồm 156 mẫu thực vật thuộc 92 lồi khác (có số mẫu loài khác phân s dụng) dùng để nghiên cứu sàng lọc khả ức chế enzyme tương tự protease HIV-1 (pepsin) 3.1.3 Sàng lọc dịch chiết thực vật có tác dụng ức pepsin Kết điều tra khả ức chế pepsin 156 loại dịch chiết thực vật thể qua việc so sánh bán kính đường phân giải chất hemoglobin đĩa thạch so mẫu không bổ sung dịch chiết mẫu có chứa dich chiết Kết cho thấy số 156 dịch chiết điều tra, 48 mẫu dịch chiết thể có tác dụng ức chế pepsin (chiếm khoảng 31%), số mẫu có tác dụng mạnh nhất, Gối hạc (lá), Ổi (lá), hồng (lá), Thạch Châu (lá), Ma Hoàng (cả cây) Rau gai thối (thân) 3.2 Tinh chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật đƣợc sàng lọc Chúng chọn 03 mẫu thực vật có dịch chiết thể khả ức chế mạnh pepsin 156 mẫu khảo sát để nghiên cứu thu nhận chất ức chế protease HIV-1, là: Gối hạc, Hồng Rau gai thối 3.2.1 Tách phân đoạn tinh chất ức chế protease HIV-1 từ Gối hạc Quy trình chiết xuất phân đoạn chất từ Gối hạc chiết với ethanol để thu cao tổng số, sau chiết tiếp dung mơi có độ phân cực tăng dần để thu riêng phân đoạn: n-hexane (Hx), etyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) hi th tác dụng ức chế lên pepsin, cao phân đoạn Hx có hoạt tính ức chế pepsin cao (Hình 3.2, giếng 7) lựa chọn Cao phân đoạn Hx chạy qua sắc ký silica gel, r a giải thu phân đoạn (1-6), phân đoạn (PĐ5) có hoạt tính ức chế pepsin cao (Hình 3.3, giếng 6) Hình 3.1 Khả ức chế pepsin phân đoạn dung môi Gối hạc Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: cao cồn, giếng - 10: phân đoạn cao Hx, EtOAc, BuOH cao nước Hình 3.2 Khả ức chế pepsin phân đoạn tách từ cao Hx Gối hạc Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: phân đoạn cao Hx, giếng 7-12: phân đoạn PĐ – Phân đoạn PĐ5 tiếp tục phân tách cột silica gel với hệ dung môi r a giải n-hexane/ethyl acetate (2/1; 1/1; 1/2) thu hợp chất GH ết khảo sát GH phương pháp sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate; 1/2) cho thấy, phân đoạn có vết (Rf=0,5, màu vàng, quan sát UV-365 nm sau phun thuốc th H2SO4 10%/ethanol, sấy mỏng 110oC phút) ết th khả ức chế GH cho thấy: GH có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt nồng độ từ 5-50 mg/ml (Hình 3.3B) A B Hình 3.3 A) Sắc ký đồ SKLM hợp chất GH Khả ức chế pepsin phân đoạn tách từ dịch chiết Gối hạc (B) Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: cao cồn, giếng 7: phân đoạn cao Hx, giếng 8: phân đoạn PĐ5 giếng 9-12: GH với nồng độ từ - 10 - 25 - 50 mg/ml Sắc kí mỏng Hình 3.3A cho băng chứng tỏ hợp chất GH tinh kết kiểm tra cho thấy khả ức chế tốt pepsin đĩa thạch Hình 3.3B thể giếng 9-12 Như tách được, hợp chất GH để s dụng cho nghiên cứu Kết phân tích khả ức chế protease HIV-1 GH (Hình 3.4) cho thấy hợp chất ức chế protease HIV-1, nồng độ 6,5 µg/ml GH ức chế 50% hoạt độ protease HIV-1, GH nồng độ 9,5 µg/ml ức chế tới 90% hoạt độ protease HIV-1 Như GH chất ức chế protease aspartyl pepsin protease HIV-1 Hình 3.4 Khả ức chế protease HIV-1 GH Chúng tiếp tục nghiên cứu tính chất vật lý, kiện phổ chất GH ết phân tích cho thấy hợp chất GH loại bột vơ định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 246-248oC Phổ UV (MeOH) λmax :201 nm Phổ IR (cm-1): 3402; 2924; 1659; 1614; 1183; 1093 Phổ ESI-MS (m/z) =495 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,28 (1H, br s, Hình 3.7 A) Khả ức chế pepsin phân đoạn tinh từ dịch chiết Hồng B) Hoạt tính cịn lại protease HIV-1 có mặt LH phản ứng Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng - 9: pepsin + chất đối chứng từ Hồng, giếng 1114: pepsin + LH với nồng độ từ 50 - 25 - 10 - mg/ml ết phân tích khả ức chế pepsin protease HIV-1 cho thấy LH thể hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt nồng độ từ 5-50 mg/ml (Hình 3.7 A) ức chế 50% hoạt tính protease HIV-1 nồng độ 3,2 µg/ml (Hình 3.7B) Như vậy, hợp chất LH chất ức chế protease aspartyl pepsin protease HIV-1 ết phân tích tính chất vật lý hợp chất LH cho thấy hợp chất tồn dạng bột vơ định hình màu trắng Phổ UV (MeOH) λmax: 201 nm IR νmax (cm-1): 3430; 2925; 1694, 1461, 1016 Phổ ESI-MS (m/z) =495 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR (C5D5N; 500 MHz): 5,46 (1H, br s, H-12), 4.46 (1H, d, J=11,0 Hz, H-3), 3,63 (2H, d, m, H-24), 2,60 (1H, d, J=6,0 Hz, H-18), 1,53 (3H, s, H-23), 1,20 (3H, s, H-27), 0,99 (3H, s, H-25), 0,97 (3H, d, J=6,0 Hz, H-30), 0,93 (3H, d, J=6,0 Hz, H-29), 0,84 (3H, s, H-26) Phổ 13C-NMR (C5D5N; 125 MHz): 38,1 (C-1), 28,6 (C-2), 80,1 (C3), 39,9 (C-4), 56,4 (C-5), 19,0 (C-6), 33,8 (C-7), 48,0 (C-8), 48,1 (C-9), 37,0 (C-10), 24,9 (C-11), 125,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,4 (C-14), 28,4 (C16), 43,1 (C-17), 53,5 (C-18), 39,4 (C-19), 39,5 (C-20), 31,1 (C-21), 37,4 (C-22), 23,8 (C-23), 64,5 (C-24), 17,3 (C-25), 16,1 (C-26), 23,6 (C-27), 179,9 (C-28), 17,5 (C-29), 21,4 (C-30) Phổ IR cho biết phân t chất số LH có nhóm chức sau: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3430 cm-1); nhóm C=O (đỉnh 1694 cm-1), liên kết C-O (đỉnh 1016 cm-1) Phổ 1H-NMR cho biết có proton olefin có độ chuyển dịch 5,46 ppm Ngồi cịn có tín hiệu proton của nhóm methyl có tín hiệu xuất dạng pic đơn tín hiệu xuất dạng pic kép với số ghép cặp J= 6,0 Hz độ chuyển dịch từ 0,84 ppm đến 1,53 ppm Phổ 13C-NMR chất số LH cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon Có tín hiệu cacbon C=O δc=179,9 ppm Ngồi c n có tín hiệu cacbon có độ chuyển dịch thuộc vùng liên kết đôi δc=125,4 ppm δc=139,2 ppm, tín hiệu nhóm CH2 liên kết với oxy δc=80,1 ppm Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR khẳng định có liên kết đôi phân t chất số LH Phổ ESI-MS có đỉnh ion m/z: 495 [M+Na]+ (positive) cho biết công thức phân t LH C30H48O4 (M=472) Với số lượng 30 cacbon kết hợp với tín hiệu độ chuyển dịch cacbon nối đôi nhận định chất số LH triterpen khung ursan ( Dam tập thể, 2010, Phuong tập thể, 2008) Tiếp tục, với việc có 11 liên kết C=O, cacbon bậc ba liên kết với oxy δc=80,1 ppm, nhóm CH3, nhóm oxy methylen, kết hợp với khối lượng phân t khẳng định chất số LH có cấu trúc tương tự với axit ursolic, khác nhóm methyl axit ursolic bị thay nhóm CH2-OH So sánh với liệu phổ công bố trước (Ahmad Atta, 1994, Phuong tập thể, 2008) khẳng định chất số LH axit 24-hydroxyursolic (Hình 3.8) Hình 3.8 Cơng thức cấu tạo axit 24-hydroxyursolic Axit 24-hydroxyursolic (3β,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) triterpenoid có vịng cạnh có cơng thức phân t C30H49O4, gần giống cấu trúc axit ursolic Theo nghiên cứu trước đây, axit ursolic (hợp chất tương tự axit 24-hydroxyursolic) biết đến ức chế protease HIV-1 (Nguyễn Hồng Anh tập thể, 2015) Cho đến nay, axit 24hydroxyursolic phân lập từ số loài thực vật như: Hồng (Diospyros kaki L.) (Thuong tập thể, 2008; Khanal tập thể, 2010), từ Bọ mẩy (Clerodendrum cyrtophyllium T.) (Trần Thị Thanh Huyền tập thể, 2012) Ngoài nghiên cứu phân tách tinh axit 24hydroxyursolic, có số nghiên cứu thực để đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất Theo Khanal tập thể (2010), axit 24hydroxyursolic chiết xuất từ Hồng (Diospyros kaki L.) có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào, gây kích hoạt mạnh protein kinase hoạt hố AMP (AMPK) có tác động trung gian quan trọng chống ung thư cách ức chế cyclooxygenase (COX-2) biểu tế bào HT-29 Ngồi ra, axit 24-hydroxyursolic cịn gây trình chết theo chương trình phân mảnh DNA tế bào HT-29 ức chế hoạt tính AP-1 q trình chuyển dạng tế bào JB6 CL41 Đến chưa có cơng bố tác dụng ức chế protease HIV-1 axit 24-hydroxyursolic 3.2.3 Tách phân đoạn tinh chất ức chế protease HIV-1 từ Rau gai thối Thân Rau gai thối phơi khô (7,0 kg) cắt nhỏ, ngâm chiết với ethanol 96% nhiệt độ phòng (chiết lần, lần ngày) Dịch chiết gộp lại cất loại cồn nước áp suất giảm thu cắn chiết cồn cô khô (155.5 g) Cắn chiết hòa tan vào nước cất (1,0 lít) thành hỗn dịch lắc, chiết phân đoạn với n-hexane (1,0 lít × lần), ethyl acetate (1,0 lít × lần), n-butanol (1,0 lít × lần) Các dịch chiết n-hexane, ethyl acetate n-butanol tách riêng, cất loại dung môi áp suất giảm 12 thu phần cắn tương ứng: cắn phân đoạn n-hexane (54 g), cắn phân đoạn ethyl acetate (EtOAc; 95 g) cắn phân đoạn n-butanol (31.3 g) Cắn phân đoạn EtOAc (95 g) đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường, r a giải hệ dung môi CH2Cl2-MeOH với tỷ lệ methanol tăng dần từ đến 100% thu phân đoạn (PĐ1-PĐ5) Phân đoạn PĐ3 tiếp tục phân tách cột silica gel pha thường với hệ dung môi r a giải CH2Cl2-MeOH (15/1; 10/1; 8/1) thu phân đoạn (PĐ3.1 đến PĐ3.5) Phân đoạn PĐ3.2 đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải gradient với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1; 2/1; 3/1) thu chất số (14 mg) Phân đoạn PĐ3.4 phân tách cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (1/2; 1/1; 2/1) thu phân đoạn (PĐ3.4.1 đến PĐ3.4.4) PĐ3.4.3 tinh chế cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải đẳng dịng với hệ dung mơi MeOH/H2O (3/2) thu chất số (22 mg) Phân đoạn PĐ3.4.1 tinh chế cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) thu chất số (9 mg) Phân đoạn PĐ2 đưa lên cột silica gel pha thường, r a giải gradient hệ dung môi n-hexan-EtOAc với tỷ lệ 1/1; 2/1; 3/1 thu phân đoạn (PĐ2.1 đến PĐ2.4) Chất số (12 mg) phân lập từ phân đoạn PĐ2.3 cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải với hệ dung môi MeOH/H2O (2/1; 3/1) Phân đoạn PĐ3.5 đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 r a giải gradient với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1; 2/1; 3/1) thu chất số (9 mg) Như qua bước thu chất kí hiệu từ RG1 đến RGT5 Các chất kiểm tra độ tinh sắc kí mỏng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định công thức cấu tạo bước Kết kiểm tra độ tinh hợp chất tách từ Rau gai thối sắc kí mỏng silica gel (Hình 3.9) cho thấy chất có băng sắc kí mỏng chứng tỏ hợp chất tinh 13 Hình 3.9 Sắc ký đồ SKLM chất tách từ Rau gai thối A: RGT1, B: RGT2, C: RGT3, D: RGT4, E: RGT5 Kết phân tích khả ức chế pepsin protease HIV-1 hợp chất tách từ Rau gai thối (Hình 3.10) cho thấy chất RGT3 chất RGT4 ức chế pepsin rõ rệt nồng độ từ 5- 50 mg/ml (Hình 3.10A giếng 10) ức chế 50% hoạt tính protease HIV-1 nồng độ 6,5 µg/ml với chất RGT1 (Hình 3.10B), nồng độ µg/ml với chất RGT2 (Hình 3.10C), nồng độ 17 µg/ml với chất RGT3 (Hình 3.10D), nồng độ 15 µg/ml với chất RGT4 (Hình 3.10E) nồng độ 2,3 µg/ml với chất RGT5 (Hình 3.10F) Như vậy, số hợp chất có hợp chất RGT3 chất RGT5 ức chế pepsin, hợp chất chất ức chế protease HIV-1 Hình 3.10 A: Khả ức chế pepsin chất tinh từ Rau gai thối Giếng 1: HCl 0,01 N, giếng 2: DMSO, giếng 3: pepsin, giếng 4: pepsin + DMSO, giếng 5: pepsin + pepstatin A, giếng 6: pepsin + RGT1, giếng 7: pepsin + RGT2, giếng 8: pepsin + 14 RGT3, giếng 9: pepsin + RGT4 giếng 10: pepsin + chất RGT5 với nồng độ 50 mg/ml Hoạt tính cịn lại protease HIV-1 có mặt (B: RGT1, C: RGT2, D: RGT3, E: RGT4, F: RGT5 ) phản ứng Tiếp theo, tiến hành phân tích tính chất vật lý phổ NMR, IR, ESI-MS hợp chất thu từ Rau gai thối Hợp chất số 1: dạng bột màu trắng ngà Phổ IR (cm-1): 3285; 1644; 1618; 1540; 1445; 1248; 1038 Phổ APCI-MS (m/z)=521 [M-H]- Phổ 1HNMR (CD3OD; 500 MHz): 6,95 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2′), 6,94 (1H, d, J=1,5 Hz, H-6′), 6,60 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5), 6,59 (1H, d, J=2,5 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J=16,5 Hz, H-7′), 6,50 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6), 6,33 (1H, dt, J=6,0; 16,5 Hz, H-8′), 4,70 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,24 (2H, d, J=5,5 Hz, H-9′), 3,98 (1H, m, H-8), 3,85 (3H, s, H-10′), 3,82 (1H, m, H-6a′′), 3,79 (1H, m, H-9a), 3,72 (3H, s, H-10), 3,70 (1H, m, H-9b), 3,68 (1H, m, H6b′′), 3,48 (1H, m, H-4′′), 3,45 (1H, m, H-3′′), 3,39 (1H, m, H-2′′), 3,15 (1H, m, H-5′′), 2,98 (1H, dd, J=5,5; 14,0 Hz, H-7a), 2,74 (1H, dd, J=9,0; 13,5 Hz, H-7b) Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 153,5 (C-3′), 148,4 (C3), 145,4 (C-4), 145,0 (C-4′), 138,9 (C-5′), 135,4 (C-1′), 133,2 (C-1), 131,5 (C-7′), 129,7 (C-8′), 122,6 (C-6), 119,1 (C-6′), 115,7 (C-2), 113,8 (C-5), 109,1 (C-2′), 105,4 (C-1′′), 78,1 (C-5′′), 77,9 (C-3′′), 75,9 (C-2′′), 71,2 (C4′′), 66,8 (C-9), 63,7 (C-9′), 62,5 (C-6′′), 56,4 (C-10), 56,3 (C-10′′), 42,8 (C8), 39,2 (C-7) Hợp chất số 1: thu dạng bột màu trắng ngà Phổ IR cho biết phân t có nhóm chức: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3285 cm-1), liên kết C=C (1644 cm-1), liên kết C=C nhân thơm (1618; 1540; 1445 cm-1), liên kết C-O (1248; 1038 cm-1) Phổ khối ESI-MS có píc ion m/z: 521 [M-H] (negative) cho biết khối lượng phân t M=522 Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu 02 proton olefin, proton xuất dạng doublet với số ghép cặp J=16,5 Hz δH=6,58 ppm proton xuất dạng double triplet với J=6,0; 16,5 Hz độ chuyển dịch δH=6,33 ppm Hai tín hiệu xác định proton liên kết đơi với cấu hình trans Quan sát phổ 1H-NMR cịn xuất tín hiệu 05 proton thơm 02 proton methoxy δH=3,85 3,72 ppm Năm proton thơm bao gồm 02 proton ghép cặp dạng meta 03 proton ghép cặp dạng ABX Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 26 nguyên t cacbon có 14 nguyên t cacbon liên kết đôi hay nhân thơm ết hợp với kiện phổ 1H-NMR khẳng định hợp chất có v ng thơm Sự có mặt gốc đường với cấu hình β cấu trúc thể thơng qua tín hiệu proton anome δH 4,70 (d, J=7,5 Hz, H-1′′) tín hiệu δC=62,5 ppm (C-6′′) Gốc đường đính vào cacbon độ chuyển dịch δC=145,0 (C-4′) xuất tương tác δH=4,70 δC=145,0 phổ HMBC Ngoài ra, quan sát phổ 1H 15 13C-NMR, DEPT cho thấy, phần aglycon hợp chất cịn có thêm 01 nhóm methylen,01 nhóm methin 02 nhóm oxymethylen Phân tích kiện phổ, tra cứu tài liệu, dự đoán chất số hợp chất icariside E5 (Lee tập thể, 2009, Iorizzi tập thể, 2001) Các tương tác phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC, COSY) phổ khối khẳng định chất số hợp chất icariside E5 Icariside E5 lignan glycosid, lần phân lập từ phần mặt đất loài Epimedium diphyllum vào năm 1989 (Miyase tập thể, 1989) Sau đó, hợp chất tìm thấy số loài thực vật Albizzia julibrissin, Ehretia ovalifolia, Capsicum annuum (Lee tập thể, 2009, Iorizzi tập thể, 2001) Đây lần có mặt hợp chất icariside E5 loài thuộc chi Acacia cơng bố (Hình 3.11,1) Hợp chất số 2: thu dạng bột màu trắng Phổ IR (cm-1): 3454; 2930; 1691; 1615; 1270; 1048 Phổ ESI-MS (m/z)=489 [M+H]+ Phổ 1HNMR (CD3OD; 500 MHz): 5,30 (1H, br s, H-12), 4,13 (1H, d, J=11,0 Hz, H-24), 3,40 (1H, d, J=6,0 Hz, H-24b), 3,37 (1H, m, H-3), 2,52 (1H, br s, H18), 1,35 (3H, s, H-27), 1,22 (3H, s, H-23), 1,21 (3H, s, H-29), 0,95 (3H, d, J=6,5 Hz, H-30), 0,94 (3H, s, H-26), 0,80 (3H, s, H-25) Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 182,3 (C-28), 140,0 (C-13), 129,3 (C-12), 81,3 (C3),73,6 (C-19), 65,3 (C-24), 57,3 (C-5), 55,1 (C-18), 43,5 (C-4), 43,1 (C20), 42,5 (C-14), 41,0 (C-8), 39,6 (C-1), 39,0 (C-22), 37,9 (C-10), 34,5 (C7), 29,6 (C-15), 28,3 (C-2), 27,3 (C-29), 27,1 (C-21), 26,6 (C-16), 24,9 (C27), 24,7 (C-11), 23,2 (C-23), 19,9 (C-6), 17,4 (C-25), 16,6 (C-26), 16,4 (C30) Hợp chất số 2: thu dạng bột màu trắng Phổ IR xuất đỉnh hấp thụ: 3454 cm-1 (nhóm OH), 1691 cm-1 (nhóm C=O), 1270; 1048 cm-1 (liên kết C-O) Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu 01 proton olefin δH=5,30 ppm, 01 nhóm oxymethin δH=3,37 ppm, nhóm oxymethylen, 06 nhóm methyl có 05 nhóm xuất dạng píc đơn 01 nhóm xuất dạng píc kép với số ghép cặp J=6,5 Hz Phổ 13C-NMR phổ DEPT xuất tín hiệu 30 nguyên t cacbon hai nguyên t cacbon liên kết đôi xuất δc=140,3 ppm (C) 129,3 ppm (CH) Trong số 30 nguyên t cacbon có 06 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, 06 nhóm methyl 08 cacbon bậc bốn Các kiện phổ NMR chất số gần giống với kiện phổ hợp chất axit ursolic, triterpenoid khung ursan thường gặp thực vật (Hossain Ismail , 2013) Điểm khác biệt chất số hợp chất axit ursolic chất số có hợp chất axit ursolic nhóm methyl Trong cấu trúc chất số 2, nhóm methyl thay nhóm oxymethylen Nhóm oxymethylen xác định vị trí 24 xuất tương tác δH=1,22 ppm (H-23) δC=65,3 ppm (C-24) δH=3,40; 4,13 ppm (H-24) δC=23,2 ppm (C-23) phổ HMBC Ngồi việc 16 hợp chất axit ursolic nhóm methyl, hợp chất xuất proton methyl dạng doublet với số ghép cặp J=6,5 Hz thay hai proton methyl (H-29 H-30) hợp chất axit ursolic (Hossain Ismail , 2013) Như vậy, C-19 C-20 chất số chuyển thành cacbon bậc bốn thay hai nhóm CH axit ursolic Điều thể qua xuất cacbon bậc bốn δC=73,6 ppm phổ 13CNMR phổ DEPT Cacbon xác định cacbon vị trí C-19 xuất tương tác δH=1,21 ppm (H-29) δC=73,6 ppm (C-19) δH=2,52 ppm (H-18) δC=73,6 ppm (C-19) quan sát phổ HMBC (Nakatani tập thể, 1989a) Phổ khối ESI-MS có píc ion m/z: 489 [M+H] + (positive) cho biết công thức phân t C30H48O5 (M=488) Phân tích kiện phổ, xác định chất số hợp chất 3β,19,24trihydroxyurs-12-en-28-oic acid, axit rotungenic (Nakatani tập thể, 1989a, 1989b) Hợp chất axit rotungenic lần phân lập vào năm 1989 từ loài Ilex rotunda nhà khoa học Nhật Bản (Nakatani tập thể, 1989a) Đây lần hợp chất tìm thấy chi Acacia (Hình 3.11,2) Hợp chất số 3: dạng bột màu trắng Phổ IR (cm-1): 3423; 2938; 1646; 1185; 1044 Phổ ESI-MS (m/z)=801 [M+H]+ Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz): 5,13 (1H, t, J=6,5 Hz, H-24), 4,62 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,37 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′), 4,12 (1H, dt, J=3,0 Hz ), 1,70 (3H, s, H-26), 1,65 (3H, s, H-27), 1,37 (3H, s, H-21), 1,35 (3H, s, H-28), 1,12 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-29), 1,02 (3H, s, H-19), 0,98 (3H, s, H-30) Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 130,3 (C-25), 125,8 (C-24), 105,6 (C-1′), 98,3 (C-1′′), 84,9 (C-20), 80,9 (C-6), 79,8 (C-3), 79,1 (C-3′), 78,3 (C-3′′), 77,9 (C-5′′), 77,7 (C-5′), 75,5 (C-2′), 75,4 (C-2′′), 71,7 (C-12), 71,4 (C-4′), 71,3 (C-4′′), 62,9 (C-6′), 62,7 (C-6′′), 61,8 (C-5), 53,1 (C-17), 52,5 (C-14), 50,6 (C-9), 49,8 (C-13), 45,2 (C-7), 41,9 (C-8), 40,5 (C-10), 40,4 (C-4), 40,2 (C-1), 36,6 (C-22), 31,5 (C-15), 31,4 (C-28), 30,9 (C-11), 27,6 (C-16), 27,2 (C12), 25,8 (C-26), 24,2 (C-23), 22,8 (C-21), 17,9 (C-27), 17,8 (C-19), 17,6 (C-18), 17,1 (C-30), 16,1 (C-29) Hợp chất số 3: thu dạng bột màu trắng Các phổ 1H, 13CNMR, DEPT, HSQC, HMBC chất số cho biết saponin triterpenoid tetracyclic khung dammaran với hai gốc đường cấu trúc (Lin tập thể, 2001, Teng tập thể, 2002) Cả hai gốc đường có cấu hình β hai proton anome xuất dạng doublet δH=4,37 ppm (H1′) δH=4,62 ppm (H-1′′) với số ghép cặp J=7,5 Hz Gốc đường thứ xác định đính vào vị trí C-6 khung aglycon xuất tương tác δH=4,37 ppm (H-1′) δC=80,9 ppm (C-6), gốc đường lại xác định đính vào vị trí C-20 khung aglycon xuất tương tác δH=4,62 ppm (H-1′′) δC=84,9 ppm (C-20) quan sát phổ HMBC Phổ khối ESI-MS có píc ion m/z: 801 [M+H]+ (positive), kết 17 hợp với kiện phổ NMR cho biết công thức phân t C42H72O14 (M=800) Phân tích kiện phổ, tham khảo tài liệu xác định chất số hợp chất ginsenoside Rg1 (Lin tập thể, 2001, Teng tập thể, 2002) Hợp chất ginsenoside Rg1 thành phần lồi thuộc chi Panax thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) (Wan tập thể, 2012) Đây lần phát có mặt hợp chất thành phần hóa học lồi thuộc chi Acacia (Hình 3.11,3) Hợp chất số 4: dạng bột màu trắng Phổ IR (cm-1): 3545; 2923; 1651; 1185; 1262; 1063 Phổ ESI-MS (m/z)=1043 [M-H]- Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz): 5,14 (1H, br s, H-12); 3,21 (1H, H-3, overlap), 4,57 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′), 4,45 (1H, d, J=5,5 Hz, H-1′′′), 4,34 (1H, d, J=7,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1′′′′), 1,09 (3H, s, H-27); 0,99 (3H, s, H-23), 0,86 (3H, s, H-25), 0,85 (3H, s, H-30), 0,81 (3H, s, H-29), 0,77 (3H, s, H-24), 0,73 (3H, s, H-26) Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 145,2 (C13), 123,6 (C-12), 106,7 (C-1′′′′), 105,2 (C-1′), 104,6 (C-1′′), 103,7 (C-1′′′), 90,6 (C-3), 81,6 (C-2′′′), 81,1 (C-2′), 78,4 (C-3′), 78,4 (C-5′′), 77,9 (C-3′′), 77,6 (C-3′′′′), 76,8 (C-5′), 76,4 (C-2′′), 75,9 (C-2′′′′), 73,3 (C-3′′′), 71,9 (C4′′), 71,6 (C-4′), 71,1 (C-4′′′′), 69,9 (C-6′), 68,7 (C-4′′′), 67,3 (C-5′′′′), 65,7 (C-5′′′), 63,1 (C-6′), 57,0 (C-5), 49,1 (C-9), 47,2 (C-17), 42,9 (C-14), 42,7 (C-18), 40,6 (C-8), 40,5 (C-1), 39,8 (C-4), 37,9 (C-10), 35,0 (C-15), 34,0 (C-7), 33,6 (C-29), 31,6 (C-20), 29,0 (C-22), 28,4 (C-23), 27,3 (C-2), 26,5 (C-27), 24,6 (C-16), 24,6 (C-11), 24,0 (C-30), 19,3 (C-6), 18,2 (C-26), 16,9 (C-24), 16,0 (C-25) Hợp chất số 4: thu dạng bột màu trắng Phổ IR cho biết phân t có nhóm chức: nhóm OH (dải hấp thụ có đỉnh 3545 cm1 ), liên kết C=O (1651 cm-1), liên kết C-O (1262; 1063 cm-1) Các phổ 1HNMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC cho biết hợp chất saponin khung olean, thành phần loài thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) (Lacaille-Dubois tập thể, 2011) Cấu trúc hợp chất chứa 04 gốc đường, có 03 đường cấu hình β phổ H-NMR xuất tín hiệu 03 proton anome xuất dạng doublet với số ghép cặp J ˃7 ppm Đường lại có cấu hình α proton anome xuất δH=4,45 (d, H-1′′′) với số ghép cặp J=5,5 Hz Sự xuất tương tác proton anome δH=4,34 ppm (H-1′) δc=90,6 ppm quan sát phổ HMBC gợi ý vị trí số khung aglycon gắn gốc đường Tìm kiếm hợp chất saponin với đặc điểm nêu trên, nhóm nghiên cứu dự đốn chất số hợp chất oleanolic acid 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosid, hay gọi hợp chất pitheduloside G (Nigam tập thể, 1997, Seo tập thể, 2002) Các tương tác xuất phổ HMBC giúp khẳng định vị trí đính gốc đường với trung tâm vị trí C-3 Theo đó, đường β-D18 glucopyranose thứ gắn vào vị trí C-3 phần aglycon xuất tương tác H-1′ (δH=4,34) với C-3 (δC=90,6), đường β-D-glucopyranose thứ hai gắn vào vị trí số đường β-D-glucopyranose thứ xuất tương tác H-1′′ (δH=4,57) với C-2′ (δC=81,1), đường α-Larabinopyranose gắn vào vị trí số đường β-D-glucopyranose thứ xuất tương tác H-1′′′ (δH=4,45) với C-6′ (δC=69,9), đường β-Dxylopyranose gắn vào vị trí số đường α-L-arabinopyranose xuất tương tác H-1′′′′ (δH=4,44) với C-2′′′ (δC=81,6) Thêm nữa, phổ khối ESI-MS có píc ion m/z: 1043 [M-H] (negative) cho ph p xác định công thức phân t hợp chất C54H82O21 (M=1044), trùng với công thức phân t hợp chất pitheduloside G Như chất số xác định pitheduloside G (Nigam tập thể, 1997, Seo tập thể, 2002) Hợp chất pitheduloside G saponin phân lập lần phân lập từ hạt me nước (Pithecellobium dulce) vào năm 1997 (Nigam tập thể, 1997) Chi Pithecellobium chi thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) (Lacaille-Dubois tập thể, 2011) Đây báo cáo cơng bố có mặt hợp chất pitheduloside G chi Acacia (Hình 3.11,4) Hợp chất số 5: dạng bột màu trắng Phổ IR (cm-1): 3545; 2923; 1651; 1185; 1262; 1063 Phổ khối ESI-MS: m/z=1249 (M+Na]+ (C62H98O24) Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz):5,31 (1H, br s; H-12); 4,86 (1H; H-21 overlap); 1,22 (3H, s; H-27); 1,10 (3H, s; H-23); 1,07 (3H, s; H30); 0,98 (3H, s; H-25); 0,91 (3H, s; H-29); 0,88 (3H, s; H-24); 0,83 (3H, s; H-26); 1,84 (3H, s, H-9′); 1,29 (3H, s, H-10′); 4,45 (1H, d, J=7,5 Hz; H-1 glc); 4,45 (1H, d, J=7,5 Hz; H-1 xyl); 4,56 (1H, d, J=5,0 Hz; H-1 ara); 4,68 (1H, d, J=7,5 Hz; H-1 glc2); 6,77 (1H, t, J=7,0 Hz; H-3′); 5,93 (1H, dd, J=10,5; 17,5 Hz; H-7′); 5,26 (1H, d, J=17,5 Hz; H-8′a); 5,07 (1H, d, J=10,5 Hz; H-8′b) Phổ 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): 39,8 (C-1); 27,3 (C-2); 90,6 (C3); 40,5 (C-4); 56,9 (C-5); 19,3 (C-6); 34,0 (C-7); 40,5 (C-8); 49,0 (C-5); 37,9 (C-10); 24,6 (C-11); 124,4 (C-12); 144,1 (C-13); 42,9 (C-14); 35,2 (C15); 24,5 (C-16); 49,3 (C-17); 42,2 (C-18); 47,7 (C-19); 36,4 (C-20); 76,8 (C-21); 37,8 (C-22); 28,4 (C-23); 16,9 (C-24); 16,0 (C-25); 17,7 (C-26); 26,4 (C-27); 29,3 (C-29); 18,8 (C-30); 169,3 (C-1′); 128,8 (C-2′); 144,1 (C3′); 24,5 (C-4′); 41,8 (C-5′); 73,6 (C-6′); 150,0 (C-7′); 112,4 (C-8′); 12,4 (C9′); 27,8 (C-10′); glc-1: 105,3 (C-1); 81,1 (C-2); 78,4 (C-3); 71,2 (C-4); 76,8 (C-5); 69,9 (C-6); glc-2: 104,6 (C-1); 76,4 (C-2); 77,9 (C-3); 71,9 (C4); 78,3 (C-5); 63,1 (C-6); ara: 103,7 (C-1); 81,6 (C-2); 73,3 (C-3); 68,7 (C-4); 65,7 (C-5); xyl: 106,7 (C-1); 75,8 (C-2); 77,5 (C-3); 71,1 (C-4); 67,3 (C-5) Glc: β-D-glucopyranosyl; Ara: α-L-arabinopyranosyl; Xyl: β-Dxylopyranosyl 19 Hợp chất số (RGT5): thu phổ 1H-NMR, 13C-NMR thu gần giống với hợp chất pitheduloside G, gợi ý số saponin khung olean Vị trí 04 gốc đường gắn vào C-3 khung aglycon hợp chất số giống hệt hợp chất pitheduloside G (xem số liệu phổ) Điểm khác biệt 02 hợp chất xuất thêm nhóm monoterpen (một nhóm đặc trưng thành phần hóa học lồi chi Acacia) hợp chất số (Lacaille-Dubois tập thể, 2011) Nhóm monoterpen xác định gắn vào vị trí C-21 khung aglycon xuất tương tác H-21 (δH 4,86 ppm) với C-1′ (δC 169,3 ppm), tương tác H-30 (δH 1,07 ppm) với C-21 (δC 76,8 ppm), tương tác H29 (δH 0,91 ppm) với C-21 (δC 76,8 ppm) phổ HMBC tương tác H-21 (δH 4,86 ppm) với C-21 (δC 76,8 ppm) phổ HSQC Phổ khối ESI-MS có píc ion m/z: 1249 [M+Na]+ (positive) cho ph p xác định công thức phân t hợp chất số C62H98O24 (M=1226) Phân tích tương tác phổ HSQC, HMBC, COSY khẳng định cấu trúc hợp chất số Hình 3.11 sở cấu trúc, hợp chất định danh 21-O-[(2E)-6-hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl pitheduloside G (gọi tắt 21Nonyl-pithethuloside G) Đây saponin, có hoạt tính ức chế mạnh protease HIV-1 lần tinh sạch, xác định cấu trúc, tính chất định danh Hình 3.11 Cơng thức cấu tạo hợp chất (1-5) phân lập đƣợc từ thân Rau gai thối Glc: β-D-glucopyranosyl ; Ara: α-L-arabinopyranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl 20 3.3 Nghiên cứu số tính chất chất ức chế protease HIV-1 3.3.1 i t IC50 chất ức chế protease HIV-1 Hoạt độ ức chế protease HIV-1 hợp chất axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl-pitheduloside G nồng độ tăng dần trình bày Hình 3.12 cho thấy axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl-pitheduloside G ức chế proteases HIV-1 với nồng độ IC50 tương ứng 4,5 µM; 6,5 µM, 12,5 µM, 35 µM , 8,3 µM, 14 µM µM Hình 3.12 Hoạt tính ức chế protease HIV-1 hợp chất axit maslinic (A), 24-hydroxyursolic (B), iricariside E5 (C), ginsenoside rg1(D), axit rotungenic (E), pitheduloside G (F) 21NonylPitheduloside G (G) 3.3.2 i i ức chế protease HIV-1 chất tinh Để bước đầu xác định kiểu ức chế protease HIV-1 axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl-pitheduloside G xây dựng đường 21 biễu diễn phụ thuộc tốc độ phản ứng protease HIV-1 vào chất khơng có có chất ức chế theo phương trình Lineweaver Burk: 1/V = Km/Vmax [S] + 1/Vmax Căn vào giá trị IC50 chất vừa nêu trên, s dụng hai nồng độ chất ức chế khác Kết cho thấy tất chất ức chế (axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl – pitheduloside G làm giảm giá trị Km Vmax protease HIV-1 Kết cho ph p bước đầu nhận định hợp chất ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh (uncompetitive) 3.3.3 Xác định độc t nh tế o chất ức chế protease HIV-1 Hình 3.13 Ảnh hƣớng chất ức chế protease HIV-1 lên sinh trƣởng tế bào HEK 293T A: Axit maslinic; B: Axit 24 hydroxyursolic; C: Icariside E5; D: Ginsenoside Rg1; E: Axit rotungenic; F: Pitheduloside G; G: 21Nonyl - pitheduloside G Để đánh giá độc tính tế bào axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl -pitheduloside G, s a dụng dịng tế bào phơi thận người 22 (Human embryonic kidney - HEK 293T) bổ sung chất ức chế nồng độ khác nhau, nuôi thành lớp mỏng môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) (Corning, Hoa ỳ), sau xác định số tế bào sống sót (tính %) so với mẫu không bổ sung chất ức chế Theo phương pháp MTS, giá trị IC50 chất tinh phải nhỏ 5µg/ml chất coi có tác dụng gây độc tế bào Kết thu Hình 3.13 cho thấy, số hợp chất không gây chết tế bào dãy nồng độ mM, riêng axit rotugenic thể khả giết chết tế bào với IC50 nồng độ 1mM Căn vào nồng độ mà hợp chất axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G 21Nonyl-pitheduloside G ức chế 50% hoạt độ protease HIV-1 (IC50), nồng độ chất ức chế chúng tơi s dụng thí nghiệm độc tính tế bào cao gấp 10 lần giá trị IC50 chúng protease HIV-1 Kết cho phép khẳng định hợp chất axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, axit rutongenic, ginsenoside Rg1, pitheduloside G, 21Nony-pithethuloside G khơng gây độc tính với tế bào HEK293 T dãy nồng độ có tác dụng ức chế protease HIV-1 Đây tính chất quan trọng, chất s dụng điều trị HIV/AIDS Trên thực tế số hợp chất ức chế protease HIV-1 tinh từ nguồn thực vật nghiên cứu có axit maslinic biết chất ức chế protease HIV-1 (Xu tập thể, 1996) Khả ức chế protease HIV-1 axit maslinic với số axit triterpen khác tinh từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ Hoa hồng (Rosaceae) Chúng lần xác định có mặt axit maslinic thu nhận hợp chất dạng tính từ Gối hạc Theo Han tập thể (2014) axit maslinic có khả ức chế protease HIV-1 mạnh số axit triterpen biết đến Các kết xác định giá trị IC50 protease HIV-1 axit maslinic nghiên cứu phù hợp với kết qủa nghiên cứu trước Hợp chất ức chế protease HIV-1 thứ hai mà thu nhận 21Nonyl-pithedulosie G (từ câu Rau gai thối) Đây báo cáo phát tinh sạch, xác định cấu trúc định danh hợp chất So sánh với kết công bố chất ức chế protease HIV-1 (Hattori, 2013), 21Nonyl-pithedulosie G với giá trị IC50 = µM thuộc nhóm chất ức chế mạnh phát Các hợp chất lại axit 24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic, pitheduloside G, tác giả tìm hợp chất nghiên cứu xác định chúng có hoạt tính ức chế protease HIV-1 23 KẾT LUẬN đây: Từ kết nghiên cứu đạt rút kết luận sau Đã thiết lập điều kiện thí nghiệm phù hợp để sàng lọc chất ức chế pepsin (enzyme tương tự protease HIV-1) phương pháp khuyếch tán đĩa thạch là: chất hemoglonin 0,1%, pH 3,6, nồng độ pepsin mg/ml, s dụng 10 µl /giếng mẫu, thời gian ủ 120 phút Đã sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin (enzyme tương tự protease HIV-1) 156 dịch chiết thực vật khác phương pháp khuyếch tán đĩa thạch có chứa chất hemoglobin phát 31 loại dịch chiết có tác dụng ức chế pepsin loại dịch chiết có tác dụng ức chế manh bao gồm: Ma hoàng (cả cây), Bơ (hạt), Thạch châu (lá), Ổi (lá), Gối hạc (lá), Hồng (lá), Rau gai thối (thân) Từ phân đoạn dịch chiết ethanol, thông qua bước chiết dung môi sắc ký cột, sắc ký mỏng thu nhận hợp chất axit maslinic (2α, 3β- dihydroxy- olean- 12- en- 28- oic acid) từ Gối hạc, axit 24-hydroxyursolic từ Hồng hợp chất: icariside E5, axit rutongenic, ginsenoside Rg1, pitheduloside G, 21Nonyl pithethuloside G từ thân Rau gai thối Các hợp chất ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ IC50 4,5 µM; 6,5 µM, 12,5 µM; 35 µM , 8,3 µM, 14 µM µM Trong hợp chất vừa nêu, axit maslinic lần tách từ Gối hạc, hợp chất 21 Nonyl pithethuloside G Rau gai thối lần phát hiện, tinh sạch, nghiên cứu cấu trúc, định danh xác định hoạt tính ức chế protease HIV-1 Trên sở phân tích phụ thuộc tốc độ phản ứng protease HIV-1 vào nồng độ chất có khơng có chất ức chế, hợp chất axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, axit rutongenic, ginsenoside Rg1, pitheduloside G, 21Nonyl-pithethuloside G thể khả ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh Các hợp chấtt khơng gây độc tính với tế bào HEK293 T dãy nồng độ có tác dụng ức chế protease HIV-1 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả ức chế hợp chất chất tinh (axit maslinic, axit 24-hydroxyursolic, icariside E5, axit rutongenic, ginsenoside Rg1, pitheduloside G 21Nonyl-pithethuloside G) lên protease HIV-1 mơ hình tế bào khả phát triển thành thuốc điều trị AIDS 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Văn Dũng, Lương Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị Phương, Phương Thiện Thương, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phương Thuận (2015), “Hoạt tính ức chế pepsin protease HIV-1 cao chiết hoạt chất acid maslinic từ dược liệu”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T.31(2), tr 18-27 Nguyễn Hồng Anh, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Phương Thiện Thương, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Chất ức chế protease HIV-1 từ dịch chiết Ổi (Psidium guajava L.)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T.31(4S), tr 8-15 (NCS s dụng phần điều tra, phát hoạt tính ức chế protease HIV-1 dịch chiết Ổi) Van-Dung Nguyen, Hong-Loan Thi Nguyen¸ Linh-Chi Do, Vu Van Tuan, Phuong Thien Thuong, Tuan-Nghia Phan (2018), “A new saponin with anti-HIV-1 protease activity from Acacia pennata”, Natural Product Communications, 13(4), pp 411-414 Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Hồng Loan, Phương Thiện Thương, Bùi Phương Thuận Phan Tuấn Nghĩa (2018), “Axit 24hydroxyursolic từ Hồng (Diospyros kaki L.) chất ức chế protease HIV-1” Tuyển tập Báo cáo khoa học Nghiên cứu Giảng dạy Sinh học Việt Nam, Hội nghị khoa học Quốc gia lần thứ 3, Quy Nhơn, ngày 20 tháng năm 2018, tr 713– 721 25 ... HIV– (pepsin) - Tinh số chất ức chế protease HIV -1 từ thực vật sàng lọc - Nghiên cứu số tính chất chất ức chế protease HIV -1 thu nhận Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án thực chủ yếu Phịng... tách chiết nghiên cứu tính chất chất ức chế protease HIV -1 có nguồn gốc thực vật - Thành công đề tài tiền đề cho việc phát triển thuốc ức chế protease HIV -1 Bố cục luận án Luận án gồm 11 2 trang... thực tế số hợp chất ức chế protease HIV -1 tinh từ nguồn thực vật nghiên cứu có axit maslinic biết chất ức chế protease HIV -1 (Xu tập thể, 19 96) Khả ức chế protease HIV -1 axit maslinic với số axit