Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá cây chùm ruột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ¾¾¾¾¾¾¾¾¾ HUỲNH THỊ TUYẾT ANH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY CHÙM RUỘT Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN MẠNH LỤC Đà Nẵng – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Huỳnh Thị Tuyết Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tượng mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CHI PHYLLANTHUS - HỌ PHYLLANTHACEAE .4 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT 1.2.1 Tên gọi 1.2.2 Nguồn gốc phân bố 1.2.3 Điều kiện sinh trưởng phát triển .6 1.2.4 Mô tả chung chùm ruột CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 15 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Xử lí nguyên liệu 15 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 16 2.1.4 Sơ đồ chiết tách phương pháp chiết soxhlet .17 2.1.5 Sơ đồ chiết tách, xác định thành phần hóa học phân đoạn từ tổng cao metanol 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Phương pháp phân tích trọng lượng 19 2.2.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS 19 2.2.3 Cơ sở lý thuyết phương pháp chiết 20 2.2.4 Cơ sở lý thuyết phương pháp GC/MS [27] 24 2.3 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ .26 2.3.1 Xác định độ ẩm 26 2.3.2 Xác định hàm lượng tro .27 2.3.3 Xác định hàm lượng kim loại 28 2.4 CHIẾT SOXHLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT 29 2.5 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH 30 2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiệt độ đến trình chiết chùm ruột 30 2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ rắn - lỏng đến trình chiết bột chùm ruột .30 2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng số lần chiết đến trình chiết bột chùm ruột .31 2.6 ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT TỪ LÁ CHÙM RUỘT CHO QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP BẰNG SẮC KÝ 31 2.7 KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG .32 2.7.1 Nguyên tắc 32 2.7.2 Chuẩn bị dụng cụ thuốc thử 33 2.7.3 Cách tiến hành .35 2.7.4 Cách hình vết sắc ký để xác định Rf 36 2.8 SẮC KÝ CỘT 37 2.8.1 Lựa chọn dung môi 37 2.8.2 Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột .39 2.8.3 Nạp mẫu vào cột dạng khô .40 2.8.4 Chạy cột tổng silicagel .40 2.8.5 Dung môi giải ly 41 2.8.6 Theo dõi trình giải ly 42 2.8.7 Chọn phân đoạn tiếp tục khảo sát 43 2.9 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 44 2.9.1 Nguyên liệu 44 2.9.2 Hóa chất .44 2.9.3 Dụng cụ 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 47 3.1.1 Độ ẩm 47 3.1.2 Hàm lượng tro 47 3.1.3 Hàm lượng kim loại .48 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT SOXHLET KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT 49 3.2.1 Kết khối lượng cao chiết .49 3.2.2 Dịch chiết soxhlet hexane 50 3.2.3 Dịch chiết soxhlet dung môi chloroform 53 3.2.4 Dịch chiết soxhlet dung môi ethyl acetate 57 3.2.5 Dịch chiết soxhlet dung môi methanol .59 3.2.6 Tổng kết thành phần dịch chiết từ chùm ruột 63 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH 65 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian .65 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ .66 3.3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ rắn – lỏng 67 3.3.4 Ảnh hưởng số lần chiết 68 3.4 KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ TỔNG CAO METHANOL TỪ LÁ CHÙM RUỘT BẰNG CHIẾT PHÂN ĐOẠN LỎNG - LỎNG 69 3.4.1 Cao chiết hexane từ tổng cao methanol .69 3.4.2 Cao chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol 72 3.5 KẾT QUẢ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE 76 3.5.1 Kết chạy cột tổng cột sắc kí phân đoạn 77 3.5.2 Sắc ký đồ GC phân đoạn Aa7.17 .78 2.5.3 Sắc ký đồ GC phân đoạn ea1 .80 3.5.4 Sắc ký đồ GC phân đoạn ea2 .82 3.5 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 83 3.5.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn E.Coli 84 3.5.2 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .86 TÀI LIỆU THAM KHẢO .88 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (bản sao) PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS : Atomic Absorption Spectrophotometric GC : Gas Chromatography MS : Mass Spectrometry STT : Số thứ tự TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam UV/VIS : Ultraviolet-Visible Spectroscopy VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Số hiệu Trang 2.1 Hóa chất sử dụng q trình làm thí nghiệm 16 2.2 Một số tỉ lệ dung môi chạy sắc ký mỏng 38 3.1 Kết xác định độ ẩm bột chùm ruột 47 3.2 Kết xác định hàm lượng tro chùm ruột 48 3.3 Hàm lượng kim loại chùm ruột 48 3.4 Khối lượng cao dịch chiết hexane, ethyl acetate, 50 chloroform, methanol 3.5 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet hexane 52 chùm ruột 3.6 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet chloroform 55 chùm ruột 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet ethyl acetate 58 chùm ruột 3.8 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet methanol 61 chùm ruột 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet từ 63 chùm ruột 3.10 Kết khảo sát thời gian chiết dung môi ethyl 65 acetate 3.11 Kết khảo sát nhiệt độ chiết dung môi ethyl 66 acetate 3.12 Kết khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng chiết dung môi ethyl acetate 67 Tên bảng Số hiệu 3.13 Kết chưng ninh bột chùm ruột dung môi Trang 68 ethyl acetate điều kiện thích hợp 3.14 Thành phần hóa học dịch chiết hexane chùm 71 ruột 3.15 Thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate 74 chùm ruột 3.16 Thành phần hóa học phân đoạn Aa7.17 79 3.17 Thành phần hóa học phân đoạn ea1 81 DANH MỤC CÁC HÌNH Số Tên hình Trang hiệu 1.1 Hoa chùm ruột 1.2 Quả chùm ruột 1.3 Quả chùm ruột nấu nhiệt độ cao chuyển sang màu đỏ 1.4 Thân chùm ruột 10 1.5 Nhánh chùm ruột 10 1.6 Cây chùm ruột (Phyllanthus acidus (L.) Skeels) 11 2.1 Cây chùm ruột Liên Chiểu, Đà Nẵng tháng năm 2014 15 2.2 Lá chùm ruột phơi khô xay thành bột 15 2.3 Hộp nhựa đựng bột chùm ruột sau nghiền nhỏ 16 2.4 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm chiết soxhlet 17 2.5 Sơ đồ điều chế loại cao chiết 18 2.6 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 2.7 Chiết máy soxhlet 24 2.8 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ 25 2.9 Mẫu bột chùm ruột tro hóa 28 2.10 Hệ thống ống sinh hàn dùng chiết soxhlet bột 29 chùm ruột với dung môi hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol 2.11 Các cao chiết hexane, ethyl acetate methanol 32 2.12 Sáu bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy kín 34 2.13 Buồng soi UV ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm 37 365nm 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thực đề tài “Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học số dịch chiết chùm ruột”, thu số kết sau: Xác định thông số hóa lý nguyên liệu chùm ruột: - Độ ẩm trung bình bột chùm ruột khơ 9.778% - Hàm lượng tro trung bình 6.390% - Hàm lượng kim loại As, Pb, Cu nằm khoảng cho phép theo định Bộ Y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 04 năm 1992 hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép rau sấy khô Dùng phương pháp chiết soxhlet xác định định danh GC/MS 11 cấu tử dịch chiết hexane, 14 cấu tử dịch chiết chloroform, 10 cấu tử dịch chiết ethyl acetate 13 cấu tử dịch chiết methanol Dùng phương pháp chiết lỏng - lỏng với tổng cao methanol định danh GC/MS định danh cấu tử dịch chiết hexane, 13 cấu tử dịch chiết ethyl acetate Đã khảo sát điều kiện trình chiết chưng ninh với dung môi ethyl acetate cho kết tốt là: thời gian: giờ, nhiệt độ: 80oC, tỉ lệ rắn - lỏng: 1(g):10(ml) Hoạt tính sinh học Cao chiết phân đoạn ethyl acetate chùm ruột có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định, với cao chiết phân đoạn methanol ethanol hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn kiểm định 87 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết đề tài mong muốn đề tài phát triển rộng số vấn đề sau: Trong trình nghiên cứu, tơi có kiến nghị sau: Hàm lượng Phytol, γ-Sitosterol, All-trans-Squalene, Vitamin E chùm ruột tương đối cao, nên xem chùm ruột nguồn dược liệu quý Vì cần nghiên cứu phương pháp tách cấu tử có nhiều ứng dụng y học thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu sống Đồng thời thử hoạt tính sinh học chất tách để có nhìn tổng qt hoạt tính sinh học chùm ruột, góp phần làm tăng giá trị sử dụng chữa bệnh chùm ruột Các kết nghiên cứu sở để tạo chế phẩm có hoạt tính độc tế bào vi khuẩn kiểm định, góp phần vào việc điều trị bệnh từ cao chiết EtOAc chùm ruột, loài trồng phổ biến thành phố lớn nước 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Y tế (1998), Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh lương thực, thực phẩm, Hà Nội [2] Võ Văn Chi, Phương Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật-thực vật bậc cao, Nhà xuất Đại học Trung học chun nghiệp [3] Trịnh Đình Chính, Nguyễn Thị Bích Tuyết (2013), Hợp chất tự nhiên, Bộ giáo dục đào tạo trung tâm đào tạo từ xa [4] Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề số hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [5] Phan Văn Dân (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học có phèn đen (Phyllanthus reticulates poir euphorbiaceae), Luận văn Thạc sĩ, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên [6] Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học [7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2006), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [8] Võ Thị Như Thảo (2015), Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học vỏ thân chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam số dịch chiết, Luận văn Thạc sĩ, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Tiếng Anh [9] Janick, Jules; Robert E Paull (2008), The Encyclopedia of Fruit & Nuts CABI, pp 373 89 [10] Leeya, Yuttapong; Mulvany, Michael J, Queiroz, Emerson F, Marston, Andrew, Hostettmann, Kurt, Jansakul, Chaweewan (2010), Hypotensive activity of an n-butanol extract and their purified compounds from leaves of Phyllanthus acidus (L.) Skeels in rats, European Journal of Pharmacology 649 (1–3): 301–13 [11] Morton J (1987), Otaheite Gooseberry, In: Fruits of warm climates, Julia F, Morton, Miami, FL, pp 217–219 [12] National Geographic (2008), Edible: an Illustrated Guide to the World's Food Plants National Geographic Books, pp 110 [13] Sousa, M.; Ousingsawat, J, Seitz R, Puntheeranurak S, Regalado A, Schmidt A, Grego T, Jansakul C et al (2006), An Extract from the Medicinal Plant Phyllanthus acidus and Its Isolated Compounds Induce Airway Chloride Secretion: A Potential Treatment for Cystic Fibrosis Molecular Pharmacology 71 (1): 366–76 [14] Venkata Raman, Samuel La, Pardha Saradhi, Narashimha Rao, Naga Vamsi Krishna, Sudhakar and Radhakrishnan, (2012), Antibacterial, antioxidant activity and GC-MS analysis of Eupatorium odoratum, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, pp 6-7 Internet [15] http://duocthaothucdung.blogspot.com/2014/05/chum-ruot-otaheitegooseberry.html (04/01/2015) [16] http://en.wikipedia.org/wiki/Phyllanthus_acidus (17/01/2015) [17] http://vi.wikipedia.org/wiki/Axit_gallic (25/01/2015) [18] https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-than-go-lon/cay-chumruot (03/02/2015) 90 [19] https://www.benhvienlongxuyen.com/nuke/modules.php?name (03/02/2015) [20] http://www.kilobooks.com/archive/index.php/t-103150.html (04/02/201) [21] http://123doc.vn/document/1214910-luan-van-tot-nghiep-nghien-cuuche-bien-nuoc-giai-khat-len-men-tu-trai-chum-ruot.htm?page=6 (19/03/2015) [22] http://en.wikipedia.org/wiki/Stigmasterol (02/04/2015) [23] http://en.wikipedia.org/wiki/Phytol (02/04/2015) [24] http://en.wikipedia.org/wiki/Squalene (02/04/2015) [25] http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-Linolenic_acid (07/04/2015) [26] http://phunuonline.com.vn/suc-khoe/loi-ich-bat-ngo-tu-chum-ruot30647/ (12/11/2015) [27] http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/5167719 (12/11/2015) [28] http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm (12/11/2015) PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1.1 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết hexane 1.2 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết chloroform 1.3 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate 1.4 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết methanol 1.5 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học cao chiết methanol 1.6 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết hexane từ tổng cao methanol 1.7 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol 1.8 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học phân đoạn ea1 1.9 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học phân đoạn ea2 1.10 Sắc ký đồ xác định thành phần hóa học phân đoạn Aa7.17 ... chloroform 55 chùm ruột 3.7 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet ethyl acetate 58 chùm ruột 3.8 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet methanol 61 chùm ruột 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết soxhlet... lượng kim loại 28 2.4 CHIẾT SOXHLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT 29 2.5 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG... 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT SOXHLET KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT 49 3.2.1 Kết khối lượng cao chiết .49 3.2.2 Dịch chiết soxhlet