Giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus gumboro phân lập ở việt nam nhằm cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới

Luận văn

2010VN22372 bộ giáo dục và đào tạo Trờng đại học nông nghiệp hà nội Lê thị kim xuyến giải mã phân đoạn a hệ gen các chủng virus gumboro PHÂN LậP ở việt nam NHằM cung cấp nguồn gen cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới Luận án tiến sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y M số : 62 62 50 10 Ngời hớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Thanh Hòa 2. TS. Nguyễn Bá Hiên Hà Nội - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là số liệu ñầu tiên, hoàn toàn trung thực, chưa ñược công bố trong bất kỳ công trình hay tạp chí nào khác ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Nghiên cứu sinh Lê Thị Kim Xuyến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS. Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên - Trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, thầy ñồng hướng dẫn, ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ cho ñề tài cấp Nhà nước KC.04.29 (2004 - 2006). Tôi xin chân thành cảm ơn: - Tập thể các anh chị em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - là nơi tôi công tác và cũng chính là nơi học tập nghiên cứu, ñã giúp tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. - Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn. - TS. Nguyễn Bá Thành, PGS.TS. ðinh Thị Bích Lân và các ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu bệnh phẩm. - Viện ðào tạo Sau ñại học và các cán bộ phụ trách ñào tạo ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập. Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến những người thân trong gia ñình ñã luôn khuyến khích, ñộng viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình. Xin chân thành cảm ơn. Tác giả Lê Thị Kim Xuyến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam ñoan Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, ñồ thị MỞ ðẦU . 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GUMBORO . 4 1.1.1. Lịch sử và ñịa dư bệnh 5 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh 6 1.1.3. Cơ chế sinh bệnh . 8 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng 10 1.1.5. Bệnh tích . 10 1.1.6. Chẩn ñoán bệnh . 13 1.1.7. Phòng bệnh Gumboro . 13 1.2. SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO . 15 1.2.1. Hệ gen của virus Gumboro 16 1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng . 19 1.2.3. Kháng nguyên của virus Gumboro . 26 1.2.4. Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của IBDV………………… . 28 1.2.5. Cơ chế phân tử của quá trình “chết theo chương trình” (apoptosis) và hậu quả do virus Gumboro gây ra………………. 31 1.2.6. Epitope và sự biến ñổi tính kháng nguyên và ñộc lực . 34 1.3. CÁC CHỈ THỊ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS GUMBORO 40 1.3.1. Phản ứng RT-PCR thông dụng trong nghiên cứu phân tử virus Gumboro 40 1.3.2. Chỉ thị di truyền sử dụng vùng “siêu biến ñổi” 42 1.3.3. Chỉ thị di truyền sử dụng toàn bộ gen kháng nguyên VP2 . 43 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS GUMBORO Ở VIỆT NAM 44 1.5. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS GUMBORO . 48 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6 Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 51 2.1. NỘI DUNG 51 2.1.1. Giải trình tự chuỗi nucleotide gen kháng nguyên VP2 và phân ñoạn A (VP2-4-3) của virus Gumboro phân lập tại Việt Nam 51 2.1.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên các gen trong phân ñoạn A 51 2.1.3. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới dựa trên toàn bộ phân ñoạn A 52 2.2. VẬT LIỆU 52 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 2.3.1 Phương pháp chọn và lấy mẫu 55 2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số . 55 2.3.3. Phương pháp RT-PCR 56 2.3.4. Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng ñiện di trên thạch agarose 57 2.3.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 58 2.3.6. Phương pháp tạo dòng 58 2.3.7 Phương pháp thu nhận DNA ñích trong sản phẩm PCR/RT-PCR nhiều ñoạn . 63 2.3.8. Phương pháp cắt-nối-ghép DNA . 64 2.3.9. Phương pháp giải trình tự 64 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học . 66 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71 3.1. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI NUCLEOTIDE GEN KHÁNG NGUYÊN VP2 VÀ PHÂN ðOẠN A (VP2-4-3) . 71 3.1.1. Kết quả xác ñịnh mẫu bệnh phẩm cung cấp nguồn RNA hệ gen virus 71 3.1.2. Kết quả giải trình tự gen kháng nguyên VP2 74 3.1.3. Kết quả giải trình tự phân ñoạn A 77 3.1.3.1. Giải trình tự phân ñoạn A chủng BDG23 từ mẫu bệnh phẩm thu nhận tại Bình Dương . 78 3.1.3.2. Giải trình tự phân ñoạn A chủng GHUT-12 từ mẫu bệnh phẩm thu nhận tại Thừa Thiên-Huế . 81 3.1.3.3. Giải trình tự phân ñoạn A từ chủng cường ñộc cổ ñiển G202 phân lập tại Hà Nội . 84 3.1.4. Danh sách ñăng ký Ngân hàng gen các chủng Gumboro 86 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7 3.2. PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI DỰA TRÊN CÁC GEN TRONG PHÂN ðOẠN A . 89 3.2.1. PHÂN TÍCH GEN VP2 . 91 3.2.1.1. Về thành phần nucleotide, amino acid 91 3.2.1.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 96 3.2.1.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 100 3.2.2. PHÂN TÍCH GEN VP5 . 103 3.2.2.1. Về thành phần nucleotide và amino acid . 103 3.2.2.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 106 3.2.2.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP5 108 3.2.3. PHÂN TÍCH GEN VP4 . 109 3.2.3.1. Về thành phần nucleotide và amino acid 109 3.2.3.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) 112 3.2.3.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP4 113 3.2.4. PHÂN TÍCH GEN VP3 . 115 3.2.4.1. Về thành phần nucleotide và amino acid 115 3.2.4.2. Phân tích ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) . 118 3.2.4.3. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ sử dụng gen VP3 119 3.3. PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CÁC CHỦNG GUMBORO VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI DỰA TRÊN TOÀN BỘ PHÂN ðOẠN A 121 3.3.1. Phân tích ñặc tính sử dụng nucleotide/amino acid ñể kiến tạo phân ñoạn A (VP2-4-3) ở 3 chủng BDG23, GHUT-12, G202 . 121 3.3.2. Về thành phần nucleotide và amino acid 124 3.3.3. Phân tích tỷ lệ ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) . 128 3.3.4. Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 130 3.4. THẢO LUẬN CHUNG 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 140 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ . 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 143 PHỤ LỤC . 161 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AGP Agar Gel Precipitation Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch bp Base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung CEF Chicken Embryo fibroblast Môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp CEK Chicken Embryo Kidney cells Môi trường tế bào thận thai gà CPE Cytopathic Effect Bệnh tích tế bào cv classical virulent Virus ñộc tính cổ ñiển Da dalton DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme gs group-specific Kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm IBD Infectious Bursal Disease Bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm IBDV Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm INF Interferon kDa kilo dalton m.o.i multiplicity of infection Tỷ lệ gây nhiễm ORF Open Reading Frame Khung ñọc mở RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction SPF Special Pathogen Free Sạch mầm bệnh ts type-specific Kháng nguyên ñặc hiệu theo týp VN Virus Neutralization Phản ứng trung hòa VP Viral protein Protein của virus vvIBDV Very virulent Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm có ñộc lực cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 2.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm Gumboro sử dụng nghiên cứu 53 2.2 Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt trong nghiên cứu sinh học phân tử virus Gumboro 56 2.3 Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR và giải trình tự trong nghiên cứu virus Gumboro . 57 3.1 Danh sách bản quyền ñăng ký gen VP2 và phân ñoạn A (VP2-4-3) trong Ngân hàng gen sử dụng trong nghiên cứu 87 3.2 Danh sách các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới sử dụng các gen của phân ñoạn A trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 88 3.3 Vị trí sai khác nucleotide (74/178) dẫn ñến sai khác amino acid của gen kháng nguyên VP2 (1356 bp) giữa 28 chủng so sánh . 93 3.4 55 vị trí sai khác amino acid của protein VP2 giữa 28 chủng so sánh 94 3.5 Sai khác về amino acid tại các vị trí quan trọng có vai trò quyết ñịnh về tính kháng nguyên và ñộc lực của virus Gumboro ở các chủng của Việt Nam và thế giới . 95 3.6 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về amino acid (dưới ñường chéo) của gen kháng nguyên VP2 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới . 97 3.7 Tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotide (dưới ñường chéo) và amino acid (trên ñường chéo) của 16 chủng Gumboro trong nghiên cứu này (gen kháng nguyên VP2)……………………………………… 100 3.8 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn ñên sai khác amino acid (21 trong số 28 sai khác) của gen mã hóa cho protein VP5 giữa 28 chủng so sánh . 104 3.9 20 vị trí sai khác về amino acid của protein VP5 giữa 28 chủng so sánh 105 3.10 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng amino acid (dưới ñường chéo) gen VP5 của các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới 107 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10 3.11 Vị trí sai khác về nucleotide (26 trong số 109) dẫn ñên sai khác amino acid của gen VP4 giữa 15 chủng 110 3.12 22 vị trí sai khác amino acid của protein enzyme VP4 giữa 15 chủng 110 3.13 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid ở VP4 giữa các chủng Âu - Mỹ và Châu Á 111 3.14 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP4 giữa 15 chủng so sánh. 112 3.15 Vị trí sai khác nucleotide (36 trong số 95) dẫn ñến sai khác amino acid của gen VP3 giữa 15 chủng so sánh . 117 3.16 25 vị trí sai khác amino acid của protein VP3 giữa 15 chủng so sánh 117 3.17 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về amino acid (dưới ñường chéo) của gen VP3 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới 118 3.18 Thành phần nucleotide sử dụng trong VP2-4-3 (3039 nucleotide) ở phân ñoạn A của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202 . 122 3.19 Thành phần amino acid sử dụng trong polypeptide chung do VP2-4-3 mã hóa của 3 chủng BDG23, GHUT-12 và G202 123 3.20 Các vị trí có sai khác về nucleotide trong phân ñoạn A có ñộ dài 3039 bp giữa 3 chủng Gumboro của Việt Nam, lần lượt theo trật tự các gen VP2-VPx-VP4-VP3 . 126 3.21 Các vị trí sai khác amino acid của protein chung trong phân ñoạn A giữa các chủng Gumboro của Việt Nam và thế giới, lần lượt theo trật tự phân bố VP2-VPx-VP4-VP3 . 127 3.22 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng về amino acid (dưới ñường chéo) của VP2-4-3 ở các chủng Gumboro Việt Nam và thế giới (Âu-Mỹ và Châu Á) 129 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ, nơi ñầu tiên phát hiện bệnh Gumboro . 6 1.2 Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử . 6 1.3 Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho B bị nhiễm . 7 1.4 Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ 11 1.5 Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công . 12 1.6 Các hạt virus nhìn dưới kính hiển vi ñiện tử . 15 1.7 Hệ gen của virus Gumboro bao gồm 2 phân ñoạn A và B nhìn dưới kính hiện vi ñiện tử . 17 1.8 Sơ ñồ hệ gen và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và II 18 1.9 Các phân ñoạn A và B của hệ gen virus Gumboro qua ñiện di DNA và các thành phần protein qua ñiện di protein . 20 1.10 Sơ ñồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu trúc . 24 1.11 Quy luật biến ñổi epitope: cường ñộc -> ñộc lực yếu -> nhược ñộc và ngược lại . 36 1.12 Sơ ñồ minh họa các bước của một chu kỳ phản ứng PCR 42 2.1 Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát ñể thu nhận các chuỗi gen……… 55 2.2 Cấu trúc của vector pCR ® 2.1TOPO (Invitrogen)…………………… . 59 2.3 Quy trình tách chiết plasmid tái tổ hợp…………………………… . 61 3.1 Sơ ñồ minh họa vùng “siêu biến ñổi” hệ gen IBDV và vị trí bám của cặp mồi GF-GR…………………………………………………… . 72 3.2 Kết quả ñiện di kiểm tra RNA tổng số, và sản phẩm RT-PCR sử dụng cặp mồi GF-GR……………………………………………… . 72 3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI……………………………………………………… . 73 3.4 Giản ñồ (chromatogram) một phần trình tự vùng “siêu biến ñổi” gen kháng nguyên VP2 của chủng BDG………………………………… . 74