Nghiên cứu độc lực của chủng virus cúm gia cầm a MDK VIETNAM NGHEAN NCVD15A52 2015 h5n6 phân lập tại việt nam và đánh giá hiệu lực của một số loại vacxin phòng bệnh luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ THỊ THU PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA CHỦNG VIRUS CÚM GIA CẦM A/MDK/VIETNAM(NGHEAN)/NCVD15A52/2015 (H5N6) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ LOẠI VACXIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tô Long Thành TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc bảo vệ học vị - Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Ngô Thị Thu Phƣơng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hƣớng dẫn khoa học PGS TS Tô Long Thành, TS Lê Văn Phan tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm, khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng - Cục Thú y giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Ngô Thị Thu Phƣơng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 2.1 Sơ lƣợc bệnh cúm gia cầm 2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm giới 2.1.3 Bệnh cúm gia cầm Việt Nam 2.2 Căn bệnh cúm gia cầm 10 2.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc 10 2.2.2 Đặc tính kháng nguyên virus cúm type A 12 2.2.3 Thành phần hóa học sức kháng virus 14 2.2.4 Quá trình nhân lên virus 14 2.2.5 Độc lực virus 15 2.2.6 Sức đề kháng virus 16 2.2.7 Nuôi cấy lƣu giữ virus 16 2.3 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 16 2.3.1 Loài vật mang virus 16 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 17 2.3.3 Sự truyền lây 18 2.4 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 19 2.4.1 Triệu chứng 19 iii 2.4.2 Bệnh tích 19 2.5 Phƣơng pháp chẩn đoán cúm gia cầm 20 2.5.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 20 2.5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 20 2.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 21 2.7 Miễn dịch học chống virus cúm gia cầm 21 2.7.1 Miễn dịch không đặc hiệu 22 2.7.2 Miễn dịch đặc hiệu 23 2.7.3 Miễn dịch chủ động 24 2.7.4 Miễn dịch thụ động 25 2.7.5 Những yếu tố ảnh hƣởng đến hình thành kháng thể 25 2.8 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 26 Phần Nội dung phƣơng pháp- nghiên cứu 29 3.1 Nội dung nghiên cứu 29 3.2 Địa điểm nghiên cứu 29 3.3 Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.3.1 Nguyên liệu 29 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 30 3.3.3 Phƣơng pháp điều tra hồi cứu 32 3.3.4 Phƣơng pháp mổ khám toàn diện 33 3.3.5 Phƣơng pháp làm tiêu vi thể 35 3.3.6 Phƣơng pháp lấy mẫu bảo quản bệnh phẩm 36 3.3.7 Phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát virus 37 3.3.8 Phƣơng pháp phát kháng thể 39 3.3.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu 40 Phần Kết thảo luận 42 4.1 Kết nghiên cứu độc lực virus cúm gia cầm gà thí nghiệm 42 4.1.1 Kết nghiên cứu độc lực virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4B phƣơng pháp công cƣờng độc qua đƣờng tiêm tĩnh mạch 42 4.1.2 Kết nghiên cứu độc lực virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4B phƣơng pháp công cƣờng độc qua đƣờng nhỏ mũi 44 4.2 Bệnh tích đại thể, vi thể đàn gà sau công cƣờng độc 48 iv 4.2.1 Bệnh tích đại thể 48 4.2.2 Bệnh tích vi thể 53 4.3 Kết đánh giá hiệu lực vacxin với virus cúm A/H5N6 CLADE 2.3.4.4B 56 4.3.1 Kết hiệu giá kháng thể sau tiêm phịng nhóm vacxin Navet-vifluvac 56 4.3.2 Kết hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vacxin Re-5 57 4.3.3 Kết hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vacxin Re-6 58 4.3.4 Kết theo dõi lâm sàng lơ gà thí nghiệm sau công cƣờng độc virus A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) 59 4.3.5 Kết xét nghiệm virus thải sau công cƣờng độc virus A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) 63 Phần Kết luận đề nghị 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Đề nghị 66 Tài liệu tham khảo 67 Phụ lục 70 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDC Centers for Disease Control and Prevention CPE Cytopathic effect ELISA Emzyme Linked Immunosozbent Assay FAO Food and Agriculture Organization HA, H Haemagglutinin HE Hematoxylin - Eosin HI Hemagglutination Inhibitory test HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza LPAI Low Pathogenic Avian Influenza MDCK Madin – Darby – Canine - Kidney NA, N Neuraminidase NP Nucleoprotein-NP RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction WHO World Health Organization vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua tiêm tĩnh mạch 31 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua đƣờng nhỏ mũi 31 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin 32 Bảng 4.1 Bảng theo dõi lâm sàng gà công cƣờng độc virus H5N6 42 Bảng 4.2 Chỉ số Ct trung bình gà cơng cƣờng độc virus qua đƣờng tiêm tĩnh mạch 44 Bảng 4.3 Kết theo dõi lâm sàng gà công cƣờng độc virus qua đƣờng nhỏ mũi 45 Bảng 4.4 Chỉ số Ct trung bình gà cơng cƣờng độc virus qua đƣờng nhỏ mũi 47 Bảng 4.5 Bảng tổng hợp bệnh tích lơ gà thí nghiệm cơng cƣờng độc 48 Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Navet-vifluvac 56 Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-5 57 Bảng 4.8 Hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-6 58 Bảng 4.9 Bảng điểm lâm sàng tỷ lệ bảo hộ nhóm gà sau công cƣờng độc 61 Bảng 4.10 Mức độ thải virus nhóm gà thí nghiệm 63 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc virus H5N1 (http://vietsciences.free.fr) 10 Hình 4.1 So sánh diện dịch cúm gia cầm nói chung năm 2014 2015 40 Hình 4.2 Phân bố dịch cúm gia cầm tháng đầu năm 2015 tháng đầu năm 2016 42 Hình 4.3 Biểu đồ phân bố nhánh virus cúm H5N1 H5N6 Việt Nam năm 2015 43 Hình 4.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ chết thời gian theo dõi gà cơng cƣờng độc 45 Hình 4.5 Biểu đồ tỷ lệ chết gà công cƣờng độc virus H5N6 qua đƣờng nhỏ mũi 47 Hình 4.6 Biểu đồ so sánh mức độ tạo miễn dịch loại vacxin thử nghiệm 50 Hình 4.7 Biểu đồ so sánh khả bảo hộ loại vacxin thử nghiệm 53 Hình 4.8 Biểu đồ so sánh mức độ thải virus nhóm gà sau cơng cƣờng độc 55 Hình 4.9 Bệnh tích đại thể lô gà đối chứng 59 Hình 4.10 Bệnh tích đại thê lo gà tiêm vacxin Navet- vifluvac 60 Hình 4.11 Bệnh tích đại thê lo gà tiêm vacxin Re-5 60 Hình 4.12 Bệnh tích đại thê lo gà tiêm vacxin Re-6 60 Hình 4.13 Phổi xuất huyết tràn lan 61 Hình 4.14 Vi nhung khí quản bị bào mịn, biểu mơ bong tróc 61 Hình 4.15 Thận xuất huyết 61 Hình 4.16 Túi Fa xuất huyết 62 Hình 4.17 Phổi xuất huyết, tế bào nội mạc sƣng phồng 62 Hình 4.18 Biểu mơ khí quản bong tróc 63 Hình 4.19 Thận xuất huyết 63 Hình 4.20 Tuyến tụy xung huyêt, hoại tử 64 Hình 4.21 Lơng nhung ruột dung hợp 64 Hình 4.22 Túi Fabticius bị phù 64 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Họ tên học viên: Ngô Thị Thu Phƣơng Tên đề tài: ”Nghiên cứu độc lực chủng virus cúm gia cầm A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) phân lập Việt Nam đánh giá hiệu lực số loại vacxin phòng bệnh” Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Tên sở đào tạo : Học viện Nông nghiệp Việt Nam NỘI DUNG Mục đích đối tƣợng nghiên cứu: Bệnh Cúm gia cầm thể độc lực cao bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ngành chăn nuôi gia cầm sức khỏe cộng đồng Do virus Cúm gia cầm có khả biến chủng phức tạp , nhiều chủng virus xuất cơng tác phịng chống bệnh Cúm gia cầm ln vấn đề cấp thiết công tác thú y ngày Để góp phần vào việc phịng chống bệnh cúm gia cầm đạt hiệu cao, tiến hành nghiên cứu đề tài : ”Nghiên cứu độc lực chủng virus cúm gia cầm A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) đánh giá hiệu lực số loại vacxin phịng bệnh” Mục đích đề tài : - Đánh giá đƣợc độc lực chủng virus cúm gia cầm phân lập đƣợc Nghệ An – Việt Nam: A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6 - Đánh giá mức độ bảo hộ số loại vacxin lƣu hành chủng virus A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) II Các phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp điều tra hồi cứu - Phƣơng pháp công cƣờng độc virus Cúm gia cầm - Phƣơng pháp mổ khám làm tiêu vi thể - Phƣơng pháp HI phát kháng thể - Phƣơng pháp rRT-PCR phát virus cúm gia cầm ix Theo tiêu chuẩn ngành 10-TCN Bộ NN & PTNT năm 2005, hiệu giá kháng thể tối thiểu huyết phải đạt log2 có khả bảo hộ với virus đồng chủng vacxin Kết xét nghiệm cho thấy số gà đƣợc tiêm vacxin Navetvifluvac có 20,7% âm tính kháng thể 10,3% có kháng thể mức thấp (≤ log2) Số mẫu có hiệu giá kháng thể từ 4-5 log2 trở lên chiếm 70% tổng số mẫu xét nghiệm Tuy nhiên hiệu giá kháng thể tập trung mức thấp (4-5 log2) chiếm 24,1% mức trung bình (6-7 log2) chiếm 27,6% Hiệu giá kháng thể mức cao (8 đến log2) chiếm tỷ lệ thấp17,2% tổng số gà đƣợc lấy máu xét nghiệm Do hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) tồn đàn thấp đạt mức 4,7 log2 Nhƣ vậy, sau tiêm phòng vacxin Navet – vifluvac thấy khả đáp ứng miễn dịch đàn gà sau tiêm phòng vacxin thấp nhƣng đảm bảo mức bảo hộ toàn đàn với 70% tổng số mẫu xét nghiệm có hiệu giá từ log2 hiệu giá kháng thể trung bình tồn đàn đạt mức 4,7 log2 4.3.2 Kết hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vacxin Re-5 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng H5 phƣơng pháp HI thể bảng dƣới đây: Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-5 Hiệu giá kháng thể (log2) Số mẫu XN ≤3 ≥9 Số mẫu đạt 30 2 3 18 Tỷ lệ % 100 0,0 3,3 6,7 6,7 3,3 10,0 10,0 60,0 GMT 7,8 Kết xét nghiệm cho thấy số gà đƣợc tiêm vacxin Re-5 khơng có mẫu xét nghiệm âm tính với kháng thể cúm, có mức thấp (≤ log2) Hầu hết số mẫu xét nghiệm có hiệu giá kháng thể cao với tỷ lệ 96,6% tổng số mẫu xét nghiệm cho hiệu giá kháng thể ≥ log2 Số mẫu xét nghiệm cho hiệu giá kháng thể mức thấp (4-5 log2) chiếm 13,3%; số mẫu xét nghiệm cho hiệu giá kháng thể mức trung bình (6-7 log2) chiếm 13,3%; số mẫu xét nghiệm cho hiệu giá kháng thể mức cao chiếm tới 70%, đặc biệt số mẫu xét nghiệm cho hiệu giá kháng thể ≥ log2 chiếm tới 60% tổng số mẫu gà xét nghiệm 57 Từ kết xét nghiệm thấy khả đáp ứng miễn dịch đàn gà sau tiêm phòng vacxin Re-5 cao với hiệu giá kháng thể trung bình đạt mức 7,8 log2 4.3.3 Kết hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vacxin Re-6 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng H5 phƣơng pháp HI thể bảng dƣới Bảng 4.8 Hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-6 Số mẫu đạt Tỷ lệ % Hiệu giá kháng thể (log2) Số mẫu XN 30 100 6,7 ≤3 16,7 13,3 ≥9 GMT 13,3 20,0 13,3 6,7 10,0 5,3 Trong số gà đƣợc tiêm vacxin Re-6 có 6,7% số mẫu không phát thấy kháng thể kháng cúm H5 16,7% số mẫu có kháng thể mức thấp (≤ log2) Hầu hết mẫu có mức hiệu giá kháng thể tập trung khoảng – log2 (chiếm 50% tổng số mẫu xét nghiệm) Hiệu giá kháng thể trung bình tồn đàn (GMT) đạt mức 5,3 log2 Nhƣ kết cho thấy loại vacxin tạo miễn dịch cho đàn gà thí nghiệm, hiệu giá kháng thể trung bình GMT log2 80 70 tỷ lệ % 60 50 NavetVifluvac Re-5 40 30 20 10 Âm tính