Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5 -T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập

Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5 -T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập

Phạm Ngọc Long

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR

XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2009

Phạm Ngọc Long

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR

XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nghiêm Ngọc Minh

Thái Nguyên - 2009

Nghiêm Ngọc Minh Trưởng Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện

Công Nghệ sinh Học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Trong quá trình nghiên cứu vửa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ

bảo tận tình của PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt là Ths Nguyên Bá Hữu, CN Nguyễn Văn Bắc, KS Cung Thị Ngọc Mai, những người đã giúp đỡ tôi trong quá

trình thực hiện luận án của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2009

2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3 1 Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D 3

4 Một số phương pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5-T và 2,4-D 9 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học 9

4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10

5 Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 15

6 Phân loại vi sinh vật 21

6.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển 21

6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 22

2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.1 Môi trường nuôi cấy 26

2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật 27

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27

2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 28

2.3.1 Nhuộm Gram 28

2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét 28

2.4 Phương pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T 29

2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29

2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29

2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR 30

2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose 31

2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31

2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31

2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32

2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas 33

2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34

2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 34

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

1 Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí 35

1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật 35

1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37

2 Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 38

2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39

2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR 40

2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pBT 41

2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 43

3 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng HR5.1 47

3.1 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH 47

3.2 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng HR5.1 49

3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 49

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 50

3.2.3 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

MỞ ĐẦU

Trong cuộc chiến tranh xâm lược của Mỹ tiến hành ở Việt Nam, hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và 2,3,7,8 TCDD đã được rải xuống hơn 20% diện tích của miền Nam Theo công bố của Stellman và cộng sự trên tạp chí Nature năm 2003 thì 20 chất diệt cỏ khác nhau đã được sử dụng Chu kỳ bán hủy của dioxin và các chất tương tự dioxin rất dài, có khi đến vài chục năm hoặc hàng trăm năm [15],[42] Qua các điều tra nghiên cứu của nhiều cơ quan khoa học và công nghệ ở Việt Nam và quốc tế cho thấy, đất của sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa độ tồn lưu của PCDD, PCDF, 2,4,5-T và 2,4-D vẫn còn cao 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất Ngoài ra một lượng không nhỏ các chất DCP, TCP và PAH cũng đã được xác định trong các mẫu đất tại khu vực bị nhiễm độc Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc tại “điểm nóng” ở Đà Nẵng thu được kết quả rất khả quan

Tuy nhiên để xử lý các điểm ô nhiễm cục bộ chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có các công nghệ phân hủy sinh học phù hợp Hiện nay, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học đang tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin bằng công nghệ tăng cường sinh học trong các bioreactor hiếu khí và kỵ khí Trong quá trình xử lý, ngoài sự điều khiển về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ thì vai trò của các vi sinh vật có trong bioreactor là rất quan trọng Để tăng hiệu quả và hoàn thiện công nghệ cần tăng thêm hiểu biết về đặc điểm vi sinh vật có trong bioreactor, cũng như vai trò của các vi sinh vật phân hủy chất độc được bổ sung vào

bioreactor Nhằm đáp ứng yêu cầu của thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ đã được thực

hiện

Luận án đã thực hiện đƣợc các nội dung nghiên cứu sau đây

 Làm giầu vi sinh vật từ các mẫu đất trong bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên 2,4,5-T và 2,4-D

 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng vi khuẩn phân lập được  Phân loại định tên chủng vi khuẩn được chọn lựa

 Xác định khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn nghiên cứu Luận án này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học và là một phần đề cấp Viện Khoa học và công nghệ

Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến“ do PGS.TS Đặng Thị Cẩm

Hà chủ trì

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1 Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D

Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ đã rải hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng ở miền Trung và Nam Việt Nam [42] Các chất diệt cỏ đã được sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, các chất này được gọi tên theo mầu đánh dấu trên các thùng phuy chứa chúng, mỗi thùng khoảng 250l [42] Các chất diệt cỏ thường là hỗn hợp của hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) và 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1) Dioxin là tạp chất được sinh ra trong quá trình sản xuất 2,4,5-T Hàm lượng dioxin trong các chất diệt cỏ rất khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa trong chất diệt cỏ mà Mỹ đã dùng trong chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của các chất diệt cỏ quân đội Mỹ đã sử

dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]

Tên chất

Thành phần hoá chất

Độ đậm đặc tương đương

Sử dụng trong trong năm

Số lượng ước tính đã

rải (lít)

Chất hồng

60% - 40% n-Butyl: isobutylester của 2,4,5-T

961-1081 g/l acid tương đương

1961-1965 503.121; 413,852

Chất xanh lá cây

n-Butylester của 2,4,5-T

Giống như chất hồng

Chưa rõ, rải cùng thời gian với chất hồng

31.026

Chất tím

50%n-Butylester 2,4,D

1033 g/l acid tương đương

1962-1965 1.892.773

2,4,5-T

20% isobutyl ester 2,4,5-T

Chất da cam (1)

50% n-Butyl ester 2,4-D

50% n-Butyl ester 2,4,5-T

1033 g/l acid tương đương

1965-1970 45.677.937 (có thể bao gồm cả chất da cam)

Chất da cam (2)

50% n-Butyl ester 2,4-D

50% n-Butyl ester 2,4,5-T

910 g/l acid tương đương

Sau 1968 (?)

Chưa rõ nhưng đã gửi sang Việt Nam ít nhất là: 3.591.000 Chất

trắng

Khối lượng acid cơ bản: 21,1% tri-isopropanolamine muối của 2,4-D và 5,7% picloram

Khối lượng acid: 240,2 g/l 2,4-D và 64,9 g/l picloram

1966-1971 20.556.525

Chất xanh (dạng bột)

Acid dimethylarsinic và Natri cacodylat

Acid: 65% tương đương Muối: 70% tương đương

1962-1964 25.650

Chất xanh (dạng dịch)

21% Natri cacodylat+ acid cacodylic ít nhất chiếm 26% tổng lượng acid tương đương

Khối lượng acid: 360,3 g/l

1964-1971 4.715.731

Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ trước đây là nơi tàng trữ và nạp chất diệt cỏ lên máy bay như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát có độ tồn lưu các chất độc ở mức cao và rất cao, lên tới hàng trăm nghìn ppt [15] Đặc biệt là các sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chiếm 90% tổng độ độc, nhiều mẫu đất 2,3,7,8-TCDD > 99% tất cả độ độc của PCDD và

PCDF Các kết quả phân tích còn phát hiện một lượng lớn 2,4,5-T, 2,4-D, dichlorphenol, trichlorophenol và một số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân trong các mẫu đất tại khu vực nhiễm độc [15] Ngoài ra, ô nhiễm 2,4,5-T và 2,4-D ở Việt Nam còn từ các nguồn khác Tuy nhiên, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ nghiên cứu về vi sinh vật có nguồn gốc từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ do chiến tranh

2 Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T

2,4,5-T là tên gọi tắt của acid 2,4,5-trichlorophenoxyaxetic Công thức hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol Công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T

2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến vàng nâu nhạt, tan ít trong nước, độ hòa tan trong nước ở 30o

C là 238 mg/kg, tan tốt trong dung môi hữu cơ Tỷ trọng là 1,8 g/cm3

ở 20oC Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 154o

C-158oC [43]

2,4,5-T được sử dụng như một chất diệt cỏ có tác dụng làm rụng lá cây, được phát triển vào cuối thập niên 40 của thế kỷ XX và sử dụng trong nông nghiệp 2,4,5-T là chất có độc tính mạnh, gây ung thư, dị thai, rối loạn nội

tiết, nhiễm độc tuyến sinh dục và nhiều bệnh nghiêm trọng khác Sơ đồ tổng quát quá trình tổng hợp 2,4,5-T được trình bày ở hình 1.2

i ii

1,2,4,5-Hình 1.3 Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng

độ bay hơi là 160oC Ở nhiệt độ 25o

C, 2,4-D có thể được hòa tan cới hàm lượng 900mg/l

2,4-D là thuốc diệt cỏ được tổng hợp từ các auxin, là thuốc diệt cỏ tán rộng Hiện nay chủ yếu 2,4-D được sử dụng trong những hỗn hợp pha trộn với các loại thuốc diệt cỏ khác, có vai trò như một chất tăng cường tác dụng Nó đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới

3 Ảnh hưởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trường và con người 3.1 Ảnh hưởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trường

Quân đội Mỹ đã rải chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và tạp chất dioxin lên khoảng 27% tổng diện tích Việt Nam Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị tác động của chất diệt cỏ [17] Tác dụng tức thời của chất diệt cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi hết lá, rất nhiều loài cây bị chết, môi trường và sinh cảnh bị thay đổi nhanh chóng [17] Tại các vùng rừng bị rải lặp đi lặp lại nhiều lần, hệ sinh thái rừng bị phá hủy hoàn toàn và cho đến nay tại những nơi này chưa có cây mọc tự nhiên như khu rừng Mã Đà (Đồng Nai), thung lũng A Lưới (Thừa Thiên Huế) v.v.[17]

Chất diệt cỏ sau khi được phun xuống có thể tích tụ không những trong đất mà còn phân tán trong lớp nước mặt, nước ngầm, không khí, tích tụ trong thực vật, gây nhiều sự cố và hiểm họa cho môi trường và từ đó tác động dây chuyền đến con người, động thực vật và các vi sinh vật Hậu quả là làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên Các chất này giết chết các động vật, thực vật, vi sinh vật và nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng không thể phục hồi lại được, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã và chủng loại động vật, thực vật [4], [22]

Chất độc hóa học ngấm vào trong đất, tích tụ lại trong cơ thể thực vật nên ít bị phân hủy bởi một số yếu tố như ánh sáng mặt trời, tia cực tím, nhiệt độ

Các chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp và các yếu tố môi trường nhiều khi chưa thuận lợi cho các quá trình phân hủy sinh học tự nhiên Chiến tranh kết thúc đã hơn 30 năm, lượng chất độc hóa học còn lại trong đất rất lớn, đặc biệt là 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin tại các điểm nóng Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên hòa và Phù Cát bị ô nhiễm 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin v.v ở mức độ cao Nghiên cứu chọn lựa và áp dụng các phương pháp thích hợp để tấy độc ngay các “Điểm nóng” là nhiệm vụ rất cần thiết đặt ra cho các nhà khoa học và công nghệ cần quan tâm giải quyết

3.2 Ảnh hưởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con người

Ước tính có 3181 ngôi làng Việt Nam bị rải trực tiếp, với khoảng 4,8 triệu người đã tiếp xúc với chất độc hóa học do Mỹ rải xuống [42]

Theo báo cáo mới nhất của Viện Y khoa Hoa Kỳ năm 2002, có 37 bệnh ở người liên quan đến dioxin ở các cấp độ khác nhau như ban clo, ung thư mô mềm, ung thư dạng Hodkin, ung thư dạng không Hodkin, một số bệnh thần kinh cấp tính, gai đốt cột sống, sẩy thai, dị tật bẩm sinh v.v [32]

Trong số những người đã tiếp xúc với các chất độc hóa học này Nhiều người bị phơi nhiễm đã mắc phải những căn bệnh nguy hiểm và một số bệnh di truyền cả sang các thế hệ sau [16]

4 Một số phương pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có T và 2,4-D

2,4,5-4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học

Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng cho chất thải nguy hại, rác thải, kể cả các chất độc hóa học Ưu điểm của phương pháp là giá thành rẻ nhưng chất

độc vẫn nằm trong các hố chôn lấp không được phân hủy nên các chất độc hóa học này có thể là nguồn ô nhiễm tiềm tàng cho môi trường và con người

Các phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng các tia cực tím, hay dùng áp suất cao cũng có hiệu quả Theo các kết quả công bố cho thấy rằng sử dụng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20W/cm3

ở nhiệt độ 20oC trong 3 ngày Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng cho những lớp đất mỏng bề mặt dầy dưới vài milimet [14], [41]

Phương pháp thiêu đốt cũng được nhiều nước lựa chọn để xử lý dioxin Nguyên lý của phương pháp là dùng nhiệt độ cao để phân hủy dioxin đạt hiệu quả đến 99,99%, nhưng phương pháp này có nhược điểm là giá thành xử lý cao, đó là chưa kể đến kinh phí đào, vận chuyển đất đến lò đốt và có thể tạo ra các sản phẩm phụ gây ô nhiễm thứ cấp [18]

Phương pháp declo hóa và oxy hóa cũng được nghiên cứu áp dụng với các chất chứa clo và cả 2,3,7,8-TCDD Phương pháp này cũng cho kết quả khá tốt, thường tạo ra những hợp chất ít clo và ít độc hơn [19], [24],[14] Nhược điểm của phương pháp hóa học là không kiểm soát được sản phẩm tạo thành, các sản phẩm này thường gây ô nhiễm thứ cấp

Các phương pháp xử lý cơ học, vật lý, hóa học nói chung đều có nhược điểm là tốn kém và không triệt để, dễ gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường Phương pháp xử lý ô nhiễm bằng công nghệ sinh học đang được đặc biệt chú ý do tính an toàn và kinh tế của nó Phương pháp này đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu, phát triển

4.2 Phương pháp phân hủy sinh học

Phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học tuy mới mẻ nhưng đã được đặc biệt chú ý bởi giá thành hạ và thân thiện với môi trường Phương pháp

phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp như nhiệt độ cao, áp suất, quá trình xúc tác v.v Phương pháp này tuân theo qui luật chuyển hóa thuộc chu trình cacbon, nitơ, photpho v.v không gây ra ô nhiễm thứ cấp, an toàn, thân thiện với môi trường và hệ sinh thái, chi phí thấp do đó rất phù hợp với điều hiện kinh tế ở nước ta Mặt khác, diện tích đất bị nhiễm độc ở Việt Nam rất lớn nên việc ứng dụng các phương pháp tẩy độc khác như hóa học và lý học khó có khả năng thực hiện [2] Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thời gian dài

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác Sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ bằng phương pháp phân hủy sinh học [9]

Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học có thể đi theo hai hướng chính là làm giàu sinh học và kích thích sinh học [9] Làm giàu sinh học (Bioaugmentation) là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v

Việc bổ sung vi sinh vật vào các địa điểm ô nhiễm đòi hỏi chi phí cao và nhiều khi không mang lại hiệu quả cao do nhiều nguyên nhân như sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường, sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật [15]

Ở Việt Nam, biện pháp chôn lấp tích cực để phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên quy mô pilot hiện trường Chôn lấp tích cực là sự kết hợp của phân hủy sinh học, cô lập, hấp phụ và chôn lấp Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phân hủy sinh học đối với các lô xử lý 0,5m3

; 1,5m3; 10m3 và 100m3 đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng [2], năm 2009 nhóm nghiên cứu đã xử lý hơn 3000 m2

đất nhiêm chất độc hóa học tại sân bay Biên Hòa bằng công nghệ phân hủy sinh học Các công thức xử lý phân hủy sinh học được bổ sung các dạng chế phẩm khác nhau cung cấp chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho quá trình oxy hóa, khử loại bỏ clo các chất vi lượng và các chất thêm cho tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình tẩy độc ở điều kiện kị khí và hiếu khí Số lượng các nhóm vi sinh vật trước, trong suốt quá trình xử lý đã được theo dõi Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử điểm chỉ như DGGE và các kỹ thuật sinh học phân tử khác đã được tiến hành để nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật đồng thời phân lập các chủng vi sinh vật, định tên loài vi sinh vật sử dụng dioxin, dibenzofuran, hydrocabon thơm đa nhân phân lập từ nguồn ô nhiễm kể trên Độ tồn lưu của dioxin và các ô nhiễm khác được xác định bằng phương pháp miễn dịch và sắc ký khối phổ Phương pháp miễn dịch phân tích dioxin của EPA Hoa Kỳ được tiến hành theo EnviroGrardTMkít [2]

Sau tám năm nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam đã thu được những kết quả rất khả quan Số lượng vi sinh vật dị dưỡng ở đất nhiễm độc trước khi xử lý không cao, dao động từ 102

- 105 MPN/g hay CFU/g [2] Những nhóm vi sinh vật khác cũng tồn tại trong loại đất này với số lượng và đa dạng thấp Trong quá trình xử lý ở qui mô khác nhau, số lượng vi sinh vật đã tăng đáng

kể từ 1.000-10.000 lần [2] Sau hơn hai năm xử lý bằng cách bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 và các hợp chất, vi lượng, thành phần xúc tác, các chất hoạt động bề mặt sinh học, phối hợp với sự thay đổi hàm lượng oxy và thay đổi độ ẩm, hiệu quả của quá trình xử lý “chôn lấp tích cực” (kết hợp cô lập, hấp phụ, chôn lấp và phân hủy sinh học) rất rõ rệt Trong tất cả các lô xử lý, sau 8 đến 24 tháng, từ 50 đến 70% tổng độ độc đã bị giảm [2]

Trong quá trình xử lý ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học đã phân lập được một số chủng vi sinh có khả năng vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và PAH từ đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng Các vi khuẩn đã được phân lập

gồm Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp SETDN1, Terrabacter sp DMA, Rhodoccocus sp HDN3 v.v Một số chủng nấm sợi chủ yếu thuộc chi Aspergillus như Aspergillus sp FDN30, Aspergillus sp FDN22, Aspergillus sp FDN20 Xạ khuẩn cũng đã được phân lập tuy không nhiều nhưng cũng đã, phân lập được một số chủng thuộc chi Streptomyces như các chủng Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN12 [1],

[2], [5], [8], [10], [11] Việc định tên và xác định khả năng phân hủy chất ô nhiễm của các chủng vi sinh vật này góp phần làm sáng tỏ cơ chế và hiệu quả của sự phân hủy sinh học diễn ra trong quá trình xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học đã được triển khai để xử lý khử độc ở qui mô 3.000 m3

tại “điểm nóng” Biên Hòa, Đồng Nai

Kết quả phân tích vi sinh vật và hóa học cho thấy các chế phẩm sử dụng tại hiện trường đã thành công trong việc kích thích quá trình phân hủy sinh học tại chỗ Tất cả các chế phẩm, các hợp chất trên đều có thể tìm được và sản xuất tại Việt Nam vì vậy chủ động và giảm giá thành xử lý đất nhiễm dioxin trong các căn cứ quân sự cũ Hơn nữa, phương pháp chôn lấp tích cực có tính

an toàn cao và khả thi đối với khối lượng bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đến vài ha và ở độ sâu trung bình từ một đến hai mét

Để đẩy nhanh tốc độ phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin, các nghiên cứu xử lý khử độc trong các bioreactor đã được nhóm nghiên cứu công nghệ xử lý POP, Viện Công nghệ sinh học tiến hành Đây là phương pháp xử lý kiểu tăng cường sinh học (bioaugmentation) trong hệ thống có khả năng điều khiển các thông số quan trọng liên quan đến quá trình chuyển hóa sinh học như nồng độ oxy, độ ẩm, độ pH, nhiệt độ, nồng độ các chất bổ sung và thành phần các nhóm vi sinh vật liên quan đến từng giai đoạn chuyển hóa sinh học chất ô

nhiễm Đây là kiểu xử lý ex situ và tốc độ chuyển hóa được cải thiện so với

biện pháp xử lý chôn lấp tích cực do các điều kiện đều được kiểm soát Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng đã được xử lý trong các bioreactor với quy mô 50 kg [3] Các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy tốt các chất ô nhiễm chính được phân lập tại đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại chính sân bay Đà Nẵng và tập đoàn vi sinh vật nuôi cấy làm giàu trên môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần chất ô nhiễm trong phòng thí nghiệm được bổ sung trong quá trình xử lý Các chất bổ sung trong quá trình xử lý được tính toán và bổ sung theo từng giai đoạn trong quá trình kết hợp với kiểm soát chặt chẽ các yếu tố về độ ẩm và độ thông khí Ngoài ra, còn kết hợp xử lý theo kiểu kết hợp hiếu khí – kỵ khí để có thể chuyển hóa hiệu quả trong cả hai điều kiện khử loại chlo và oxi hóa cắt vòng 2,3,7,8-TCDD Thành phần vi sinh vật trong thời gian xử lý đã tăng đáng kể, từ 106 lên đến 1012 MPN/g, trong đó trong các bioreactor hiếu khí, vai trò của nấm sợi đã được khẳng định là rất quan trọng với hệ sợi phát triển mạnh trên đất xử lý và khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như laccase, và các peroxidase với hoạt tính cao Sau thời gian 17 tuần, tổng độ độc đã giảm 44,1%[3]

5 Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật

2,4-D và 2,4,5-T là hai thành phần chủ yếu của các chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42] Hiện tại đất tại các khu nhiễm chất độc hóa học ở các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở miền Trung và Nam Việt Nam hai hợp chất trên vẫn ở nồng độ cao Trên thế giới do 2,4-D và 2,4,5-T đã được sử dụng từ rất lâu nên có nhiều công bố về khả năng phân hủy sinh học hai hợp chất này bởi vi sinh vật phân lập từ nguồn khác nhau như đất nông nghiệp, đất công nghiệp và trầm tích

Khác với 2,4-D, 2,4,5-T khó phân hủy hơn, hiện không có nhiều công bố về phân hủy sinh học hợp chất này Tuy nhiên cũng đã có một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam công bố về vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4,5-T

như Burkholderia cepacia AC1100, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus cornucopiae, Stenotrophomonas maltophilia PM, .v.v Một vài chủng nấm Aspergillus terreus FDN41, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus.v.v

[23] Theo Haugland và cộng sự, chủng Pseudomonas cepacia AC1100 có

khả năng phân hủy rất mạnh 2,4,5-T, chủng này phân hủy được 960μg/ml trong 24h ở 29o

C [26] Một chủng mới có nguồn gốc từ chủng Pseudomonas cepacia AC1100 được nhận thêm plasmid pJP4 quy định khả năng phân hủy 2,4-D từ chủng Alcalugenes eutrophus JMP134, chủng này được đặt tên là

RHJ1 Chủng này có khả năng phân hủy 1000 μg/ml 2,4-D và 2,4,5-T μg/ml trong 24h ở 29oC trên môi trường có chứa hai cơ chất này Trong khi đó khả

năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của chủng Pseudomonas cepacia AC1100

giảm hẳn khi nuôi trên môi chứa cùng một lúc hai cơ chất, chủng này phân hủy được 26 μg/ml 2,4,5-T và 24 μg/ml 2,4-D cung trong 24h [26] Ở chủng RHJ1 2,4,5-T được chuyển hóa thông qua con đường chlorohydroquinon, còn 2,4-D được phân hủy thông qua con đường chloroatechol [26]

Vi khuẩn sử dụng 2,4,5-T như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất được

nghiên cứu đầy đủ nhất hiện nay là Burkholderia phenoliruptrix AC110 (tên cũ là Burkholderia cepacia AC1100) [20] Các gen tftA và tftB mã hóa hai

dưới đơn vị (subunit) của enzyme 2,4,5-T oxygenase tham gia chuyển hóa 2,4,5-T sang 2,4,5-TCP (hình 1.5) Tiếp theo 2,4,5-TCP chuyển thành DCHQ

nhờ gen tftC mã hóa enzyme monooxynase chứa putative flavin Sau đó

DCHQ chuyển hóa thành CHQ, maleylaxetat, oxoadipat, succinat và axetat

bởi các gen tftCDEF [21]

Hình 1.5 Con đường phân huỷ 2,4,5-T bởi Burkholderia cepacia AC1100 [20]

Một vi khuẩn khác có khả năng khoáng hóa hoàn toàn 2,4-D và 2,4,5-T đó

là Nocardioides simplex 3E được phân lập bằng cách làm giàu với 2,4,5-T, vi

khuẩn này có thể phân hủy cả hai hợp chất trên thành trihydroxylat benzen [45] Nghiên cứu khác của Mai và cộng sự cho thấy quá trình đồng trao đổi

chất của vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia PM Vi khuẩn này cần

mecoprop để đồng trao đổi chất 2,4,5-T [36]

La Thị Thanh Phương và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập chủng

Pseudomonas sp BDN15, chủng này có khả năng phát triển trên môi trường

có bổ sung 2,4,5-T Sau 90 ngày ở điều kiên nuôi tĩnh và nhiệt độ phòng chủng BDN15 đã phân hủy 39,37% với nồng độ ban đầu là 1000ppm 2,4,5-T đây cũng là nguồn năng lượng và carbon duy nhất trong môi trường nuôi cấy [6] Nguyễn Thanh Thủy và cộng sự đã công bố chủng nấm sợi FDN41 có khả năng phân hủy 43,46% 2,4,5-T trong 20 ngày với hàm lượng 2,4,5-T ban đầu 905,34 μg/ml Ngoài ra chủng này còn có khả năng sử dụng một số PAH như anthrancen, phenanthren v.v là nguồn năng lượng và carbon duy nhất [12]

Khác với số lượng ít của các vi khuẩn phân hủy 2,4,5-T, rất nhiều vi khuẩn phân hủy 2,4-D đã được phân lập từ nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau như đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải và đất nguyên thủy Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D được xếp thành 3 nhóm dựa vào enzyme phân hủy và các đặc tính lý hóa của chúng Nhóm thứ nhất nằm trong lớp β và γ-

Proteobacteria như Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas Những vi khuẩn này có chứa gen tfd thường nằm ở các

plasmid và có thể chuyển được từ cơ thể vi sinh vật nọ sang cơ thể vi sinh vật

kia Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn nằm trong lớp α- Proteobacteria thuộc chi Sphingomonas Chúng được phân lập từ môi trường có chứa clo Nhóm thứ ba thuộc chi Bradyrhizobium trong lớp α- Proteobacteria Các vi

khuẩn này được phân lập từ đất nguyên thủy ở Canada, Hawaii, Chile và một số khu vực khác [28],[ 44]

Trong số các vi khuẩn tham gia phân hủy 2,4-D, chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 là chủng được nghiên cứu khá kỹ về con đường chuyển hóa

cũng như các gen mã hóa cho những enzyme tham gia phân hủy 2,4-D (Hình

1.6) Họ gen tfd gồm có 6 gen tfdA, tfdB, tfdC, tfdD, tfdE, tfdF mã hóa cho các

enzyme tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D tạo thành axit succinic [44]

Hình 1.6 Con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus

JMP134 [44]

Maltseva và cộng sự đã công bố chủng Halomonadaceae strain 1-18 có

khả năng phân hủy 3000 mg 2,4-D/l trong 3 ngày trên môi trường có bổ sung

50 mg cao men [37], khi nghiên cứu sâu hơn, chủng Halomonadaceae strain

1-18 nhóm tác giả đã phát hiện ra con đường phân hủy 2,4-D của chủng này

giống với con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus

JMP134, ngoài ra Maltseva cũng tìm thấy sự có mặt của gen tfdA ở chủng này Nhóm tác giả này đã công bố 5 chủng thuộc các chi Acinetobacter,

Serratiamarcescens, Stenothrophomonas, Flavobacterium và Penicillium

phân lập được từ đất ô nhiễm D ở Brazin cũng có khả năng phân hủy

trình phân hủy 2,4-D Các gen cadABC, cadK được tách dòng từ chủng

Bradyrhizobium sp strain HW13 Khi so sánh trình tự nucleotide của các gen cadABC với trình tự gen TftA, TftB của chủng Burkholderia cepacia

AC1100 cho thấy các gen này có độ tương đồng 46%, 44% và 37% với nhau Trình tự gen cadK cũng được so sánh với trình tự gen TfdK của chủng

Ralstonia eutropha JMP134, kết quả cho thấy 2 gen này có độ tương đồng

đồng 93 đến 94% với các trình tự gen tương ứng đã được công bố trên GenBank [8] Theo Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự đã công bố chủng nấm FDN20 cũng có nguồn gốc từ mẫu đất nhiễm chất độc hóa học, có khả năng

loại bỏ 72,92 μg/ml tương đương với 44,18% hàm lượng 2,4-D đưa vào ban

đầu [4]

Ngoài 2,4,5-T, 2,4-D là thành phần chính của chất diệt cỏ còn có sản phẩm phụ của chất diệt cỏ là dioxin Dioxin là thành phần rất độc với con người và môi trường vì vậy trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy dioxin bởi vi sinh vật Lyama và cộng sự đã

sử dụng Bacillus midousuji để phân hủy dioxin, sau 24h nuôi cấy, Bacillus midousuji đã phân hủy 34% 2,3,7,8-TCDD và sau 48h khoảng 70% dioxin đã bị loại bỏ [35] Theo Hong và cộng sự chủng Sphingomonas sp RW1 có khả

năng chuyển hóa 2,7-DCDD và 1,2,3,4-TCDD thành 4-chlorocatechol và 3,4,5,6-tetrachlorocatechol Sau đó chủng RW1 tiếp tục chuyển hóa 3,4,5,6-tetrachlorocatechol thành 2-methyoxy-3,4,5,6-tetrachlorophenol [27] Habe

và cộng sự đã công bố hai chủng Pseudonomas sp CA10 và Terrabacter sp

DBF63 đều có khả năng sử dụng từ 10-35% 2,7-DCDD và 1,2,3-TrCDD với nồng độ ban đầu là 10 ppm [25]

Ngoài vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân hủy dioxin thì vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, vi khuẩn kị khí không bắt buộc cũng có khả năng chuyển hóa dioxin Vi khuẩn kị khí có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa clo trong đó có dioxin Rất nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo trong môi trường hoạt động của vi khuẩn khử sắt, vi khuẩn khử sunphát, và nhóm khử halogen v.v Một số chủng vi khuẩn kị khí có khả năng khử clo đã được

nghiên cứu như: Desulfitobacterium dehalogenans JW/IU-DC1 [34], Dehalococcoides ethenogens 195, Dehalococcoides sp CBDB1 [30], Desulfitobacterium sp PCE-1, Dehalococcoides sp FL2 v.v Trong số các vi

sinh vật kị khí đã nghiên cứu trong hai thập kỷ qua thì các vi khuẩn thuộc chi

Dehalococcoides được quan tâm hơn cả bởi chúng có khả năng loại khử clo

của rất nhiều hợp chất chứa clo như Trichlorethylene , Vinyl Chloride,

Trichlorodibenzo-p-dioxins, Polychlorinated dibenzofurans v.v [30] Theo Bunge và cộng sự, chủng Dehalococcoides sp 195, Dehalococcoides sp

CBDB1 đã được chứng minh là có khả năng phân hủy dioxin [19], chủng CBDB1 đã đề khử clo 1,2,3,4-TeCDD (46 µM ) trong 84 ngày nuôi cấy thành 2,3-DiCDD và 2-MCDD [19] Chủng CBDB1 sử dụng clo trong dioxin là chất nhận điện tử, từ đó loại bỏ clo ra khỏi phân tử dioxin Kết quả tạo ra sản phẩm ít độc hơn là 2,7; 2,8-DiCDD và 2-MCDD Các hợp chất này sẽ dễ bị phân hủy sinh học bởi các vi sinh vật hiếu khí Chủng CBDB1 còn có thể sử dụng 1,2,3,7,8-PCDD là chất có độ độc là 1 tương đương với 2,3,7,8-TCDD [19]

Tại Việt Nam, Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã công bố chủng FDN30 có khả năng phân hủy hiếu khí 2,3,7,8-TCDD Đây là chủng vi nấm được phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học tại Đà Nẵng Sau hai tuần, chủng này đã phân huỷ 59% dioxin chứa trong môi trường nuôi cấy [20] Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, nhóm tác giả này đã phân lập được một số chủng vi sinh vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, từ đất nhiễm chất độc hóa học tại

sân bay Đà Nẵng Các vi khuẩn đã được phân lập là Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp SETDN1, Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN12 [1], [2], [10], [13]

6 Phân loại vi sinh vật

6.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển

Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh sinh hóa

lí-Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, mầu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép

hay dạng chùm, dạng chuỗi v.v khả năng bắt mầu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không?, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào v.v

Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp v.v

Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng

6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [7]

Bảng 1.2 Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học

Thành phần tế bào

Phương pháp phân tích

Phạm vi phân loại DNA

hạn của RNA riboxome

RNA riboxom

Trình tự nucleotid Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA

Acid teichoic

Màng

Acid béo

Loài và chi Lipid phân cực

Acid mycolic Isoprenoid quinones

Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay

Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [29]

1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao của các hãng Roche, Sigma, Merk v.v Các dung dịch tách DNA plasmid (Sol I (glucose: 50 mM; tris - HCl (pH 8): 25 mM; EDTA (pH 8): 10 mM); Sol II (NaOH: 0,2N; SDS: 1%); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml; CH3COOH: 11,5 ml; H2O: 28,5ml) Vectơ pCR2.1 (Promega), đệm TAE 1X để điện di (Tris- acetate: 40 mM; EDTA: 1 mM) Loading dye 6x (bromophenol blue: 0,25%; xylen cyanol FF: 0,25%; glyxerol: 30%) v.v Dịch chiết đất chứa hơn 99% là 2,3,7,8-TCDD, ngoài ra còn có các chất khác như 2,4,5-T, 2,4-D v.v được chiết từ đất ô nhiễm của sân bay Đà Nẵng

Viện Công nghệ sinh học bao gồm Box cấy vô trùng, kính hiển vi, cân điện tử, nồi khử trùng, tủ sấy, máy nuôi lắc nhiệt độ 30oC, tủ nuôi ổn nhiệt 30o

C, máy ly tâm, máy PCR, máy xác định trình tự gen ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy soi DNA, máy chụp ảnh Gel-Doc, máy điện di Bio-Rad, tủ lạnh các loại 4o

C, -20oC, -80oC, các dụng cụ thí nghiệm như bình tam giác, pipet, đầu typ, ống ly tâm v.v

2 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Môi trường nuôi cấy

2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l)

- KH2PO4 0,5 - K2HPO4 0,5 - MgSO4 2 - NaCl 1 - NH4Cl 1 - NH4NO3 1 - CH3COONa 1

- CaSO4 1 - Lactat Natri 1 ml - Axít Butyric 10 µl - Axít Propionic 10 µl - Axít Isobutyric 1 µl - Axít Succinic 3,5 µl - Và các chất bổ sung khác

Na2HPO4 0,7 NaCl 0,4 pH 7-7,2

2.1.4 Môi trường LB dịch (g/l)

NaCl 10 Tryptone 10 Cao men 5,0

Nước cất vừa đủ 1 lít pH 7

2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí

2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật

Vi khuẩn được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T Cân 5g đất từ bioreactor cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trương SH1/5 có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T, nuôi lắc 5-7 ngày ở 30oC Chuyển 10% giống ở lần làm giàu thứ nhất sang bình làm giàu lần hai chứa môi trường SH1/5 bổ sung 200 ppm 2,4,5-T Quá trình làm giầu này được lặp lại 3

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Từ mẫu làm giầu lần thứ 3, pha loãng từ 101

đến 107, sau đó bơm 100μl dung dịch pha loãng có chứa vi khuẩn lên các đĩa môi trường SH 1/5 thạch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T Sau 5 đến 7 ngày nuôi ở điều kiện tối 30oC, những

khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch được tách và chuyển sang nuôi cấy trong bình tam giác chứa 20 ml môi trường SH 1/5 dịch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T sau đó nuôi lắc 200vòng/phút 7 đến 10 ngày ở 30oC

2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn

2.3.1 Nhuộm Gram

Nhỏ một giọt môi trường nuôi cấy có chứa vi sinh vật vào giữa lam kính, giàn đều dịch, cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn Tiếp theo, nhỏ dung dịch tím kết tinh (crystal violet) lên mẫu, để 1 phút Mẫu được rửa bằng nước cất 2 lần, thấm khô, sau đó nhỏ dung dịch lugon lên mẫu, để yên mẫu trong 1 phút Cố định mẫu bằng cồn 900

trong 30 giây sau đó để bay hơi tự nhiên đến khô bề mặt Tiếp theo, nhỏ dung dịch safarin lên mẫu, để yên trong 1-2 phút và rửa lại mẫu bằng nước cất 2 lần, để khô tự nhiên Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần Vi khuẩn gram âm bắt mầu hồng, vi khuẩn gram dương bắt mầu xanh

2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét

Vi khuẩn được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường CNSH1 dịch có chứa dịch chiết đất Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ cặn bẩn rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào Sau đó rửa lại sinh khối bằng nước cất 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy Tế bào vi khuẩn được hũa trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm phosphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút Tiếp theo, lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106

- 108 tế bào/ ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, T-butyl Sau đó, các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ vàng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV