2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l)
- K2HPO4 0,5 - MgSO4 2 - NaCl 1 - NH4Cl 1 - NH4NO3 1 - CH3COONa 1 - CaSO4 1 - Lactat Natri 1 ml - Axít Butyric 10 µl - Axít Propionic 10 µl - Axít Isobutyric 1 µl - Axít Succinic 3,5 µl - Và các chất bổ sung khác 2.1.2 Môi trường SH1 thạch
Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng có bổ sung 18g agar/l.
2.1.3 Môi trường muối khoáng (g/l)
KNO3 3 MgSO4 0,4 KH2PO4 0.3 Na2HPO4 0,7 NaCl 0,4 pH 7-7,2
2.1.4 Môi trường LB dịch (g/l) NaCl 10 NaCl 10 Tryptone 10 Cao men 5,0 Nước cất vừa đủ 1 lít pH 7 2.1.5 Môi trường LB thạch (g/l)
Công thức các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 18g agar/l.
2.1.6 Nước muối sinh lý (0,85%)
NaCl 8,5g Nước máy vừa đủ 1 lít
2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí
2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật
Vi khuẩn được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T. Cân 5g đất từ bioreactor cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trương SH1/5 có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T, nuôi lắc 5- 7 ngày ở 30oC. Chuyển 10% giống ở lần làm giàu thứ nhất sang bình làm giàu lần hai chứa môi trường SH1/5 bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Quá trình làm giầu này được lặp lại 3.
2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Từ mẫu làm giầu lần thứ 3, pha loãng từ 101
đến 107, sau đó bơm 100μl dung dịch pha loãng có chứa vi khuẩn lên các đĩa môi trường SH 1/5 thạch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Sau 5 đến 7 ngày nuôi ở điều kiện tối 30oC, những
khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch được tách và chuyển sang nuôi cấy trong bình tam giác chứa 20 ml môi trường SH 1/5 dịch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T sau đó nuôi lắc 200vòng/phút 7 đến 10 ngày ở 30oC.
2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn
2.3.1 Nhuộm Gram
Nhỏ một giọt môi trường nuôi cấy có chứa vi sinh vật vào giữa lam kính, giàn đều dịch, cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiếp theo, nhỏ dung dịch tím kết tinh (crystal violet) lên mẫu, để 1 phút. Mẫu được rửa bằng nước cất 2 lần, thấm khô, sau đó nhỏ dung dịch lugon lên mẫu, để yên mẫu trong 1 phút. Cố định mẫu bằng cồn 900
trong 30 giây sau đó để bay hơi tự nhiên đến khô bề mặt. Tiếp theo, nhỏ dung dịch safarin lên mẫu, để yên trong 1-2 phút và rửa lại mẫu bằng nước cất 2 lần, để khô tự nhiên. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần. Vi khuẩn gram âm bắt mầu hồng, vi khuẩn gram dương bắt mầu xanh.
2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét
Vi khuẩn được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường CNSH1 dịch có chứa dịch chiết đất. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ cặn bẩn rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Sau đó rửa lại sinh khối bằng nước cất 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hũa trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm phosphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Tiếp theo, lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106
- 108 tế bào/ ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới. Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, T-butyl. Sau đó, các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ vàng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV.
2.4 Phƣơng pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T
Bước 1 Lấy 22 ml mẫu bổ sung thêm 2 gam NaCl, 30 ml n-hexan và lắc trong 30 phút.
Bước 2 Chiết lấy tương hữu cơ và chất chuyển hóa, cho isopropanol và một hai giọt H2SO4 đặc, rửa bằng nước cất đến pH = 7, thổi khô mẫu bằng N2 sạch đến 1 ml. Bơm dịch vào máy sắc ký khí (GC) với detechter ECD.
2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA
2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật
Màng tế bào được phá bằng enzyme lyzozym. Enzyme protease K được dùng để loại bỏ protein. Việc bổ sung thêm các hóa chất như phenol, chloroform, isoamylalcohol nhằm loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa DNA. Thu hồi DNA bằng cách tủa trong cồn hay isopropanol và ly tâm. Các bước được tiến hành theo thứ tự sau:
Bước 1: Thu sinh khối tế bào vào eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 10 phút.
Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400µl dịch đệm lysis. Thành phần đệm: 20 mM Tris-Cl (pH 8)
50 mM NaCl 10 mM EDTA
Bước 3: Bổ sung lyzozyme, ủ ở 37o
C trong 15-30 phút. Bước 4: Bổ sung protease K, ủ ở 56oC trong 1 giờ.
Bước 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bước 6: Bổ sung chloroform : isoamylalcohol (tỷ lệ 1: 1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 7: Hút dịch phía trên chuyển sang eppendorf mới. Tủa DNA bằng ethanol 100% giữ ở -20o
Bước 8: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu kết tủa DNA. Bước 9: Rửa DNA bằng cồn 70%.
Bước 10: Làm khô, hoà tan trong nước khử ion vô trùng.
Bước 11: Loại RNA bằng RNase (10 mg/ml), ủ 37oC trong 2 giờ.
2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi là một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại.
Thành phần phản ứng Buffer MgCl2 2,5 µl dNTPs ( 10mM ) 2,5 µl Mồi xuôi 27 F 1 µl Mồi ngược 1492 R 1 µl Taq polymeraza 0,2 µl DNA 1 µl MgCl2 ( 10 mM ) 3 µl H2O 13,8 µl Tổng thể tích 25 µl Chu trình nhiệt độ Bước 1 95o C trong 5 phút Bước 2 94o C trong 1 phút Bước 3 55o C trong 1 phút Bước 4 72o C trong 1 phút 30 giây
Bước 5 Lặp lại 30 lần từ bước 2 đến bước 4
Bước 6 72o
C trong 8 phút Bước 7 4oC để qua đêm
Trình tự cặp mồi
Mồi xuôi 27F: 5’ AGA GTT TGA TTC MTG GCT CAG 3’ Mồi nguợc 1492R: 5’ GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3’
2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose
Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là những đại phân tử luôn tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương. Trong các thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose 1%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và tiến hành soi DNA dưới ánh sáng tử ngoại.
2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA
Sản phẩm PCR đặc hiệu được gắn vào vector pCR2.1 nhờ T4 DNA ligase. Phản ứng thực hiện ở 14oC trong 18 giờ. Thành phần phản ứng như sau:
Nước đề ion vô trùng 4,0 µl Đệm T4 DNA ligase 1,0 µl
Sản phẩm PCR 2,5 µl
Vector pCR 2.1 (25mg/µl) 1,5 µl T4 DNA ligase 1,0 µl
Đảo trộn rồi cho vào tủ lai 14oC trong 18 giờ.
2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli
Bước 1: Cho 1,5 µl dịch vector pCR2.1 đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa 50 µl tế bào khả biến Escherichia coli INVαF’, ủ trong đá 30 phút.
Bước 2: Sốc nhiệt ở 42o
C trong 30 giây.
Bước 3: Bổ sung 250 µl môi trường SOC, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37o C trong 1 giờ.
Bước 4: Cấy gạt dịch sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/ml và X-Gal 50 mg/ml).
Bước 5: Nuôi ở 37oC trong 18 giờ.
Trên môi trường LB có bổ sung X-gal, những khuẩn lạc có màu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai.
2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR)
Sau khi nuôi khuẩn lạc đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, khuẩn lạc tròn màu trắng đã được chọn ra để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi 27F-1492R nhắm xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen quan tâm hay không. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.
Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc.
Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 14.75 2 Buffer PCR (NH+4) 2.5 3 Mgcl2 3 4 dNTPs 2.5 5 Mồi xuôi 27F 1 6 Mồi ngược 1492R 1 7 Taq polymerase 0,25 8 Template Khuẩn lạc Tổng 25
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu Kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 1 phút 32 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas
Bước 1: Cho 1,5ml dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn được chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 2: Đổ dịch, úp eppendorf trên giấy thấm. Bổ sung 250l đệm P1 vortex cho đến khi sinh khối tan hết.
Bước 3: Bổ sung 250l đệm P2 và đảo nhẹ 15 lần cho tới khi dịch trở nên trong. Bước 4: Bổ sung 350l đệm N3 và đảo nhẹ 15 lần.
Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 6: Chuyển dịch sang cột QIAprep, cột đặt trên eppendorf 2ml.
Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 8: Bổ sung 500l đệm PB và ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột sang eppendorf mới.
Bước 9: Bổ sung 750l đệm PE, để trong 3 phút.
Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới.
Bước 11: Ly tâm lại một lần nữa 12000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 12: Chuyển cột sang eppendorf mới, bổ sung 60ul nước deion. Để trong 1 phút.
Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa DNA plasmid.
2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA
Đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA theo hương pháp của Sanger sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Analyzer. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis.
2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại
So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA thu được với đoạn gen có kích thước và vị trí tương tự ở các vi sinh vật khác thuộc nhóm prokaryote đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen thế giới EMBL (European Molecular Biology Laboratory) và sử dụng phần mềm tin sinh học Clustal để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí
1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật
Mẫu đất của ba bioreactor hiếu khí HKR3, HKR4 , HKR5, được tiến hành làm giàu trong môi trường SH1/5 có bổ sung hai nguồn cơ chất là 2,4,5-T, 2,4-D. Các mẫu đất được tiến hành làm giàu 3 lần trên môi trường SH1/5 với nồng độ các cơ chất là 100ppm. Kết quả làm giàu tập đoàn vi sinh vật nuôi cấy làm giàu lần một trên cơ chất 2,4,5-T, 2,4-D được trình bày ở hình 3.1.
A
B
Hình 3.1 Tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3, HKR4, HKR5 trên môi trường chứa 2,4,5-T (A) và 2,4-D (B)
Trên hình 1.A và 1.B tập đoàn vi sinh vật trong các mẫu đất ở các bioreactor HRK3, HRK4, HRK5 phát triển rất tốt trong lần làm giàu đầu tiên, các bình nuôi cấy đều thấy có viền sinh khối ở trên thành bình. Quá trình làm giầu được tiến hành hai lần nữa và kết quả của lần làm giàu cuối cùng được thể hiện trên hình 3.2.
A B
C
Hình 3.2 Tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3(A), HKR4 (B), HKR5 (C) trong môi trường chứa 2,4,5-T và 2,4-D.
Quan sát hình 3.2 nhận thấy các bình nuôi cấy tập đoàn vi sinh vật phát triển mạnh, viền sinh khối rõ ràng và môi trường có mầu trắng đục. Điều này cho thấy tập đoàn vi sinh vật được nghiên cứu của ba bioreactor HKR 3, HKR4, HKR5 có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung hai nguồn carbon là 2,4,5-T và 2,4-D. Để nghiên cứu, tìm hiểu khả năng sử dụng 2,4,5-T hoặc 2,4-D của từng chủng đơn, các nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm và phân lập các chủng vi khuẩn từ các bình nuôi cấy làm giầu lần 3 đã được tiến hành.
1.2 Phân lập chủng vi khuẩn
Từ các mẫu làm giàu lần 3 tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3, HKR4, HKR5, đã được nuôi trên môi trường thạch. Từ các đĩa thạch này một số khuẩn lạc đã được chọn để chuyển sang nuôi cấy trên môi trường dịch thể. Sau quá trình phân lập và chọn lọc các chủng vi khuẩn sạch HR3.1 , HR4.1, HR5.1 đã được phân lập (hình 3.3, bảng 3.1).
A B
C
Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc các chủng HR3.1 (A), HR4.1 (B), HR5.1 (C) trên môi trường thạch có 2,4,5-T.
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng HR3.1, HR4.1, HR5.1 trên môi trường chứa 2,4,5-T
Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc
HR3.1 Khuẩn lạc hình tròn, lồi, mầu trắng đục, đường kính khoảng 2 mm. HR4.1 Khuẩn lạc hình tròn bé, lồi, mầu
trắng, đường kính khoảng 0,5 mm. HR5.1 Khuẩn lạc hình tròn, mầu trắng đục,
đường kính khoảng 1,9-2,1 mm Từ kết quả nhận được ở hình 3.3 và bảng 3.1 cho thấy, trong 3 chủng đơn đã phân lập được, chủng HR5.1 có khả năng phát triển tốt hơn hai chủng HR3.1 và HR4.1. Vì vậy chủng HR5.1 đã được chọn để tiếp tục nhiên cứu phục vụ cho mục đích cũng như nội dung của luận văn.
2. Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 2.1 Hình thái tế bào 2.1 Hình thái tế bào
Chủng HR5.1 là vi khuẩn Gram âm, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phóng đại 10.000 lần cho thấy chủng HR5.1 tế bào của chủng HR5.1 có dạng hình que ngắn kích thước khoảng 1,6-1,9 x 0,5-0,6 μm.
Hình 3.4 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn HR5.1
Để xác định vị trí phân loại của chủng vi khuẩn HR5.1 Các nghiên cứu tách dòng gen mã hóa 16S rRNA, giải trình tự và so sánh với các dự liệu trên ngân hàng Gen đã được tiến hành.
2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA
2.2.1 Tách chiết DNA tổng số
Để tiến hành các nghiên cứu phân loại vi khuẩn, việc thu được DNA tổng số không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao là rất quan trong. Hiện nay có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi sinh vật được sử dụng, phụ thuộc vào loại mẫu nghiên cứu. Mẫu vi khuẩn HR5.1 đã được tiến hành tách chiết DNA tổng số theo mô tả của Sambrook và Russell [40]. Quá trình tách chiết được thực hiện theo các buớc mô tả ở phần phương pháp, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trình bày ở hình 3.5
Hình 3.5 Phổ điện di DNA tổng số chủng HR 5.1
Kết quả ở hình 3.5 chứng tỏ DNA tổng số của chủng HR5.1 không bị đứt gẫy, sạch để có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng DNA tổng số tách từ chủng HR5.1 để làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (27F và 1492R) và chu trình nhiệt như đã trình bày ở phần phương pháp