Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn nấm mốc có khả năng sinh enzyme phytase

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TRẦN VĂN VƯƠN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE Đà Nẵng – Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TRẦN VĂN VƯƠN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn: PGS TS ĐỖ THU HÀ Đà Nẵng – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase” kết nghiên cứu tác giả Các số liệu nghiên cứu, kết điều tra, kết phân tích trung thực, chưa cơng bố Các số liệu liên quan trích dẫn có ghi nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm kết sản phẩm kế thừa công bố người khác Đà Nẵng, tháng 05 năm 2017 Tác giả TRẦN VĂN VƯƠN LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đỗ Thu Hà người trực tiếp hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa -Môi trường - Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em năm học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln giúp đỡ động viên em suốt thời gian làm khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Trần Văn Vươn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Ý NGHĨA KHOA HỌC ĐỀ TÀI CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHYTATE 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PHYTASE 1.2.1 Khái quát enzyme phytase 1.2.2 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 1.2.3 Phytase có nguồn gốc từ thực vật 1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 11 1.5 ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU 12 1.5.1 Vị trí địa lý, địa hình 12 1.5.2 Đặc điểm khí hậu 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.3 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 14 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 14 2.3.2 Thời gian nghiên cứu 15 2.3.3 Phạm vi nghiên cứu 15 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.4.1 Phương pháp l mẫu xử lí mẫu đất 15 2.4.2 Phương pháp phân l ập nấm mốc có khả sinh phytase ngoại bào 16 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm ni cấy hình thái chủng tuyển chọn 17 2.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase từ chủng nấm mốc tuyển chọn 17 2.4.5 Phương pháp sơ ứng dụng dịch nuôi cấy chủng nấm mốc tuyển chọn đến giai đoạn đầu sinh trưởng phát triển lúa (Oryza stativa L.) 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22 3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE 22 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYME PHYTASE MẠNH 26 3.3 ĐẶC ĐIỂM NI CẤY VÀ HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TUYỂN CHỌN 30 3.5 THĂM DÒ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NUÔI CẤY CÁC CHỦNG NẤM MỐC ĐẾN GIAI ĐOẠN ĐẦU CỦA SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LÚA (ORYZA STATIVA L.) 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT H: Huyện HSCC: Hệ sợi chất HSKS: Hệ sợi khí sinh KL: Khuẩn lạc MT: Môi trường PSM: Phytase screening media TP: Thành phố TX: Thị xã DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 2.1 Mối tương quan nồng độ K2HPO4 với OD Trang 17 Số chủng vi sinh vật sinh trưởng môi trường sàng lọc 3.1 phân lập từ đất xã thuộc huyện Hòa Vang -TP Đà Nẵng 20-21 huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam 3.2 3.3 3.4 Khả sinh enzyme phytase chủng nấm mốc tuyển chọn Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc tuyển chọn Hoạt độ enzyme chủng MN-1 MN-2 qua thời điểm nuôi cấy 3.5 Chiều cao khay gieo trồng 3.6 Chiều cao lúa công thức qua ngày gieo trồng 25 27 31 34-35 35 DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình ảnh ảnh 1.1 1.2 Cấu trúc hóa học phytate Sự phân giải nhóm phospho acid phytate nhờ enzyme phytase Trang 03 05 2.1 Đồ thị đường chuẩn K2HPO4 17 3.1 Tỉ lệ % số chủng nấm mốc vi khuẩn phân lập 21 Một số chủng nấm mốc sinh trưởng môi trường 3.2 PSM Một số chủng vi khuẩn sinh trưởng môi trường 3.3 3.4 3.5 PSM Tỉ lệ % chủng nấm mốc có khả phân giải enzyme phytase mạnh Hình ảnh phân giải acid phytate MN-1 MN2 mơi trường PSM Hình ảnh khuẩn lạc ccác chủng nấm mốc tuyển chọn 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 mơi trường PDA Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm mốc tuyển chọn mơi trường Czapeck Hình ảnh quan sinh sản chủng MN-1 MN2 Hình ảnh ống giống chủng MN-1 MN-2 Đồ thị hoạt độ enzyme hai chủng MN1 MN-2 theo thời gian nuôi cấy Thu dịch lỏng nuôi cấy chủng tuyển chọn qua mốc thời gian Dịch chứa enzyme phytase từ chủng nuôi cấy 22 23 24 26 26 27 27 28 28 28 28 42 KIẾN NGHỊ Tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh enzyme phytase từ chủng lựa chọn Nghiên cứu phương pháp tinh enzyme để thu nguồn enzyme có mức độ tinh cao so với phương pháp truyền thống Nghiên cứu cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme phytase kĩ thuật sinh học Mở rộng phạm vi ứng dụng để tài, Tơi dừng lại việc thăm dị ảnh hưởng enzyme phytase đến sinh trưởng phát triển lúa nước, chưa đánh giá thành phần đất trồng sau bổ sung lượng enzyme phytase Vì vậy, cần có nghiên cứu để bổ sung liệu khoa học ứng dụng enzyme phytase lĩnh vực nông nghiệp 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học (Tập I, II), NXB Đại học Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội [2] Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập 1, 2, NXB ĐH Sư phạm Hà Nội, tr.196-203; tr 270 [3] Bùi Xuân Đồng (1978), Nấm mốc, bạn thù, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [4] Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.137 [5] Nguyễn Văn Giang cs (2013), “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp phytase ngoại bào”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(4), tr 558-564 [6] Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Văn Tính (2015),“Phân lập nấm Aspergillus fumigatus với khả sinh tổng hợp phytase cao”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học, 37(1), tr 42-48 [7] Hồng Quốc Khánh, Ngơ Đức Huy cs (2012), “Thu nhận tinh phytase ngoại bào từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9)”, Tạp chí sinh học, 34(3SE), tr 91-98 [8] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học (Tập – Thí nghiệm vi sinh vật học), NXB Đại học Quốc gia TP HCM [9] Phan Thị Thu Mai (2012), Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase, Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Khoa học Tự nhiên [10] Vũ Thúy Nga cs (2011), Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh để chế biến phế thải chăn ni làm phân bón hữu sinh học nông hộ quỳ hợp 44 tỉnh Nghệ An, Báo cáo tổng kết, Dự án khoa học công nghệ nông nghiệp vốn vay ADB, tr 24-25 [11] Vũ Nguyên Thành, Báo cáo tổng kết đề tài cấp khai thác phát triển nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm, Bộ công thương Viện công nghiệp thực phẩm [12] Mạch Trần Phương Thảo, Phạm Hồng Ngọc Thùy, Nguyễn Minh Trí, “Khả thủy phân phytate cellulose bã sắn chủng Bacillus subtilis C7”, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản, tr 180- 184 [13] Trần Thanh Thủy, Võ Thị Hạnh, Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường ĐH Sư phạm TP Hồ Chí Minh [14] Võ Đức Tuấn cs (2013), “Nghiên cứu tổng hợp enzyme phytase từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis’’, Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, tr 43-49 Tài liệu nước [15] Baharak H., Giti E and Iraj N (2009), “Analysis of phytase producing bacteria (Pseudomonas sp.) from poultry faeces and optimization of this enzyme production”, African Journal of Biotechnology 8(17), pp 4229 – 4232 [16] Barrier-Guillot B., Casado P., Maupetit P., Jondreville C., and Gatel F., (1996), “Wheat phosphorus availability: 1-In vitro study; Factors affecting endogenous phytasic activity and phytic phosphorus content”, J Sci Food Agric, 70, pp 62 - 68 [17] Bergey D.H.; Noel R.K.; John G.H (1989), Bergey’s manual of sytematic bacteriology, Publisher: Baltimore, MD : Williams & Wilins 45 [18] Bijender S., Satyenarayana T (2011), “Microbial phytases in phosphorus acquisition and plant grouth promotion”, Physool Mol Biol Plant, 17(2), pp 93 – 103 [19] Deliliers L.G., Servida G., Fracchiolla N.S., Ricci C., Borsotti C., Colombo G., et al (2002), “Effects of inositol hexaphosphate (IP6) on human normal and leukaemic hematopoietic cells”, British Journal of Haematology, 117, pp 577–587 [20] Eeckhout W and M de Paepe (1994), “Total phosphorus, phytate-phosphorus and phytase activity in plant feedstuffs”, Anim Feed Sci Tech 47, pp 19 29 [21] Elif D., Eren B., Alev U (2014), “Screening of phytate hydrolysis Bacillus sp isolated from soil and optimization of the certain nutritional and physical parameters on the production of phytase”, Türk Biyokimya Dergisi [Turkish Journal of Biochemistry–Turk J Biochem], 39(2), pp 206–214 [22] Findenegg G.R and Nelemans J.A (1993), “The effect of phytase on the availability of phosphorus from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”, Plant and Soil, 154, pp 189-196 [23] Gause G.F., Prebrazenskai T.P., Sresnicora M.A., Terekhova P.P (1983), Opredelitels actinomyceles [24] Iqbal T.H., Lewis K.O., & Cooper B.T (1994), “Phytase activity in the human and rat small intestine”, Gut, 35, pp 1233–1236 [25] Idris E.E., Makarewicz O., Farouk A., Rosner K., Greiner R., Bochow H., et al (2002), “Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth promoting effect”, Microbiology, 148, pp 2097–2109 46 [26] Katsuhiko Ando (2002), “Identifibioication of Fungi Imperfecti”, Nite Biological Resource Center National Intitutle of technology and Evaluation , pp 13-25 [27] Konietzny U., & Greiner R (2003), “Phytic acid: Nutritional impact In B Caballero, L Trugo, & P Finglas (Eds.)”, Encyclopaedia of food science and nutrition, pp 4555–4563 [28] Kornegay E.T (1999), “Application of phytase for retention of nonphosphorus nutrients”, Proc MD Nutr Conf., 46, pp 83-103 [29] Kornegay E.T., Denbow D.M., Yi Z., and Ravindran V (1996), “Response of broilers to graded levels of microbial phytase added to maizesoybean-meal based diets containing three levels of non-phytate phosphorus”, Br J Nutr, 75, pp 839-852 [30] Krasilnhirov’s (1966), Marwai of systematic Bacteriology and Streptomyces [31] Loewus F (2002), Biosynthesis of phytate in food grains and seeds In N R Reddy & S K Sathe (Eds.), Food phytates (pp 53–61) Boca Raton, Florida, USA: CRC Press [32] Lönnerdal B (2002), “Phytic acid-trace element (Zn, Cu, Mn) interactions”, International Journal of Food Science and Technology , 37, pp 749–758 [33] Lopez H.W., Leenhardt F., Coudray C., & Rémésy C (2002), “Minerals and phytic acid interactions: Is it a real problem for human nutrition”, International Journal of Food Science and Technology, 37, pp 727–739 [34] Maenz D.D and Classen H.L (1998), “Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken”, Poult Sci, 77, pp 557-563 [35] Moushree P.R and Shilpi G (2014), Purification and characterization of phytase from two enteric bacteria isolated from cow dung , Proceedings of 5th International Conference on Environmental Aspects of Bangladesh 47 [36] Oberleas D (1983), 'The role of phytate in zinc bioavailability and homeostasis In G E Inglett (Ed.), Nutritional bioavailability of zinc (pp 145–158) Washington, DC: American Chemical Society [37] Pradnya D.G., Kavita P.B., Jayant M.K (2013), “Effect of phytase from Aspergillus niger on plant growth and mineral assimilation in wheat (Triticumaestivum Linn.) and its potential for use as a soil amendment”, Journal of the Science of food and agriailture, 93(9), pp 2242-2247 [38] Prasad A.S., Miale A.Jr., Farid Z., Sandstead H.H., & Darbv W.J (1963), “Biochemical studies on dwarfism, hypogonadism and anemia”, Archives of Internal Medicine, 111, pp 407 [39] Robert A Samson at al (1984), Introduction Food- Borne Fungi, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences [40] Ravindran V., Bryden W.L., and Kornegay E.T (1995), “Phytates: Occurrence, bioavailability, and implications in poultry nutrition”, Poult Avian Biol, 6, pp 125-143 [41] Sakamoto K., VenkatramanG., & Shamsuddin A.M (1993), “Growth inhibition and differentiation of HT-29 cells in vitro by inositol hexaphosphate (phytic acid)”, Carcinogenesis, 14, pp 1815–1819 [42] Sasirekha B., Bedashree T and Champa K.L (2012), “Optimization and partial purification of extracellular phytase from Pseudomonas aeruginosa p6”, European Journal of Experimental Biology, 2(1), pp 95-104 [43] Vucenik I., & Shamsuddin A.M (2003), “Cancer inhibition by inositol hexaphosphate (IP6) and inositol: From laboratory to clinic”, Journal of Nutrition, 133, pp 3778S–3784S [44] Wodzinski R.J., and Ullah A.H.J (1996), “Phytase”, Adv Appl Microbiol 42, pp 263-302 Trang web: 48 [45] http://hoavang.danang.gov.vn/gioi-thieu [46] https://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%B2a_Vang [47] https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90i%E1%BB%87n_B%C3%A0n 49 PHỤ LỤC 01 MÔI TRƯỜNG SÀNG LỌC CHỦNG PHYTASE (PSM – PHYTASE SCREENING MEDIA Glucose : 2% Na-phytate: 0.4% CaCl2.2H2O: 0.2% NH4NO3: 0.5% KCl: 0.5% MgSO4 7H2 O: 0.05% FeSO4.7H2O: 0.001% MnSO4 7H2 O: 0.001% Agar: 1.5% 50 PHỤ LỤC 02 KẾT QUẢ ĐO CHIỀU CAO CÂY LÚA SAU NGÀY GIEO TRỒNG STT 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 CT1 16±0.548 5.5±0.548 16.3±0.548 14.4±0.548 16.5±0.548 14.4±0.548 8.6±0.548 12±0.548 12±0.548 13.2±0.548 10.8±0.548 14.1±0.548 8.9±0.548 12.3±0.548 7.5±0.548 15±0.548 14±0.548 12.9±0.548 15.2±0.548 15.7±0.548 13.8±0.548 13.1±0.548 13.4±0.548 16.2±0.548 9±0.548 13±0.548 9±0.548 11±0.548 Chiều cao (cm) CT2 CT3 3.1±0.517 11.8±0.435 11.3±0.517 11.8±0.435 9.6±0.517 4.9±0.435 13.8±0.517 4.5±0.435 13.4±0.517 2.4±0.435 10.2±0.517 4.3±0.435 8.1±0.517 4.2±0.435 9.5±0.517 6.8±0.435 6.5±0.517 10.8±0.435 4.2±0.517 8.7±0.435 7.2±0.517 7.6±0.435 5.1±0.517 7±0.435 4.6±0.517 8.5±0.435 6.7±0.517 6±0.435 7.9±0.517 4.5±0.435 8.1±0.517 9±0.435 7±0.517 9±0.435 8±0.517 6±0.435 5.5±0.517 7.8±0.435 10±0.517 5.8±0.435 4.5±0.517 9±0.435 12±0.517 7.1±0.435 9±0.517 6.1±0.435 7.6±0.517 8±0.435 10.6±0.517 4.9±0.435 9±0.517 6±0.435 5.2±0.517 7±0.435 7.9±0.517 6.1±0.435 CT4 11.1±0.367 4.5±0.367 5.7±0.367 6.6±0.367 3.5±0.367 4.5±0.367 8.7±0.367 6.2±0.367 8.5±0.367 8.2±0.367 5±0.367 5.3±0.367 8±0.367 9±0.367 5.1±0.367 5.6±0.367 4.5±0.367 4.3±0.367 4.2±0.367 7.3±0.367 5.5±0.367 4.2±0.367 9±0.367 4.4±0.367 5.8±0.367 8±0.367 6.3±0.367 8.2±0.367 51 PHỤ LỤC 03 MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Khuẩn lạc chủng MN1 Hình 2.2 Khuẩn lạc chủng MN2 môi trường PDA môi trường PDA Hình 2.3 Khuẩn lạc chủng MN1 Hình 2.4 Khuẩn lạc chủng MN2 môi trường Czapek môi trường Czapek 52 Hình 3.1 Bào tử cuống sinh bào tử Hình 3.2 Bào tử cuống chủng MN1 sinh bào tử chủng MN2 Hình 4.1 Phân giải phytate Hình 4.2 Phân giải phytate chủng chủng MN1 MN-2 53 Hình 5.1 Ni cấy lỏng chủng MN1 (A) MN2 (B) mơi trường PSM Hình 5.2 Dịch nuôi cấy lỏng chủng MN1 (A) MN2 (B) qua 120h ni cấy 54 Hình 6.1 Thu dịch ni cấy lỏng Hình 6.2 Thu dịch enzyme chủng MN1 MN2 qua mốc chủng MN1 MN2 qua thời gian mốc thời gian Hình 6.3 Dịch chứa enzyme phytase từ chủng ni cấy MN1 55 Hình 7.1 Các khay CT1, CT2, CT3, CT4 theo thứ tự từ 1, 2, 3, sau ngày gieo trồng Hình 7.2 Chiều cao cao thấp khay CT1, CT2, CT3, CT4 theo thứ tự từ 1, 2, 3, 56 ... hành chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập tuyển chọn số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase đất’’ MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập, tuyển chọn số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase thăm dò ảnh hưởng enzyme phytase. .. DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài tập trung nghiên cứu nội dung sau: - Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh enzyme phytase mạnh - Nghiên cứu đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng nấm mốc tuyển. .. Hình 3.2 Một số chủng nấm mốc sinh trưởng môi trường PSM 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYME PHYTASE MẠNH Để tiến hành tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh enzyme phytase mạnh, Tôi tiến