Khả năng kháng nấm Penicillium digitatum gây thối cam của dịch nuôi nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma được đánh giá là chi nấm có tiềm năng trong việc tạo chế phẩm sinh học do chúng an toàn và có khả năng đối kháng mạnh với nhiều loài nấm bệnh. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng kháng nấm P. digitatum của dịch nuôi nấm Trichoderma nhằm tìm kiếm các chủng nấm có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học kháng nấm P. digitatum gây thối quả cam.

Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 3: 355-362 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(3): 355-362 www.vnua.edu.vn KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM Penicillium digitatum GÂY THỐI CAM CỦA DỊCH NUÔI NẤM Trichoderma Vũ Xuân Tạo1*, Trần Bảo Trâm1, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Xuân Cảnh2, Thái Hạnh Dung3, Hoàng Phương Thảo3, Nguyễn Nhật Tân3, Nguyễn Trần Hà Anh3, Trần Văn Tuấn3 Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ KH&CN Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phịng Genomic, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: taovx.tsa@gmail.com Ngày nhận bài: 23.06.2020 Ngày chấp nhận đăng: 29.09.2020 TÓM TẮT Nấm Trichoderma đánh giá chi nấm có tiềm việc tạo chế phẩm sinh học chúng an tồn có khả đối kháng mạnh với nhiều loài nấm bệnh Mục tiêu nghiên cứu đánh giá khả kháng nấm P digitatum dịch ni nấm Trichoderma nhằm tìm kiếm chủng nấm có tiềm ứng dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học kháng nấm P digitatum gây thối cam Trong nghiên cứu này, 20 mẫu nấm Trichoderma (Tr.HG1 - Tr.HG20) phân lập từ đất trồng cam tỉnh Hà Giang, có mẫu nấm Tr.HG6 Tr.HG11 đánh giá có khả kháng mạnh với nấm P digitatum gây thối cam (đường kính vịng kháng nấm tương ứng 64,0 ± 1,0 45,3 ± 1,5mm) Dựa đặc điểm hình thái trình tự vùng ITS rDNA, mẫu nấm Tr.HG6 Tr.HG11 xác định thuộc lồi Trichoderma asperellum Trên mơi trường PDB, sau 72 nuôi cấy 30C, dịch nuôi cấy chủng T asperellum Tr.HG6 Tr.HG11 thể hoạt tính kháng P digitatum mạnh (đường kính vịng kháng nấm tương ứng 64,0 45,3mm) Dịch nuôi cấy chủng T asperellum Tr.HG6 có đặc tính bền nhiệt, giữ hoạt tính cao 50C Đồng thời, dịch ni cấy chủng Tr.HG6 thể hoạt tính ức chế khả gây bệnh nấm P digitatum cam Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm T asperellum Tr.HG6 Tr.HG11 có khả kháng nấm P digitatum mạnh có tiềm ứng dụng việc sản xuất chế phẩm sinh học Từ khóa: Bệnh thối cam, kháng nấm, Penicillium digitatum, Trichoderma asperellum Resistance to Orange-Rot Fungus Penicillium digitatum of Culture Solutions from Trichoderma ABSTRACT Trichoderma is a genus of fungus potential for probiotic preparation because it is safe and has strong resistance against many fungal species The objective of this study was to evaluate the P digitatum antifungal ability of Trichoderma culture in order to find the potential fungal strains for the production of P digitatum antifungal probiotics that cause orange rot In this study, twenty Trichoderma samples (Tr.HG1 - Tr.HG20) were isolated from orange-growing soil in Ha Giang province, of which Tr.HG6 and Tr.HG11 samples were assessed as being highly resistant to P digitatum causing orange rot (The diameters of the resistant zones were 64,0 ± 1,0 and 45,3 ± 1,5 mm, respectively) Based on the morphological characteristics and sequence of ITS region of rDNA, Tr.HG6 and Tr.HG11 samples were identified as Trichoderma asperellum On PDB media, after 72 h of incubation at 30°C, cultures of two strains of T asperellum Tr.HG6 and Tr.HG11 showed the strongest P digitatum resistance (The diameters of the resistant zones were 64.0 and 45.3 mm, respectively) The culture solution of T asperellum Tr.HG6 showed high thermal stability and had ability to keep its high activity at 50°C Simultaneously, the culture solution of Tr.HG6 showed the inhibitory activity of P digitatum on orange This study was able to select two T asperellum fungal strains, viz Tr.HG6 and Tr.HG11, that had strong ability to resist fungi with great potential for applying into probiotic preparation Keywords: Orange-rot, antifungal activity, Penicilliulm digitatum, Trichoderma asperellum 355 Khả kháng nấm Penicillium digitatum gây thối cam dịch nuôi nấm Trichoderma ĐẶT VẤN ĐỀ Penicillium chi nấm phổ biến có mặt hầu hết mơi trường sống Trong đó, nấm P digitatum coi tác nhân nghiêm trọng gây bệnh thối mốc xanh có múi (Vu & cs., 2018) Nhiều chứng cho thấy rằng, chất dễ bay tiết từ mô tế bào có múi đóng vai trị quan trọng q trình gây bệnh nấm P digitatum (Droby & cs., 2008) Nấm P digitatum xâm nhiễm qua vết xước có múi, vết xước côn trùng tác nhân vật lý gây Nếu nấm nhiễm vào giai đoạn trước thu hoạch gây tượng thối rụng (Bautista-Bos, 2014) Bên cạnh việc cơng làm hỏng quả, gây tổn thất kinh tế, sản phẩm trao đổi chất bậc hai nấm sinh gây ảnh hưởng tiêu cực sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, phương pháp phổ biến để diệt loại nấm bệnh trồng sử dụng loại thuốc hóa học diệt nấm Mặc dù, việc sử dụng thuốc hóa học để diệt nấm gây bệnh trồng có ưu điểm phổ rộng, hiệu tác dụng nhanh Tuy nhiên, sử dụng thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm hiệu phòng trừ thấp loại nấm bệnh đất, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người, xuất chủng nấm bệnh kháng thuốc (Sharma & cs., 2009) Áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học cách sử dụng phân hữu vi sinh, chế phẩm vi sinh, chứa chủng vi sinh vật hoạt chất từ vi sinh vật có khả kháng nấm gây bệnh ưu tiên hàng đầu sản xuất sản phẩm nông nghiệp an toàn (Palou & cs., 2008) Vi nấm Trichoderma đánh giá chi nấm có khả kiểm sốt sinh học tốt thơng qua khả kháng lại số nấm gây bệnh trồng nhờ chế kháng sinh, ký sinh cạnh tranh (Verma & cs., 2007) Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu nấm Trichoderma cho thấy tiềm loài nấm kiểm sốt lồi nấm gây bệnh thực vật (Vũ Xuân Tạo & Trần Văn Tuấn, 2020; Nguyễn Đức Huy & cs., 356 2017) Các chế phẩm chứa chủng vi sinh vật cần khoảng thời gian định để đạt hiệu quả, chủng vi sinh vật cần thời gian để sinh trưởng, sinh hoạt chất kháng nấm (Palou & cs., 2008) Do vậy, nghiên cứu này, đánh giá khả kháng nấm P digitatum dịch nuôi nấm Trichoderma làm sở khoa học cho việc tách chiết hoạt chất kháng nấm P digitatum từ dịch nuôi nấm Trichoderma hướng tới việc tạo chế phẩm có hiệu ức chế nấm P digitatum sau sử dụng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mẫu đất thu thập vườn trồng cam huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang dùng cho phân lập nấm Trichoderma Chủng nấm gây thối cam P digitatum cung cấp Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu mẫu đất Mẫu đất thu khu vực vùng rễ cam phát triển tốt, suất cao Mỗi điểm thu đào xuống từ mặt đất 20-30cm lấy khoảng 100g đất xung quanh vùng rễ Mẫu đựng túi polyetylen riêng biệt, ghi thời gian địa điểm thu mẫu Mẫu bảo quản mát sử dụng để phân lập nấm Trichoderma 2.2.2 Phân lập xác định đặc điểm hình thái mẫu nấm Trichoderma Các mẫu đất sử dụng để phân lập mẫu nấm Trichoderma pha lỗng nước cất vơ trùng đến nồng độ khác từ 10-1 đến 10-6 Cấy trải mẫu nồng độ mơi trường PDA có bổ sung kháng sinh chloramphenicol (100 g/ml) Kháng sinh chloramphenicol có tác dụng kháng khuẩn, ngăn không cho vi khuẩn sinh trưởng Các đĩa Vũ Xuân Tạo, Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Xuân Cảnh, Thái Hạnh Dung, Hoàng Phương Thảo, Nguyễn Nhật Tân, Nguyễn Trần Hà Anh, Trần Văn Tuấn ủ 28C thu nhận khuẩn lạc nấm riêng rẽ Các khuẩn lạc có sợi trắng, bào tử xanh xanh vàng tách riêng, làm giữ ống nghiệm để sử dụng cho thí nghiệm Các mẫu nấm sau khiết nuôi cấy trực tiếp tiêu hiển vi vơ trùng có chứa mơi trường PDA Tiêu giữ hộp nhựa vơ trùng có bổ sung giấy thấm nước vơ trùng để trì độ ẩm Mẫu ủ 28C 2-3 ngày hình thái hệ sợi nấm cuống sinh bào từ quan sát kính hiển vi (Vu & cs., 2018) 2.2.3 Thu bào tử nấm Các mẫu nấm Trichoderma sp phân lập nuôi cấy môi trường PDA ngày 28C Đĩa nuôi nấm bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa, dùng que gạt vô trùng gạt tách bào tử khỏi hệ sợi nấm Phần dịch lọc màng lọc Miracloth (Calbiochem, Đức) thu vào ống falcon 50ml, sau ly tâm tốc độ 4.000 vòng/phút thời gian 10 phút, đổ bỏ dịch bổ sung nước cất vô trùng vào ống Dịch bào tử nấm tiến hành xác định nồng độ buồng đếm Thoma, sau pha lỗng đến nồng độ thích hợp để sử dụng Dịch bào tử bảo quản 4C để sử dụng thời gian ngắn glycerol 20% -30C thời gian dài (Vu & cs., 2018) 2.2.4 Đánh giá khả kháng nấm P digitatum dịch nuôi mẫu nấm Trichoderma Đánh giá kháng nấm P digitatum dịch nuôi mẫu nấm Trichoderma thực phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Balcázar & cs., 2006) 500l dịch bào tử (106 bào tử/ml) mẫu nấm Trichoderma ni 50ml mơi trường PDB lỏng, lắc 200 vịng/phút 30C 72 Dịch nuôi mẫu nấm ly tâm 12.000 vòng/phút thời gian 30 phút 4C để loại bỏ bào tử hệ sợi nấm Bổ sung 50 l dịch nuôi cấy mẫu nấm Trichoderma vào lỗ đĩa thạch PDA cấy trải 50l dịch bào tử nấm P digitatum (106 bào tử/ml), ủ 4C để dịch ni khuếch tán vào mơi trường, sau đĩa giữ 25C Đường kính vịng kháng nấm xác định sau 4-5 ngày Dịch nuôi mẫu nấm Trichoderma thử khả kháng nấm P digitatum 10 đĩa petri thí nghiệm lặp lại lần độc lập 2.2.5 Định danh nấm Trichoderma dựa trình tự vùng ITS rDNA DNA hệ gen mẫu nấm Trichoderma tuyển chọn tách chiết theo quy trình nhóm nghiên cứu cơng bố (Tran & cs., 2017) Vùng ITS rDNA khuếch đại từ DNA hệ gen PCR sử dụng cặp mồi đa đặc hiệu cho phổ rộng loài nấm gồm: mồi xuôi ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) mồi ngược ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATAT GC) (White & cs., 1990) Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: 94C (3 phút); 35 chu kỳ 94C (30 giây), 58C (30 giây), 72C (30 giây); 72C (10 phút) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,7% tinh kit tinh hãng Promega (Mỹ) Mẫu DNA tinh giải trình tự cơng ty 1st BASE (Singapore) trình tự ITS phân tích so sánh với sở liệu GenBank Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA6 2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng thời gian ni cấy nấm Trichoderma tới hoạt tính kháng P digitatum 500l dịch bào tử (106 bào tử/ml) chủng nấm Trichoderma nuôi 50ml môi trường PDB lỏng, lắc 200 vòng/phút 30C sau 24, 48, 72 96 Hoạt tính kháng nấm dịch ni chủng nấm xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Balcázar & cs., 2006) 2.2.7 Đánh giá độ bền nhiệt dịch nuôi nấm Trichoderma Dịch nuôi chủng nấm Trichoderma tiến hành xử lý nhiệt 30, 40, 50 60C thời gian 30 phút Độ bền nhiệt dịch nuôi chủng nấm Trichoderma đánh giá thông qua khả kháng nấm P digitatum 357 Khả kháng nấm Penicillium digitatum gây thối cam dịch ni nấm Trichoderma Hoạt tính kháng nấm xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Balcázar & cs., 2006) 2.2.8 Đánh giá khả kháng nấm P digitatum cam dịch nuôi nấm Trichoderma Quả cam làm nước cất vơ trùng ethanol 70%, sau tạo vết thương xâm nhiễm tăm vô trùng Quả cam ngâm dịch nuôi nấm Trichoderma để khơ tự nhiên Tiến hành lây nhiễm 10µl dịch bào tử nấm P digitatum (nồng độ 106 bào tử/ml) cam Phương pháp lây nhiễm nấm P digitatum cam tiến hành theo quy trình nhóm nghiên cứu công bố (Vu & cs., 2018) Mẫu cam đối chứng ngâm nước cất vô trùng Quả cam sau lây nhiễm giữ hộp kín vơ trùng 25C quan sát sau 3-5 ngày KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn nấm Trichoderma kháng nấm P digitatum Từ mẫu đất thu vùng rễ cam phát triển mạnh, phân lập 20 mẫu nấm có đặc điểm giống với Trichoderma Sau 3-5 ngày nuôi cấy môi trường PDA 28C, mẫu nấm phân lập hình thành hệ sợi màu trắng, hệ sợi hình thành bào tử màu xanh nhạt tới đậm màu vàng nhạt lan phủ toàn bề mặt đĩa thạch tạo thành vòng tròn đồng tâm Các đặc điểm đặc điểm đặc trưng nấm Trichoderma (Kubicek & Harman, 1998) Dịch nuôi 20 mẫu nấm đánh giá khả kháng nấm gây thối cam P digitatum phương pháp khuếch tán thạch Kết nghiên cứu cho thấy, có mẫu nấm có hoạt tính kháng nấm P digitatum bao gồm mẫu nấm Tr.HG3, Tr.HG6, Tr.HG8, Tr.HG9, Tr.HG11, Tr.HG15, Tr.HG16 Tr.HG18 (Hình 1) Trong số mẫu này, dịch nuôi mẫu Tr.HG6 Tr.HG11 thể hoạt tính kháng nấm P digitatum mạnh với đường kính vòng kháng nấm tương ứng 64,0 ± 1,0 45,3 ± 1,5mm, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P