Bài viết Khả năng kháng nấm Malassezia gây bệnh trên da người của một số loại dịch chiết thảo dược tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng nấm Malassezia của dịch chiết một số loại thảo dược ở Việt Nam để đưa ra những căn cứ khoa học cho việc ứng dụng nguồn hoạt chất thiên nhiên này trong việc phát triển các sản phẩm từ thảo dược kiểm soát nấm Malassezia.
Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0135 KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM Malassezia GÂY BỆNH TRÊN DA NGƯỜI CỦA MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHIẾT THẢO DƯỢC Trần Bảo Trâm1, Phan Xn Bình Minh1, Hồng Quốc Chính1, Lê Quân2, Trần Văn Tuấn3, Vũ Xuân Tạo1* Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học Công nghệ Công ty TNHH MTV TraphacoSapa Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội *Email: taovx.tsa@gmail.com TÓM TẮT Nấm men Malassezia nguyên nhân phổ biến gây nhiều bệnh lý da người gàu, lang ben, viêm da,… Việc sử dụng không kiểm soát loại thuốc kháng nấm Malassezia itraconazole, ketoconazole fluconazole thường mang lại tác dụng phụ khơng mong muốn Do vậy, việc tìm kiếm nguồn hoạt chất kháng nấm Malassezia từ thảo dược thay cho loại chất kháng nấm hóa học quan tâm Nghiên cứu đánh giá khả kháng nấm Malassezia 12 loại dịch chiết thảo dược, dịch chiết củ giềng có hoạt tính kháng nấm tốt Dịch chiết củ giềng thể hoạt tính kháng mạnh chủng nấm gây bệnh da người M furfur VNF01, M furfur ATCC14521 M globosa VNG02 với nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng chủng nấm (MIC) tương ứng 5,5 10 µL/mL Ở nồng độ dịch chiết củ giềng sử dụng 10 µL/mL, tỉ lệ tế bào nấm Malassezia bị loại bỏ đạt từ 58 - 66 % sau 20 phút xử lí Kết thu từ nghiên cứu cho thấy dịch chiết củ giềng có tiềm ứng dụng phát triển sản phẩm dùng ngồi da kiểm sốt nấm Malassezia dầu gội kem Từ khóa: Alpinia galanga, dịch chiết thảo dược, kháng nấm Malassezia, Malassezia furfur, Malassezia globosa MỞ ĐẦU Ngày nay, bệnh lí da nấm Malassezia gây phổ biến, đặc biệt nước có khí hậu nóng ẩm Việt Nam [1] Nấm Malassezia sống ký sinh da người, sử dụng chất dinh dưỡng cần thiết cho trình sinh trưởng, gặp điều kiện thuận lợi chúng trở thành tác nhân gây bệnh Nấm Malassezia gây bệnh cách sinh loại enzym lipase loại phospholipase Những enzym tham gia vào trình thủy phân axit béo trung tính thành axit béo tự gây phản ứng trung gian tế bào kích hoạt đường gây viêm [2] Đồng thời, chúng tổng hợp số chất có hoạt tính sinh học indole hoạt động thông qua thụ thể hydrocacbon (Ahr) tập trung tế bào lớp biểu bì Ahr có vai trị tác nhân quan trọng chế gây bệnh nấm Malassezia có khả làm thay đổi cấu trúc nội mô gây biểu bệnh lí da [3] Trong chi nấm Malassezia, M furfur M globosa loài phổ biến gây bệnh da người, chúng loài nấm men ưa lipid nên thường khu trú vùng da có hệ thống tiết dầu mạnh da mặt, da đầu,… Một số bệnh lí nấm M furfur M globosa gây ghi nhận gàu da đầu, viêm da dầu, lang ben, viêm da dị ứng, viêm nang lông… [4, 5] Để điều trị bệnh lí da nấm Malassezia gây ra, loại thuốc kháng nấm thuộc nhóm azole điển itraconazole, ketoconazole fluconazole thường sử dụng Các loại thuốc có tác dụng kìm hãm phát triển nấm Malassezia Tuy nhiên, theo nhiều nghiên 47 Trần Bảo Trâm cs cứu khuyến cáo nhà sản xuất, loại thuốc có tác dụng phụ định Ketoconazole có nguy gây độc tính suy gan thận sử dụng đường uống bị cấm lưu hành Mỹ từ năm 2013, chấp nhận dùng dạng chế phẩm chỗ ketoconazole % dạng gel dầu gội [6] Fluconazole Itraconazole tác động tích cực kiểm sốt nấm Malassezia theo khuyến cáo nhà sản xuất, itraconazole fluconazole gây tượng đau đầu, chóng mặt, buồn nơn, đau bụng, ngồi, tăng men gan, ban ngứa tróc vảy da [7, 8, 9] Hơn nữa, việc sử dụng khơng kiểm sốt loại thuốc kháng nấm gây tình trạng kháng thuốc điều trị, đồng nghĩa với việc phát sinh chủng nấm Malassezia kháng thuốc/đa kháng thuốc Do việc tìm kiếm hoạt chất kháng nấm Malassezia cần thiết Các hoạt chất tổng hợp hóa học chiết xuất sinh vật (vi sinh vật, động vật, thực vật) Trong đó, hoạt chất chiết xuất từ thực vật đặc biệt loại thảo dược có nhiều lợi hiệu kháng cao, an toàn sử dụng hạn chế đươc tượng kháng thuốc Việt Nam nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng, đặc biệt nhiều loài thực vật sử dụng loại dược liệu thuốc dân gian để điều trị bệnh nấm da Nghiên cứu tìm kiếm lồi thực vật có hoạt tính kháng nấm Malassezia gây bệnh da người nhằm định hướng khai thác, ứng dụng nguồn dược chất tự nhiên phục vụ bảo vệ sức khỏe người công việc cần thiết Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá khả kháng nấm Malassezia dịch chiết số loại thảo dược Việt Nam để đưa khoa học cho việc ứng dụng nguồn hoạt chất thiên nhiên việc phát triển sản phẩm từ thảo dược kiểm soát nấm Malassezia VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm Malassezia furfur VNF01 Malassezia globosa VNG02 phân lập da người bệnh Việt Nam, chủng nấm Malassezia furfur ATCC14521 cung cấp Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ, chủng nấm lưu giữ Trung tâm Sinh học Thực nghiệm Viện Ứng dụng Công nghệ (Bộ Khoa học Công nghệ) Các mẫu thảo dược dùng cho việc chiết dịch: củ nghệ trắng (Curcuma aromatica), củ nghệ vàng (Curcuma longa), trầu không (Piper betle), vỏ bưởi (Citrus grandis), trà xanh (Camellia sinensis), bồ kết (Gleditsia fera), cỏ mần trầu (Eleusine indica), cỏ mực (Eclipta prostrata), móng (Lawsonia inermis), rau sam (Portulaca oleracea), đơn mặt trời (Excoecaria cochinchinensis Lour.) củ giềng (Alpinia galanga) 2.2 Phương pháp thu dịch chiết Các mẫu thảo dược tiến hành rửa sạch, sấy khô 50 oC nghiền nhỏ, tiến hành ngâm chiết cồn ethanol 70 % 48 với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 Sau ngâm chiết tiến hành thu dịch chiết cách lọc qua giấy lọc whatman, cô quay chân không 45 oC để loại bỏ dung môi cô mẫu tới phần dịch chiết lại 1/10 (v/v) 2.3 Xác định hoạt tính kháng nấm dịch chiết thảo dược phương pháp khuếch tán qua thạch Trải 50 μL dịch nuôi niết củ giềng dịch chiết trầu khơng thể hoạt tính kháng nấm Malassezia tốt Vì vậy, loại dịch chiết lựa chọn để tiến hành đánh giá sâu khả kháng nấm Malassezia Hình Khả kháng nấm M furfur M globosa số loại dịch chiết thảo dược Khả kháng nấm Malassezia dịch chiết trầu không dịch chiết củ giềng tiếp tục đánh giá nồng độ pha loãng khác Kết nghiên cứu cho thấy, khả kháng nấm loại dịch giảm dần pha lỗng (Hình 2) Đối với dịch chiết trầu khơng, pha lỗng tới nồng độ 20 % 10 % cịn hoạt tính kháng với chủng M furfur VNF01, khả kháng chủng cịn lại (Hình 2A, B) Đối với dịch chiết củ giềng, nồng độ pha loãng 10 % có khả kháng chủng nấm nghiên cứu ATCC14521, VNF01 VNG02 (Hình 2C, D) Như vậy, thấy dịch chiết củ giềng thể hoạt tính kháng nấm Malassezia tốt Các nghiên cứu trước dịch chiết trầu không cho thấy loại dịch chiết thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh cách giải phóng chất chuyển hóa thứ cấp [13] Hydroxychavicol, 50 Khả kháng nấm Malassezia gây gệnh da người số loại dịch chiết thảo dược thành phần phenolic trầu, báo cáo có hoạt tính chống lại nấm Candida spp [14] Các hoạt chất chiết xuất từ giềng diterpene, (E) -8β, 17-epoxylabd-12-ene-15, 16dial có tác dụng tăng cường khả chống nấm Candida albicans, Trichophyton longifusus [15, 16] Từ kết nghiên cứu cho thấy dịch chiết giềng có tiềm việc phát triển sản phẩm kháng nấm Malassezia Hình Khả kháng nấm M furfur M globosa dịch chiết trầu không dịch chiết củ giềng nồng độ pha lỗng khác (A, B) Vịng kháng nấm Malassezia đĩa mơi trường (A) kích thước vịng kháng (B) dịch chiết trầu khơng; (C, D) Vịng kháng nấm Malassezia đĩa mơi trường (C) kích thước vòng kháng (D) dịch chiết củ giềng 3.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) sinh trưởng nấm M furfur M globosa dịch chiết giềng Để sử dụng dịch chiết củ giềng việc phát triển sản phẩm dược liệu cần xác định giá trị MIC dịch chiết củ giềng ức chế hoàn toàn sinh trưởng nấm Malassezia Kết nghiên cứu cho thấy, giá trị MIC dịch chiết củ giềng chủng nấm M furfur ATCC14521, M furfur VNF01 M globosa VNG02 tương ứng 5, 10 µL/mL (Hình 3) Như giá trị MIC 10 µL/mL, chủng nấm Malassezia nghiên cứu bị ức chế Nghiên cứu xác định giá trị MIC dịch chiết củ giềng trồng Việt Nam chủng nấm Malassezia gây bệnh da người Cùng nghiên cứu chủng nấm M furfur ATCC14521, M furfur VNF01 M globosa VNG02, Vu cs (2021) xác định nồng độ tối thiểu ức chế hoàn toàn chủng nấm tinh dầu bạc hà 2,5 µL/mL tinh dầu trầu khơng µL/mL [17] Tuy giá trị MIC dịch chiết củ giềng cao loại tinh dầu việc thu dịch chiết củ giềng so với thu tinh dầu bạc hà trầu không phù hợp với việc ứng dụng vào sản xuất xét mặt sản lượng giá thành Như thấy, dịch chiết củ giềng nguồn nguyên liệu tiềm phát triển sản phẩm kháng nấm Malassezia dầu gội, sữa tắm hay dạng chế phẩm xịt da 51 Trần Bảo Trâm cs Hình Nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng nấm M furfur M globosa dịch chiết củ giềng 3.3 Xác định thời gian diệt nấm Malassezia dịch chiết củ giềng Nghiên cứu hướng tới việc ứng dụng dịch chiết củ giềng vào phát triển số sản phẩm dầu gội, sữa tắm dùng cho phòng hỗ trợ điều trị bệnh da nấm Malassezia Việc xác định thời gian sản phẩm (dầu gội, sữa tắm) lưu lại da đủ để kiểm soát nấm bệnh yếu tố quan trọng Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi tiến hành xác định hiệu diệt nấm Malassezia theo thời gian tiếp xúc với dịch chiết củ giềng giá trị MIC 10 µl/mL làm sở khoa học cho nghiên cứu xác định thời gian lưu sản phẩm da Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ dịch chiết củ giềng 10 µL/mL, sau phút xử lý, tỉ lệ tế bào nấm Malassezia chết đạt từ 40 - 50 % Khi tăng dần thời gian xử lý, tỉ lệ tế bào nấm chết tăng dần đạt cao sau 20 phút ủ với tỉ lệ tế bào chết từ 58 - 66 % (Hình 4) Đây nghiên cứu xác định ảnh hưởng thời gian tiếp xúc tới hiệu diệt nấm Malassezia dịch chiết củ giềng Tuy nhiên, kết nghiên cứu nguyên liệu dùng cho tạo sản phẩm Việc xác định thời gian xác cần khuyến cáo cho việc lưu sản phẩm cuối (dầu gội, sữa tắm) cần có thêm đánh giá cụ thể Nhiều sản phẩm dầu gội, kem lotion phát triển chứa hoạt chất từ thảo dược để điều trị gàu bệnh lang ben nấm Malassezia gây [18] Các sản phẩm sau hoàn thiện đưa thị trường sử dụng có khuyến cáo thời gian sử dụng hay thời gian cần thiết lưu lại sản phẩm da (đặc biệt với sản phẩm dầu gội hay sữa tắm) Với kết đạt cho thấy, thời gian tiếp xúc ngắn từ - 20 phút, dịch chiết củ giềng cho hiệu diệt nấm Malassezia đạt từ 40 - 66 % Như vậy, dịch chiết củ giềng nguồn nguyên liệu tiềm để phát triển sản phẩm dầu gội, sữa tắm dùng việc kiểm soát nấm Malassezia 52 Khả kháng nấm Malassezia gây gệnh da người số loại dịch chiết thảo dược Hình Khả diệt nấm Malassezia theo thời gian dịch chiết củ giềng KẾT LUẬN Nghiên cứu đánh giá khả kháng nấm Malassezia 12 loại dịch chiết thảo dược, dịch chiết củ giềng có hoạt tính kháng nấm tốt Dịch chiết củ giềng thể hoạt tính kháng mạnh chủng nấm gây bệnh da người M furfur VNF01, M furfur ATCC14521 M globosa VNG02 với nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng chủng nấm (MIC) tương ứng 5, 10 µL/mL Ở nồng độ dịch chiết củ giềng sử dụng 10 µL/mL, tỉ lệ tế bào nấm Malassezia chết đạt từ 40 - 50 % sau phút ủ đạt cao sau 20 phút ủ Sau 20 phút tiếp xúc với dịch chiết nồng độ 10 µL/mL, tỉ lệ nấm Malassezia chết đạt từ 58 - 66 % Như thấy dịch chiết củ giềng nguyên liệu có tiềm ứng dụng việc phát triển sản phẩm kiểm soát nấm Malassezia dầu gội, sữa tắm,… TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Cẩm Vân (2017) Xác định Malassezia bệnh lang ben hiệu điều trị thuốc kháng nấm azole, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội [2] Gupta, A K., Batra, R., Bluhm, R., Boekhout, T & Dawson Jr, T L (2004) Skin diseases associated with Malassezia species Journal of the American Academy of Dermatology, 51(5), 785-798 [3] Magiatis, P., Pappas, P., Gaitanis, G., Mexia,, N., Melliou, E., Galanou, M.,… & Marselos, M (2013) Malassezia yeasts produce a collection of exceptionally potent activators of the Ah (dioxin) receptor detected in diseased human skin Journal of Investigative Dermatology, 133(8), 2023-2030 [4] Saunders, C W., Scheynius, A & Heitman, J (2012) Malassezia fungi are specialized to live on skin and associated with dandruff, eczema, and other skin diseases PLoS Pathog 8(6), 1-4 [5] Erchiga, V C & Florencio, V D (2002) Malassezia species in skin disease Current opinion in infectious diseases, 15(2), 133-142 53 Trần Bảo Trâm cs [6] United States Food and Drug Administration (2013) FDA drug safety communication: FDA warns that prescribing of Nizoral (ketoconazole) oral tablets for unapproved uses including skin and nail infractions continues; linked to patient death [7] Bhogal, C S., Singal, A & Baruah, M C (2001) Comparative efficacy of Ketoconazole and Fluconazole in the treatment of Pityriasis versicolor: A one-year follow‐up study The Journal of Dermatology, 28(10), 535-539 [8] Kokturk, A., Kaya, T., Ikizoglu, G., Bugdayci, R & Koca, A (2002) Efficacy of three shortterm regimens of itraconazole in the treatment of Pityriasis versicolo Journal of Dermatological Treatment, 13(4) 185-187 [9] Köse, O., Taştan, H B., Gür A R & Kurumlu, Z (2002) Comparison of a single 400 mg dose versus a 7-day 200 mg daily dose of itraconazole in the treatment of Tinea versicolor Journal of Dermatological Treatment, 13(2), 77-79 [10] Hadacek, F & Greger, H (2000) Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice Phytochemical analysis, 11(3), 137-147 [11] Lambert, R & Pearson, J (2000) Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum inhibitory concentration (MIC) and non‐inhibitory concentration (NIC) values Journal of Applied Microbiology, 88(5), 784-790 [12] Joray, M B., del-Rollán, M R., Ruiz, G M., Palacios, S M & Carpinella, M C (2011) Antibacterial activity of extracts from plants of central Argentina isolation of an active principle from Achyrocline satureioides Planta Medica, 77(01), 95-100 [13] Hoque, M M., Rattila, S., Shishir, M A., Bari, M., Inatsu, Y & Kawamoto, S (2011) Antibacterial activity of ethanol extract of betel leaf (Piper betle L.) against some food borne pathogens Bangladesh Journal of Microbiology, 28(2), 58-63 [14] Jenie, B S L., Andarwulan, N., Puspitasari-Nienaber, N L & Nuraida, L (2001) Antimicrobial activity of Piper betle Linn extract towards foodborne pathogens and food spoilage microorganisms Food Microbiology: General, IFT Annual Meeting - New Orleans, Louisiana [15] Haraguchi, H., Kuwata, Y., Inada, K., Shingu, K., Miyahara, K., Nagao, M & Yagi, A (1996) Antifungal activity from Alpinia galanga and the competition for incorporation of unsaturated fatty acids in cell growth Planta Medica, 62(04), 308-313 [16] Khattak, S., Shah, H U., Ahmad, W & Ahmad, M (2005) Biological effects of indigenous medicinal plants Curcuma longa and Alpinia galanga Fitoterapia, 76(2), 254-257 [17] Vu, T X., Tran, T B., Hoang, C Q., Nguyen, H T., Phan, M X B., Dao, A N., Dinh, M T., Soytong, K & Nguyen, H Q (2021) Chemical compositions and Anti-malassezia properties of Vietnamese Mentha arvensis and Piper betle essential oils International Journal of Agricultural Technology, 17(4), 1619-1630 [18] Donato, R., Sacco, C., Pini G & Bilia A R (2020) Antifungal activity of different essential oils against Malassezia pathogenic species Journal of Ethnopharmacology, 249, 1-24 54 Khả kháng nấm Malassezia gây gệnh da người số loại dịch chiết thảo dược ABSTRACT RESISTANCE AGAINST DERMATOLOGIC PATHOGEN Malassezia FUNGUS OF SOME HERBAL EXTRACTS Bao Tram Tran1, Xuan Binh Minh Phan1, Quoc Chinh Hoang1, Quan Le2, Van Tuan Tran3, Xuan Tao Vu1* Center of Experimental Biology, National Center for Technological Progress, Ministry of Science and Technology TraphacoSapa Single Member Limited Liabilities Company Faculty of Biology, University of Science, Vietnam National University, Hanoi *Email: taovx.tsa@gmail.com Malassezia is the common cause of many human skin diseases such as dandruff, pityriasis versicolor, and dermatitis The uncontrolled use of Malassezia antifungal drugs such as itraconazole, ketoconazole and fluconazole often results in negative side effects Therefore, the search for herbal anti-fungal active ingredients against Malassezia as the replacement of chemical antifungal agents is of interest This study evaluated the antifungal activity against Malassezia from 12 types of herbal extracts, of which the Alpinia galanga root extract exhibited the best antifungal activity A galanga root extract showed strong activity against strains of human skin pathogenic fungi: M furfur VNF01, M furfur ATCC14521 and M globosa VNG02 with the minimal inhibiting concentrations (MIC) of 5, and 10 µL/mL, respectively After 20 minutes of treatment at 10 µL/mL of A galanga root extract, 58 - 66 % of Malassezia fungal cells were The results suggest that the A galanga extract has potential applications for developing topical skin products to control Malassezia such as shampoos and creams Keywords: Alpinia galanga, herbal extracts, resistance against Malassezia, Malassezia furfur, Malassezia globosa, essential oils 55 56 .. .Malassezia 52 Khả kháng nấm Malassezia gây gệnh da người số loại dịch chiết thảo dược Hình Khả diệt nấm Malassezia theo thời gian dịch chiết củ giềng KẾT LUẬN Nghiên cứu đánh giá khả kháng nấm Malassezia .. .số loại dịch chiết thảo dược Khả kháng nấm Malassezia dịch chiết trầu không dịch chiết củ giềng tiếp tục đánh giá nồng độ pha loãng khác Kết nghiên cứu cho thấy, khả kháng nấm loại dịch giảm ...thấy loại dịch chiết thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh cách giải phóng chất chuyển hóa thứ cấp [13] Hydroxychavicol, 50 Khả kháng nấm Malassezia gây gệnh da người số loại dịch chiết thảo dược thành