Bài viết khảo sát một mô hình thực nghiệm gây tổn thương thận cấp bằng cisplatin nhằm ứng dụng trong sàng lọc ứng viên có tác dụng bảo vệ thận từ dược liệu.
Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 10 - 2020 KHẢO SÁT MƠ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG THẬN CẤP BẰNG CISPLATIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Ngọc Phụng1, Mai Thành Chung2 Nguyễn Thị Thu Hương1* Khoa Dược - Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh (*Email: huongsam@hotmail.com) Ngày nhận: 12/9/2020 Ngày phản biện: 20/10/2020 Ngày duyệt đăng: 29/11/2020 TÓM TẮT Cisplatin sử dụng hiệu hóa trị liệu nhiều loại bệnh ung thư Tuy nhiên, độc tính thận tác dụng phụ làm hạn chế việc sử dụng cisplatin với chuyển biến từ tổn thương thận cấp đến tổn thương thận mạn Sử dụng cisplatin xây dựng mơ hình gây tổn thương thận cấp chuột nhắt trắng lựa chọn phù hợp tính đơn giản có nhiều điểm tương đồng với độc tính thận cisplatin gây bệnh nhân ung thư Nghiên cứu thực với mục tiêu khảo sát mơ hình thực nghiệm gây tổn thương thận cấp cisplatin nhằm ứng dụng sàng lọc ứng viên có tác dụng bảo vệ thận từ dược liệu Kết đề tài chọn liều tối ưu cisplatin 15 mg/kg, chuột tiêm phúc mô sau 72 có tăng nồng độ creatinin, BUN (blood ure nitrogen) huyết tương tăng hàm lượng MDA (malondialdehyd) dịch đồng thể thận Quercetin sử dụng làm thuốc thử nghiệm, liều uống 30 mg/kg 50 mg/kg làm giảm nồng độ creatinin, BUN huyết tương hàm lượng MDA thận chuột nhắt trắng bị gây tổn thương thận cấp cisplatin, thể tác dụng bảo vệ thận trước tổn thương oxy hoá gây cisplatin Từ khoá: Cisplatin, tổn thương thận cấp, creatinin, BUN, MDA, quercetin Trích dẫn: Nguyễn Ngọc Phụng, Mai Thành Chung Nguyễn Thị Thu Hương, 2020 Khảo sát mơ hình gây tổn thương thận cấp cisplatin chuột nhắt trắng Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 10: 251-262 *PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương - Giảng viên Khoa Dược Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô 251 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê quan nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer – IARC), năm 2018 tồn giới có 18,08 triệu ca ung thư mắc với 9,5 triệu ca tử vong Việt Nam ước tính có 164,671 nghìn ca mắc với 114,871 nghìn ca tử vong (Ferlay et al., 2018) Cisplatin (cis-diamine dichloroplatinum II) thuốc hóa trị ung thư có chứa platinum định phác đồ hóa trị nhiều loại bệnh ung thư Việc điều trị cisplatin chứng minh đạt hiệu kèm theo nhiều tác dụng phụ lâm sàng Tổn thương thận bắt đầu vài ngày sau điều trị cisplatin với gia tăng nồng độ creatinin, nitơ ure máu (BUN), gây tổn thương oxy hóa thận làm tăng gốc tự làm suy giảm chất chống oxy hóa tế bào thận (Shaloam et al., 2014) Do tỷ lệ mắc bệnh ngày tăng, nhờ phát triển khoa học nhiều mơ hình động vật thực nghiệm nghiên cứu để nắm bắt chế gây bệnh đưa mơ hình vào tìm kiếm, thử nghiệm thuốc điều trị Trước thực trạng điều trị ung thư cisplatin tỉ lệ tổn thương thận cấp ngày tăng cao, việc mô mơ hình gây tổn thương thận cisplatin chuột nhắt trắng lựa chọn tính đơn giản có nhiều điểm tương đồng với độc tính thận cisplatin gây người Do nghiên cứu thực với mục tiêu ứng dụng mô hình thực nghiệm gây tổn thương thận cấp cisplatin Số 10 - 2020 sàng lọc thuốc có tác dụng bảo vệ thận ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Động vật thử nghiệm Các thử nghiệm thực chuột nhắt trắng đực Swiss albino (Mus musculus var albino), - tuần tuổi, trọng lượng trung bình 28 ± gam Chuột thực phẩm nuôi cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế TP Nha Trang Chuột để ổn định tuần mơi trường thí nghiệm (chu kì 12 sáng - tối, 27 ± 2°C độ ẩm tương đối < 70%) lồng kích thước 25 x 35 x 15 cm (8 chuột/lồng) với nước uống đầy đủ Thể tích cho uống (p.o.) tiêm màng bụng (i.p.) 10 ml/kg trọng lượng chuột 2.1.2 Thuốc thử nghiệm Cisplatin quercetin (có độ tinh khiết ≥ 97%, định lượng HPLC) cung cấp Sigma Aldrich – Mỹ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát mơ hình gây tổn thương thận cấp cisplatin chuột nhắt trắng Chuột chia ngẫu nhiên thành lô (n = 7) với thời gian khảo sát ngày sau: Lô đối chứng sinh lý (tiêm i.p NaCl 0,9%) lô cisplatin (i.p liều cisplatin với liều 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg 30 mg/kg) Cisplatin hòa tan dimethylformamide (DMF) với tỷ lệ 252 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô mg cisplatin/ 0,1 ml DMF, sau pha NaCl 0,9% vừa đủ 10 ml Chuột chia ngẫu nhiên thành lô (n = 10) với thời gian khảo sát 14 ngày sau: Lô đối chứng sinh lý (tiêm i.p NaCl 0,9%) lô cisplatin (i.p liều cisplatin với liều 10 mg/kg, 15 mg/kg Cisplatin hòa tan dimethylformamide (DMF) với tỷ lệ mg cisplatin/ 0,1 ml DMF, sau pha NaCl 0,9% vừa đủ 10 ml Chỉ tiêu khảo sát: Thời gian phân suất tử vong, đánh giá tiêu sinh hóa: Nồng độ creatinin, BUN (Blood ure nitrogen) huyết tương, malondialdehyd (MDA) dịch đồng thể thận, đánh giá mơ học vi thể thận, từ chọn liều cisplatin để gây mơ hình tổn thương thận cấp chuột cho thử nghiệm sàng lọc thuốc dược liệu 2.2.2 Khảo sát tác dụng quercetin mơ hình gây tổn thương thận cisplatin Chuột chia ngẫu nhiên thành lô (n = 8) sau: - Nhóm cisplatin (-): Chuột tiêm NaCl 0,9% (i.p.) liều Sau đó, chia thành lơ đối chứng sinh lý (uống nước cất) lô thử uống quercetin liều 30 mg/kg; 50mg/kg - Nhóm cisplatin (+): Chuột lô chứng (uống nước cất) lô thử (uống quercetin liều 30 mg/kg; 50 mg/kg) cho uống theo phác đồ dự phòng ngày trước gây mơ hình tổn thương thận cấp cisplatin Một sau cho uống mẫu thử ngày thứ năm, chuột Số 10 - 2020 tiêm phúc mạc cisplatin liều (liều lựa chọn từ thử nghiệm 2.2.1.) Vào ngày 8, sau lần cho uống cuối lấy khoảng 0,06 ml máu tĩnh mạch đuôi chuột để tiến hành định lượng số creatinin, BUN huyết tương mổ tách lấy thận chuột đem định lượng MDA dịch đồng thể thận khảo sát mô bệnh học thận (được thực Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM) 2.2.3 Định lượng creatinin BUN huyết tương Định lượng creatinin thực theo hướng dẫn kit creatinin Liquicolor Human Diagnostic Ltd Co (Germany) Mẫu thử nghiệm gửi Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic Tp.HCM Quy trình định lượng BUN dựa vào kit BUN ELISA (cat.No MBS 3801103) My BioSource cung cấp 2.2.4 Phương pháp định lượng MDA dịch đồng thể thận chuột - Tiến hành: Tách thận chuột nghiền đồng thể dịch đệm KCl 1,15% (tỉ lệ 1: 10) phút tốc độ 13.000 vòng/phút Lấy ml dịch đồng thể thận bổ sung dung dịch đệm Tris-HCl (pH = 7,4) vừa đủ ml, ủ 37 oC Kết thúc phản ứng 1ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10.000 vòng/phút, lấy ml dịch cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% 100 oC 15 phút đo màu λ =532 nm - Tính tốn kết quả: Hàm lượng MDA (nM/g protein) tính theo phương 253 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA (Nguyễn Thị Thu Hương cộng sự, 2020) 2.3 Đánh giá kết Số liệu thực nghiệm thể số trung bình M ± SEM (Standard Error of the Mean - sai số chuẩn giá trị trung bình) Xử lý số liệu phần mềm MS Excel 2016, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One –Way ANOVA hậu kiểm Student – Newman – Keuls test (phần mềm SigmaStat 3.5, USA) Kết thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% p < 0,05 so với lô chứng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết Kết Bảng cho thấy với thời gian khảo sát ngày cisplatin gây tình trạng tử vong chuột đạt 86-100% liều i.p 20 mg/kg 30 mg/kg, tương ứng, khoảng 12 – 48 sau tiêm Cisplatin liều 10mg/kg gây tử Số 10 - 2020 vong chuột vào ngày thứ chiếm tỉ lệ 14,3% liều 15 mg/kg có tỉ lệ tử vong vào ngày thứ 14,3% Do liều cisplatin 10 mg/kg 15 mg/kg tiếp tục khảo sát phân suất tử vong chuột nhắt trắng với thời gian thử nghiệm 14 ngày Cisplatin liều 10 mg/kg gây tử vong chuột vào ngày chiếm tỉ lệ 10% kết thúc thử nghiệm 14 ngày đạt tỉ lệ tử vong 30% Cisplatin liều 15 mg/kg gây tử vong chuột vào ngày chiếm tỉ lệ 40%, ngày 60% đạt tỉ lệ tử vong 100% ngày 11 Điều chứng tỏ cisplatin có tác động gây độc quan thể chuột gây ảnh hưởng đến khả sống chuột Dựa vào phân suất tử vong, đề tài tiếp tục chọn cisplatin liều 10 mg/kg 15 mg/kg để khảo sát tiếp tiêu sinh hoá (creatinin huyết tương MDA dịch đồng thể thận) thời điểm ngày sau tiêm cisplatin nhằm xác định liều tối ưu gây mơ hình tổn thương thận cấp chuột 254 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 10 - 2020 Bảng Phân suất tử vong mơ hình gây tổn thương thận cấp cisplatin chuột nhắt trắng Lô thử nghiệm Chứng sinh lý Cisplatin 10 mg/kg Cisplatin 15 mg/kg Cisplatin 20 mg/kg Cisplatin 30 mg/kg Chứng sinh lý Cisplatin 10 mg/kg Cisplatin 15 mg/kg n Thời gian xuất tử vong (sau tiêm cisplatin) Thời gian khảo sát ngày 7 Ngày Ngày Ngày Ngày Thời gian khảo sát 14 ngày 10 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 10 Ngày Ngày 11 Phân suất tử vong (%) 14,3 14,3 86 100 10 20 30 40 60 100 n: Số chuột thử nghiệm Kết Bảng cho thấy lô tiêm phúc mô cisplatin liều 10 mg/kg có nồng độ creatinin huyết tương hàm lượng MDA dịch đồng thể thận chưa có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý Chuột tiêm phúc mô cisplatin liều 15 mg/kg có nồng độ creatinin huyết tương hàm lượng MDA dịch đồng thể thận tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý thời điểm ngày sau tiêm cisplatin (p < 0,001) Có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001) liều cisplatin 10 mg/kg 15 mg/kg hai tiêu nồng độ creatinin huyết tương hàm lượng MDA dịch đồng thể thận Do liều cisplatin 15 mg/kg chọn để tiếp tục khảo sát thêm số tiêu khác nồng độ BUN đánh giá mơ bệnh học thận 255 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 10 - 2020 Bảng Nồng độ creatinin huyết tương hàm lượng MDA dịch đồng thể thận mơ hình gây tổn thương thận cấp cisplatin chuột nhắt trắng Lô thử nghiệm (n = 10) Chứng sinh lý Cisplatin 10 mg/kg Cisplatin 15 mg/kg Nồng độ creatinin huyết tương (mg/dl) 0,65 ± 0,02 0,69 ± 0,02### 1,79 ± 0,09*** Hàm lượng MDA thận (nM/g protein) 118,77 ± 7,89 131,96 ± 4,28### 227,72 ± 7,38*** n: Số chuột thử nghiệm; ***: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng sinh lý (p < 0,001); ###: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô cisplatin liều 15 mg/kg (p < 0,001) Bảng Nồng độ BUN mơ hình tổn thương thận cấp cisplatin liều 15 mg/kg chuột nhắt trắng Lô thử nghiệm (n =10) Nồng độ BUN huyết tương (mg/dl) Chứng sinh lý 25,09 ± 0,53 126,75 ± 12,75*** Cisplatin 15 mg/kg n: Số chuột thử nghiệm; ***: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,001) Kết đánh giá mô bệnh học thận chuột cho thấy mô thận lô tiêm cisplatin liều 15 mg/kg ngày thứ chưa thể rõ tổn thương so với lô chứng sinh lý (như cầu thận khơng bị teo, khơng có tượng đường viền bàn chải, co nhân hay hố khơng bào), khoảng 30% có viêm mơ kẽ thận nhẹ Ở lơ tiêm cisplatin 15 mg/kg sau 10 ngày có kết mơ bệnh học thận gần nằm giới hạn bình thường (Bảng 4) Bảng Kết khảo sát mô học thận mơ hình gây tổn thương thận cấp cisplatin liều 15 mg/kg chuột nhắt trắng Tình trạng Chứng sinh lý Mất bờ chân trải Nhân co lại Có khơng bào Cầu thận teo nhỏ Viêm mơ kẽ thận Thận giới hạn bình thường 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 256 Cisplatin 15 mg/kg Ngày Sau 10 ngày 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 2/3 3/3 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Tổng hợp kết khảo sát thời gian phân suất tử vong, đánh giá tiêu sinh hóa: Nồng độ creatinin, BUN huyết tương, MDA dịch đồng thể thận, đánh giá mô bệnh học thận; đề tài chọn liều cisplatin 15 mg/kg để gây mơ hình tổn thương thận cấp chuột cho thử nghiệm sàng lọc thuốc dược liệu Quercetin, flavonoid phổ biến nhiều thực vật với hoạt tính sinh học đa dạng chọn làm hợp chất kiểm tra đáp ứng mơ hình Kết Bảng cho thấy nồng độ creatinin huyết tương lô chứng bệnh lý tiêm cisplatin tăng 165,63%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,001), chứng tỏ có suy giảm chức Số 10 - 2020 thận chuột gây cisplatin Lô chuột cho uống quercetin liều 30 mg/kg ngày tiêm cisplatin vào ngày có nồng độ creatinin giảm (56,47%) đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p < 0,001) chưa phục hồi giá trị sinh lý bình thường (p = 0,06 so với lô chứng sinh lý) Tương tự, lô chuột uống quercetin liều 50 mg/kg ngày tiêm cisplatin vào ngày có nồng độ creatinin giảm (61,18 %), đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p < 0,001) phục hồi giá trị sinh lý bình thường (p = 0,128 so với lô chứng sinh lý) Không ghi nhận có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,094) liều quercetin Bảng Kết khảo sát tác dụng quercetin nồng độ creatinin huyết tương chuột nhắt trắng bị gây tổn thương thận cấp cisplatin liều 15 mg/kg Nhóm Cisplatin (-) Lô thử nghiệm (n=8) Chứng sinh lý Quercetin Nồng độ creatinin huyết tương (mg/dl) 0,64 ± 0,03 0,70 ± 0,02 0,59 ± 0,03 1,70 ± 0,05*** 0,74 ± 0,03**### 0,66 ± 0,03### Liều (mg/kg) 30 50 Chứng bệnh lý Cisplatin (+) Quercetin 30 50 (+): nhóm tiêm cisplatin;***: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng sinh lý (p< 0,001); **: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p< 0,01); ###: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chứng bệnh lý (p