Nghiên cứu công thức bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ hoặc phối hợp dược liệu để phòng và điều trị candida

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÙI NGUYỄN NHƯ QUỲNH NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC BÀO CHẾ HỖN DỊCH NYSTATIN RIÊNG RẼ HOẶC PHỐI HỢP DƯỢC LIỆU ĐỂ PHỊNG VÀ ĐIỀU TRỊ CANDIDA Ngành: Cơng nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 872.02.02 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Đinh Nga PGS TS Trần Anh Vũ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Bùi Nguyễn Như Quỳnh i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến cô PGS TS Nguyễn Đinh Nga PGS TS Trần Anh Vũ nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt để em hoàn thành tốt luận văn Đồng thời, em xin cảm ơn quý thầy cô Hội đồng Bào chế - Cơng nghiệp dược nhận xét góp ý để em hoàn thiện đề tài Luận văn hoàn thành với đồng thuận hỗ trợ lớn từ đơn vị phịng thí nghiệm Bộ mơn Bào chế, Bộ mơn Vi sinh - kí sinh khoa Dược Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, phịng thí nghiệm khoa Dược – Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Cuối cùng, giúp đỡ mặt chuyên môn mặt tinh thần anh chị bạn đồng nghiệp, bạn sinh viên phần thiếu đề tài Xin dành lời cảm ơn đặc biệt đến ThS DS Hà Đức Cường, Phó tổng giám đốc Công Ty cổ phần Dược phẩm OPC cung cấp nguyên liệu cho đề tài, TS Trương Quốc Kỳ, BS CKI Lê Thị Diễm Phương, ThS Nguyễn Ngọc Vân Thanh, ThS Nguyễn Hữu Phúc giúp em hoàn thành đề tài Bùi Nguyễn Như Quỳnh Luận văn Thạc sĩ Dược học Khóa 2017 – 2019 NGHIÊN CỨU CƠNG THỨC BÀO CHẾ HỖN DỊCH NYSTATIN RIÊNG RẼ HOẶC PHỐI HỢP DƯỢC LIỆU ĐỂ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ CANDIDA Bùi Nguyễn Như Quỳnh Thầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đinh Nga, PGS.TS Trần Anh Vũ Mở đầu Nystatin thuốc điều trị đầu tay bệnh Candida Tuy nhiên, chế phẩm dạng hỗn dịch chưa phổ biến thị trường Việt Nam đặt nhu cầu nghiên cứu phát triển để phục vụ điều trị Mục tiêu đề tài nhằm xây dựng quy trình bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ phối hợp dược liệu có hiệu để phịng điều trị Candida Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: nystatin, tinh dầu có tính kháng vi sinh vật, chủng vi sinh vật phân lập từ bệnh nhân ung thư Phương pháp nghiên cứu: Các chủng nấm Candida miệng phân lập từ bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị đánh giá mức độ nhạy cảm với nystatin đơn lẻ phối hợp tinh dầu Sau đó, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng cơng thức, quy trình bào chế, quy trình định lượng tiêu chuẩn sở hỗn dịch nystatin Hỗn dịch hoàn thiện thử sơ bệnh nhân ung thư bệnh viện Ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh Kết Phân lập 46 chủng vi nấm (Candida albicans Candida non-albicans ) từ bệnh phẩm, tất chủng nhạy với nystatin Các phối hợp nystatin với tinh dầu cho tác động cộng hợp riêng rẽ chủng Candida, hàm lượng khơng thích hợp phối hợp bào chế Đã xây dựng cơng thức quy trình bào chế hỗn dịch nystatin đơn đạt tiêu chuẩn sở Quy trình định lượng nystatin chế phẩm phương pháp HPLC xây dựng thẩm định đạt yêu cầu ICH Hỗn dịch nystatin cho tác dụng sinh học in vitro chủng phân lập tương đương chủng đối chiếu, khả diệt nấm tốt thời gian tiếp xúc ngắn Thử nghiệm sơ người tình nguyện cho thấy tiềm việc điều trị nấm Candida miệng, hiệu điều trị nấm tốt không gây khó chịu q trình sử dụng Kết luận Đã nghiên cứu bào chế xây dựng quy trình bào chế hỗn dịch nystatin bước đầu cho thấy tiềm việc điều trị nấm Candida bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị STUDY ON NYSTATIN ORAL SUSPENSION AND NYSTATINMEDICINAL HERBS COMBINATION FORMULATION IN PREVENTION AND TREATMENT OF ORAL CANDIDIASIS Bui Nguyen Nhu Quynh Graduate thesis - Master degree in pharmacy Academic year 2017-2019 Supervivor: Assoc Prof Nguyen Dinh Nga, PhD - Assoc Prof Tran Anh Vu, PhD Introduction Nystatin is one of the first choices in treatment of oral candidiasis However, nystatin oral suspension is not available on Vietnam’s market Thus, the need for research and development of this pharmaceutical form is urgent This study is conducted to establish the preparation protocol for nystatin oral suspension and nystatin combination suspension in prevention and treatment of oral candidiasis Subject and method Subject: nystatin, essential oils, microorganism isolated from cancer patients Method: Candida species were isolated from patients with head and neck cancer after radiotherapy, then were tested for susceptibility against nystatin and nystatin combined with essential oils Next, we developed nystatin suspension formulation, preparation protocol, quantification and standards for the suspension The final product was preliminarily tested on voluntary cancer patients at Oncology Hospital Ho Chi Minh city to obtain the effectiveness and medication adherence Results All 46 Candida species including Candida albicans and non-albicans from clinical samples were susceptible to nystatin Nystatin-essential oils combinations showed additive or indifferent effects on isolates, but the concentration was infeasible to combine in products Nystatin oral suspension formulation and the protocol for the suspension were developed meeting the standard The quantification protocol using HPLC method was established and validated based on ICH guidline Nystatin oral suspension has the same in vitro activity on the isolated species and control species This suspension also shows fungicidal effect after a short time of exposure The preliminary trial on voluntary patients has potential effectiveness and tolerance in treatment of oral candidiasis Conclusion Nystatin oral suspension and its preparation protocol were developed with potential effects in treatment of oral candidiasis in patients with head and neck cancer after radiotherapy i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh nấm Candida miệng bệnh nhân ung thư .3 1.2 Nguyên liệu 1.2.1 Nystatin .3 1.2.2 Một số tinh dầu có tác động kháng nấm 1.3 Tổng quan dạng bào chế hỗn dịch .8 1.3.1 Tổng quan dạng bào chế .8 1.3.2 Một số tá dược dùng nghiên cứu .9 1.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn xác định tỉ lệ phối hợp hoạt chất 11 1.4.1 Phương pháp pha loãng 11 1.4.2 Phương pháp khuếch tán 12 1.4.3 Xác định tỉ lệ phối hợp thuốc phương pháp bàn cờ .12 1.5 Phương pháp định danh Candida spp .13 1.5.1 Phương pháp truyền thống 13 i 1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Các nguyên liệu, hoá chất .16 2.1.2 Thiết bị 17 2.1.3 Chủng vi sinh vật thử nghiệm 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Thăm dị mức độ nhạy cảm hoạt tính số chất kháng nấm dạng đơn lẻ hay phối hợp 19 2.2.2 Xây dựng công thức, quy trình bào chế tiêu chuẩn sở cho chế phẩm hỗn dịch nystatin .24 2.2.3 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm 36 Chương KẾT QUẢ nghiên cứu 39 3.1 Thăm dị mức độ nhạy cảm hoạt tính số chất kháng nấm dạng đơn lẻ hay phối hợp 39 3.1.1 Phân lập, đánh giá mức độ nhạy cảm vi nấm Candida miệng bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị với nystatin số thuốc kháng nấm .39 3.1.2 Khảo sát hoạt tính hiệu phối hợp nystatin tinh dầu 42 3.2 Xây dựng cơng thức, quy trình bào chế tiêu chuẩn sở cho chế phẩm hỗn dịch nystatin 44 3.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng nystatin 44 3.2.2 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế hỗn dịch nystatin 58 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm 66 3.2.4 Theo dõi độ ổn định chế phẩm 67 ii 3.3 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm .71 3.3.1 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro 71 3.3.2 Sơ đánh giá tác dụng chế phẩm bệnh nhân nhiễm nấm Candida miệng 74 Chương Bàn luận 76 4.1 Thăm dò mức độ nhạy cảm hoạt tính số chất kháng nấm dạng đơn lẻ hay phối hợp 76 4.1.1 Phân lập, đánh giá mức độ nhạy cảm vi nấm Candida miệng bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị với nystatin số thuốc kháng nấm 76 4.1.2 Khảo sát hoạt tính hiệu phối hợp nystatin tinh dầu 76 4.2 Xây dựng cơng thức, quy trình bào chế tiêu chuẩn sở cho chế phẩm hỗn dịch nystatin 77 4.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng nystatin 77 4.2.2 Xây dựng công thức quy trình bào chế hỗn dịch nystatin 78 4.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm 79 4.2.4 Theo dõi độ ổn định chế phẩm 80 4.3 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm .80 4.3.1 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro 80 4.3.2 Sơ đánh giá tác dụng lâm sàng chế phẩm bệnh nhân nhiễm nấm Candida miệng 81 Kết luận kiến nghị 82 Thăm dị mức độ nhạy cảm hoạt tính số chất kháng nấm dạng đơn lẻ hay phối hợp 82 Xây dựng công thức phương pháp bào chế hỗn dịch nystatin 82 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm 83 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL-1 PHỤ LỤC 1: Công thức môi trường PL-1 PHỤ LỤC 2: Hình ảnh phân lập mẫu Candida từ bệnh nhân PL-3 PHỤ LỤC 3: Đường kính vùng kháng nấm chủng phân lập .PL-5 PHỤ LỤC 4: Số liệu thẩm định nystatin phương pháp sinh học .PL-7 PHỤ LỤC 5: Số liệu thẩm định nystatin HPLC PL-14 PHỤ LỤC 6: Phân bố kích thước hạt PL-23 PHỤ LỤC 7: Phiếu kiểm nghiệm nguyên liệu nystatin PL-26 PHỤ LỤC 8: Chứng phân tích chất đối chiếu nystatin .PL-27 PHỤ LỤC 9: Chấp thuận hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh PL-28 PHỤ LỤC 10: Chấp thuận bệnh viện Ung Bướu TPHCM thực đề tài nghiên cứu bệnh viện PL-29 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AMB Amphotericin B bs bổ sung C albicans Candida albicans CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khóm CLSI Viện tiêu chuẩn phịng thí nghiệm lâm sàng CLZ Clotrimazol DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxid FIC Fractional Inhibitory Concentration FLC Fluconazol HNT Hương nhu trắng HPLC High Performance Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng hiệu cao MeOH Methanol MHA Mueller Hinton Agar MIC Minimum Inhibitory Concentration – Nồng độ tối thiểu ức chế MIZ Miconazol MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NYS Nystatin PDA Photodiode Array – Dãy diod quang SDA Sabouraud Dextrose Agar SMIC Sessile Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ tối thiểu ức chế dạng biofilm TTO Tràm trà Úc VKN Viện Kiểm Nghiệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-19 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-21 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-22 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-23 PHỤ LỤC 6: Phân bố kích thước hạt Bảng PL-0.16 Phân bố kích thước tiểu phân sau đồng hố phút Size (µm) %V Size (µm) %V Size (µm) %V 0,0995 2,42 58,9 0,113 2,75 66,9 0,22 0,128 3,12 76 0,84 0,146 3,55 86,4 1,94 0,166 4,03 98,1 3,52 0,188 4,58 111 5,43 0,214 5,21 127 7,45 0,243 5,92 144 9,32 0,276 6,72 163 10,75 0,314 7,64 186 11,53 0,357 8,68 211 11,55 0,405 9,86 240 10,8 0,461 11,2 272 9,40 0,523 12,7 310 7,51 0,594 14,5 352 5,38 0,675 16,4 400 3,25 0,767 18,7 454 1,12 0,872 21,2 516 0,991 24,1 586 1,13 27,4 666 1,28 31,1 756 1,45 35,3 859 1,65 40,1 976 1,88 45,6 2,13 51,8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-24 Bảng PL-0.17 Phân bố kích thước tiểu phân sau đồng hố 10 phút Size (µm) %V Size (µm) %V Size (µm) %V 0,0995 2,42 58,9 2,96 0,113 2,75 66,9 3,84 0,128 3,12 76 4,77 0,146 3,55 86,4 5,71 0,166 4,03 98,1 6,67 0,188 4,58 111 7,6 0,214 5,21 127 8,46 0,243 5,92 144 9,15 0,276 6,72 163 9,53 0,314 7,64 186 9,42 0,357 8,68 211 8,69 0,405 9,86 240 7,4 0,461 11,2 272 5,48 0,523 12,7 310 3,47 0,594 14,5 352 1,47 0,675 16,4 400 0,01 0,767 18,7 454 0,872 21,2 516 0,991 24,1 586 1,13 27,4 666 1,28 31,1 0,25 756 1,45 35,3 0,52 859 1,65 40,1 0,96 976 1,88 45,6 1,48 2,13 51,8 2,17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-25 Bảng PL-0.18 Phân bố kích thước tiểu phân sau đồng hố 15 phút Size (µm) %V Size (µm) %V Size (µm) %V 0,0995 2,42 58,9 3,21 0,113 2,75 66,9 4,95 0,128 3,12 76 6,9 0,146 3,55 86,4 8,85 0,166 4,03 98,1 10,49 0,188 4,58 111 11,57 0,214 5,21 127 11,86 0,243 5,92 144 11,28 0,276 6,72 163 9,88 0,314 7,64 186 7,88 0,357 8,68 211 5,61 0,405 9,86 240 3,33 0,461 11,2 272 1,06 0,523 12,7 310 0,594 14,5 352 0,675 16,4 400 0,767 18,7 454 0,872 21,2 516 0,991 24,1 586 1,13 27,4 666 1,28 31,1 756 1,45 35,3 0,06 859 1,65 40,1 0,32 976 1,88 45,6 0,89 2,13 51,8 1,84 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-26 PHỤ LỤC 7: Phiếu kiểm nghiệm nguyên liệu nystatin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-27 PHỤ LỤC 8: Chứng phân tích chất đối chiếu nystatin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-28 PHỤ LỤC 9: Chấp thuận hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-29 PHỤ LỤC 10: Chấp thuận bệnh viện Ung Bướu TPHCM thực đề tài nghiên cứu bệnh viện Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... Nguyễn Như Quỳnh Luận văn Thạc sĩ Dược học Khóa 2017 – 2019 NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC BÀO CHẾ HỖN DỊCH NYSTATIN RIÊNG RẼ HOẶC PHỐI HỢP DƯỢC LIỆU ĐỂ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ CANDIDA Bùi Nguyễn Như Quỳnh Thầy... bệnh nhân ung thư vùng đầu cổ sau xạ trị Mục tiêu tổng quát Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ phối hợp dược liệu có hiệu để phòng điều trị Candida Mục tiêu cụ thể - Thăm dị mức... đề tài nhằm xây dựng quy trình bào chế hỗn dịch nystatin riêng rẽ phối hợp dược liệu có hiệu để phịng điều trị Candida Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: nystatin, tinh dầu có tính kháng