Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu mạch môn radix ophiopogonis japonici

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LÊ NGUYỄN PHÚC HIỀN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LÊ NGUYỄN PHÚC HIỀN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Lê Nguyễn Phúc Hiền TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền; Mã: 8720206 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy Đặt vấn đề Rễ củ Mạch môn (Radix Ophiopogonis japonicus) sử dụng lâu đời thuốc y học cổ truyền Trung Quốc Việt Nam Hiện nay, khó để phân biệt xác định Mạch mơn với chi khác thị trường chúng có đặc điểm hình thái giống Đề tài thực nghiên cứu thành phần hóa học đề xuất quy trình định lượng acid ursolic rễ củ Mạch mơn, bước đầu góp phần xác định kiểm sốt chất lượng nguồn nguyên liệu, bán thành phẩm thị trường, đồng thời làm tiền đề cho nghiên cứu thử hoạt tính sinh học Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu: Rễ củ Mạch môn thu mua cửa hàng khác quận 5, TPHCM Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, phương pháp sắc ký để phân lập chất Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS NMR Xây dựng quy trình định lượng: Khảo sát điều kiện UPLC, khảo sát điều kiện xử lý chuẩn bị mẫu, đề xuất quy trình thẩm định Kết Thành phần hóa học rễ củ Mạch mơn có diện nhóm hợp chất saponin, triterpenoid, polyuronic, flavonoid, anthranoid, acid hữu kg bột rễ củ Mạch môn chiết ngấm kiệt với EtOH 96% thu 450 g cao chiết đậm đặc Tiến hành lắc phân bố lỏng - lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần thu 32 g cao cloroform g cao ethyl acetat Tiến hành chiết lỏng – rắn cao cloroform thu được: 10,3 g n-hexan extract (OJH), 5,1 g cao n-hexan – cloroform (OJHC), 9,7 g cao cloroform (OJC), 2,4 g cao cloroform – ethyl acetat (OJCE), 1,6 g cao ethyl acetat (OJE) Bằng kỹ thuật sắc ký sắc ký cột cổ điển sắc ký điều chế, tiến hành phân lập cao phân đoạn: OJH, OJHC, OJC thu hợp chất xác định là: Acid ursolic (90,5 mg), chrysophanol (3 mg), β-sitosterolglucosid (6 mg), nolinospirosid – F (5,6 mg) Xây dựng quy trình định lượng acid ursolic rễ củ Mạch môn với điều kiện sắc ký sau: chương trình rửa giải gradient H2O (1 % acid formic) – ACN, tốc độ dịng 0,3 ml/phút, bước sóng định lượng 205 nm Kết thống kê cho thấy quy trình thẩm định có hệ số tương quan cao (R2 ≥ 0,995), độ lặp lại thể qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic (RSD = 3,2 < 5,3%), độ thể qua tỉ lệ hồi phục nằm khoảng 94,1 – 100,2 % Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) là: 0,2 ppm, 0,68 ppm Hàm lượng acid ursolic mẫu rễ củ Mạch môn thay đổi đáng kể địa điểm thu mua, mẫu Mạch mơn có kích thước củ to, trịn, màu vàng sẫm, vị cho kết định lượng hàm lượng acid ursolic trung bình 0,034 % Kết luận Đề tài phân lập hợp chất từ cao phân đoạn OJH, OJHC, OJC xác định cấu trúc hợp chất phương pháp phổ học Từ kết xây dựng quy trình định lượng bước đầu gợi ý lựa chọn nguồn nguyên liệu rễ củ Mạch mơn có hàm lượng acid ursolic ≥ 0,03 % làm nguồn nguyên liệu đạt chất lượng để sử dụng làm thuốc thuốc y học cổ truyền sản xuất chế phẩm có tác dụng sinh học ABSTRACT Thesis of Master of Pharmacy – Course: 2017 – 2019 Major: Traditional Pharmacy; Code: 8720206 DEVELOPMENT MEDICINAL PLANT STANDARDS OF RADIX OPHIOPOGONIS JAPONICI Student: Le Nguyen Phuc Hien Instructor: PhD Assoc Prof Huynh Ngoc Thuy Introduction Ophiopogon japonicus root is widely known as a traditional medicine and also a longstanding functional food ingredient in China and Vietnam to cure many diseases, but it is difficult to distinguish between Ophiopogon species in the herbal market because of their similar morphological characteristics The purpose of this study is to investigate the chemical composition and quantification of ursolic acid in Ophiopogon japonicus by UPLC/PDA method This method can be used for quality control of raw materials, semi-finished products and finished products containing it on the main herb market The results are the first step to further studies of the biological effects of plants Material and method Raw material: Ophiopogon japonicus root is collected from various shops in the herb market in Ho Chi Minh City Methods: Liquid-liquid and liquid-solid distribution and various chromatographic techniques are used for extraction and isolation The structure of isolates was determined by MS and NMR spectroscopy Quantitative method using UPLC/PDA system is surveyed step by step, surveying UPLC conditions, testing plant materials and preparing samples, proposing validation procedures for developed methods… Results Chemical composition analysis revealed the presence of saponins, triterpenoids, flavonoids, anthranoite and oganic acid kg of dry root powder is percolate with 96% ethanol to obtain 450 g of concentrated extract, then a liquid-liquid distribution to obtain 32 g of chloroform and g of ethyl acetate extraction Liquid-solid distribution of chloroform to obtain 10,3 g of n-hexane extract (OJH), 5.1 g of n-hexane-chloroform extract (OJHC), 9.7 g of chloroform extract (OJC), 2.4 g of chloroform-ethyl acetate extract (OJCE), 1.6 g of ethyl acetate extract (OJE) Three fractions OJH, OJHC, OJC were further separated and elucidated compounds were obtained: ursolic acid (90.5 mg), chrysophanol (3 mg), β-sitosterolglucoside (6 mg), nolinospiroside - F (5,6 mg) Development of a method for the quantitative ursolic acid in Ophiopogon japonicus by UPLC/PDA to investigate chromatographic conditions: gradient elution with 0.1% acetonitril and formic acid, flow rate 0.3 ml/min, column temperature 30 ºC with a wavelength of 205 nm Acceptable linearity (R2 ≥ 0.995) and recovery (about 94.1 - 100.2%) Detection limit (LOD) and quantitative limit (LOQ): 0.2 ppm; 0.68 ppm, respectively The results showed that the ursolic acid content was different among samples, the average ursolic content in the samples was 0.034% Conclusion In this study, compounds were isolated from OJH, OJHC, OJC extract and structures were determined by spectrometry methods The quantitive method can be used for the analysis of the root of Ophiopogon japonicus in herb market Results showed that the mean percentage contents of ursolic acid must be greater than or equal to 0.03 % MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Đặc điểm chung họ Thiên môn (Asparagaceae) 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl .2 1.1.3 Phân biệt chi có đặc điểm tương đồng 1.1.4 Các tên gọi đồng danh loài Ophiopogon japonicus 1.1.5 Vị trí phân loại .4 1.1.6 Đặc điểm Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.) 1.2 TỔNG QUAN HÓA HỌC 1.2.1 Saponin steroid 1.2.2 Homoisoflavonoid .9 1.2.3 Triterpenoid 10 1.2.4 Anthranoid 10 1.2.5 Polysaccharid 11 1.2.6 Glycosid .11 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 11 1.3.1 Theo y học cổ truyền 11 1.3.2 Theo y học đại 11 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM MẠCH MÔN 16 1.4.1 Các nghiên cứu nước 16 1.4.2 Các nghiên cứu nước 16 1.4.3 Kiểm nghiệm dược liệu Mạch môn theo tiêu chuẩn DĐVN V [2] 17 1.5 TỔNG QUAN VỀ ACID URSOLIC 20 1.5.1 Đặc tính lý hóa 20 1.5.2 Tác dụng 20 1.5.2.1 Chống ung thư .21 1.5.2.2 Phịng ngừa béo phì/đái tháo đường .21 1.5.2.3 Bảo vệ tim 22 1.5.2.4 Bảo vệ tế bào thần kinh 23 1.5.2.5 Bảo vệ gan 23 1.5.2.6 Phòng ngừa bệnh thiểu tăng khả vận động 23 1.5.3 Các phương pháp định lượng acid ursolic dược liệu .23 1.6 CÔNG DỤNG, LIỀU DÙNG 25 1.7 CÁC BÀI THUỐC DÂN GIAN 25 1.8 MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA MẠCH MÔN .26 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Dung môi, hóa chất 29 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị 30 2.1.4 Nơi thực đề tài 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Kiểm tra nguyên liệu 31 2.2.1.1 Khảo sát nguyên liệu .31 2.2.1.2 Thử tinh khiết 32 2.2.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 32 2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học rễ củ Mạch mơn 32 2.2.3.1 Tiêu chí lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 32 2.2.3.2 Chiết xuất cao dược liệu phương pháp ngấm kiệt 33 2.2.3.3 Phân tách phân đoạn cao toàn phần .33 2.2.3.4 Tinh chế chất phân lập 35 2.2.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập .35 2.2.3.6 Xác định cấu trúc 35 2.2.4 Xây dựng quy trình định lượng 35 2.2.4.1 Xây dựng phương pháp định lượng chất 35 2.2.4.2 Thẩm định quy trình định lượng 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 3.1 KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU 40 3.1.1 Khảo sát nguyên liệu 41 3.1.1.1 Đặc điểm vi phẫu rễ củ 41 3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 42 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 44 3.1.2.1 Xác định độ ẩm 44 3.1.2.2 Xác định độ tro 44 3.1.2.3 Xác định hàm lượng chất chiết 44 3.2 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 45 3.3 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÁCH CAO CHIẾT TOÀN PHẦN 46 3.3.1 Chiết xuất 46 3.3.2 Phân tách cao chiết toàn phần 46 3.4 PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CAO PHÂN ĐOẠN .48 3.4.1 Phân lập chất tinh khiết từ cao OJHC 48 3.4.1.1 Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-1 49 3.4.1.2 Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-4 50 3.4.1.3 Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-16 50 3.4.2 Phân lập chất tinh khiết từ cao OJH 51 3.4.2.1 Tinh chế tủa từ phân đoạn OJH-8 53 3.4.3 Phân lập chất tinh khiết từ cao OJC 54 3.4.3.1 Tinh chế tủa từ phân đoạn OJC-21 .56 3.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 58 3.5.1 Xác định cấu trúc chất OJ-1 58 3.5.2 Xác định cấu trúc chất OJ-2 60 3.5.3 Xác định cấu trúc chất OJ-3 63 3.5.4 Xác định cấu trúc chất OJ-5 65 3.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID URSOLIC TRONG RỄ CỦ MẠCH MÔN 69 3.6.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 69 3.6.2 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 72 3.6.3 Đề xuất phương pháp định lượng 76 3.6.4 Đề xuất quy trình thẩm định 77 3.6.5 Ứng dụng quy trình định lượng 81 3.7 ĐỀ NGHỊ TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN (Radix ophiopogonis japonici) .82 3.8 BÀN LUẬN 86 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 4.1 KẾT LUẬN 91 4.2 KIẾN NGHỊ .92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC 107 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-1 PL-1 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-2 PL-19 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-3 PL-38 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-5 PL-38 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ UPLC – KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ PL-71 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ UPLC – THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PL-78 PHỤ LỤC CHẤT CHUẨN PL-78 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt chi Ophiopogon Liriope Bảng 1.3 Vị trí phân loại lồi Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl Bảng 1.4 Một số saponin steroid phân lập từ loài O.japonicus Bảng 1.5 Danh sách 15 dẫn xuất homoisoflavonoid Bảng 1.6 Công thức cấu tạo 15 chất homoisoflavonoid 10 Bảng 1.7 Thành phần cấu tạo polysaccharid 11 Bảng 1.10 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư saponin steroid .13 Bảng 1.11 Hoạt tính ức chế NO homoisoflavonoid 15 Bảng 1.8 Tác dụng acid ursolic ức chế tế bào ung thư 21 Bảng 1.9 Tác dụng acid ursolic điều trị bệnh tim mạch 22 Bảng 2.12 Đánh giá độ xác theo nồng độ chất phân tích .38 Bảng 2.13 Mối liên quan tỷ lệ phục hồi nồng độ chất phân tích 39 Bảng 3.14 Kết thử tinh khiết mẫu dược liệu nghiên cứu .44 Bảng 3.15 So sánh độ tinh khiết mẫu nghiên cứu với tiêu chí chuyên luận Mạch môn DĐVN V .45 Bảng 3.16 Kết phần tích sơ thành phần hóa thực vật rễ củ Mạch mơn .45 Bảng 3.17 Khối lượng phân đoạn cao thu từ cao CHCl3 46 Bảng 3.18 Khối lượng phân đoạn phân tách từ phân đoạn OJH-8 53 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR HMBC OJ-1 59 Bảng 3.20 Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR HMBC OJ-2 61 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR OJ-3 64 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR HMBC OJ-5 66 Bảng 3.23 Chương trình rửa giải gradient lựa chọn 70 Bảng 3.25 Kết khảo sát phương pháp chiết (n=3) 74 Bảng 3.26 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử (n = 6) 77 Bảng 3.27 Tương quan nồng độ diện tích pic acid ursolic 79 Bảng 3.28 Kết khảo sát độ lặp lại (n=6) 80 Bảng 3.29 Kết khảo sát tỷ lệ hồi phục (n=9) .81 Bảng 3.30 Kết định lượng acid ursolic số mẫu thu thập 81 Bảng 3.31 So sánh liều có tác dụng sinh học nhóm hợp chất 87 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ UPLC – KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Phụ lục 5.76 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (55:50) - cột Phenomenex (150 x 2,0, µm) Phụ lục 5.77 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (55:45) - cột Acquity (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.78 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), nhiệt độ cột 25 0C Phụ lục 5.79 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (60:40) - cột Acquity (50 x 2,1 mm, 1,7u) Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.80 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), Flow = 0,27 ml/phút Phụ lục 5.81 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), Flow = 0,3 ml/phút Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.82 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), Flow = 0,32 ml/phút Phụ lục 5.83 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), Flow = 0,35 ml/phút Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.80 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), nhiệt độ cột 25 0C Phụ lục 5.81 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), nhiệt độ cột 30 0C Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.82 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), nhiệt độ cột 35 0C Phụ lục 5.83 SKĐ với hệ dung môi ACN - H2O (45:55), nhiệt độ cột 40 0C Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 5.84 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký chọn (độ tinh khiết peak 98,5 %) Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ UPLC – THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Phụ lục 6.85 Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống Phụ lục 6.86 Sắc ký đồ độ đặc hiệu Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục Phụ lục 6.87 Sắc ký đồ tính tuyến tính Phụ lục 6.88 Sắc ký đồ độ lặp lại Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 6.89 Sắc ký đồ độ (thêm chuẩn 80 %) Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 6.90 Sắc ký đồ độ (thêm chuẩn 100 %) Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 6.91 Sắc ký đồ độ (thêm chuẩn 120 %) Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC CHẤT CHUẨN Certificate of Analysis 熊果酸 Ursolic acid CAS Number:77-52-1 批号(Batch No.):DST191102-019 分子式(M F.): C30H48O3 分子量(M W.):456.70 贮存条件(Storage): 2~8℃ 检验项目(Test Item) 检验指标(Specification) 检验结果 (Results) 性状 Appearance Off-white powder Off-white powder 纯度 Purity (HPLC) ≥98.0% 98.94% 核磁 NMR Comply with the structure Conforms 生产日期 (Date of production) 2020-11-02 有效期 (Retest date） Three years 备注(Note) The product is only used for scientific research experiments and should not be used for human injection, food or other purposes This solution must be freshly prepared before using to avoid degradation of the purity of the product and affect the experimental results QC: SpecialSeal: QA: Tel：028-85003950 Fax：028-85589956 http://www.028desite.com Add：四川成都温江区海科路西段 128 号 Phụ lục 7.92 Độ tinh khiết acid ursolic Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 附件 1：HPLC 附件 2：核磁 NMR Phụ lục 7.93 Sắc ký đồ acid ursolic Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 7.94 Phổ NMR acid ursolic Phụ lục ... ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LÊ NGUYỄN PHÚC HIỀN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số:... Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền; Mã: 8720206 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Học viên: Lê Nguyễn... hành thực đề tài: ? ?Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Mạch môn – Radix Ophiopogonis japonici (L.f) Ker – GawL.” Đề tài thực với mục tiêu sau: Mục tiêu tổng quát: Kiểm tra nguyên liệu Khảo sát thành