xây dựng tiêu chuẩn dược liệu cây rau má

đây là mẫu báo cáo về rau má, từ tài liệu này bạn có thể cop nhặt để làm bài báo cáo dễ dàng, hiệu quả hơn.Bài này đã được qua chỉnh sữa và chắc lọc cặn kẻ. Hi vọng bạn có thể thực hiện tốt nhờ những tài liệu tôi chia sẽ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y – DƯỢC ĐÀ NẴNG KHOA DƯỢC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ (Herba Centella asiatica) GVHD : ThS.DS Nguyễn Thị Thương Nhóm thực hiện: Tổ - Lớp ĐH Dược 03B Đà Nẵng, tháng năm 2019 Danh sách nhóm – ĐH Dược 3B Nguyễn Thị Phương Anh Thái Thị Phương Ánh Thái Thanh Bình Trần Quốc Cường Nguyễn Thị Diễm Nguyễn Thị Thùy Dung Đặng Hoàn Dũng Nguyễn Ngọc Duy Võ Thu Hà 10 Nguyễn Gia Hân 11 Nguyễn Thị Hằng 12 Phan Xuân Hiến 13 Lê Minh Hiền 14 Huỳnh Thị Ngọc Hoa 15 Lê Thị Hưng 16 Đặng Thị Hương 17 Đặng Thị Thùy Linh 18 Lê Anh Phương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Vai trò thuốc sống người chứng minh hàng ngàn năm qua Từ xa xưa người biết sử dụng loài động thực vật làm thuốc chữa bệnh Ngày thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng chiếm lòng tin người tiêu dùng Nước ta có lợi nguồn tài nguyên thiên nhiên, nguồn động thực vật làm thuốc vơ phong phú, đề tài nghiên cứu hấp dẫn nhà khoa học nước Cây rau má thuốc phổ biến, dễ trồng, rẻ tiền mà lại mang lại hiệu kinh tế cao Rau má sinh trưởng tốt vùng khí hậu nhiệt đới Người dân hay dùng rau má loại thực phẩm ngày Các hoạt chất sinh học rau má tập trung chủ yếu nhóm saponin triterpenoid, có tác dụng sát trùng, giải độc, nhiệt, tái tạo mô liên kết giúp lên da non vết thương nhanh chóng, tác dụng chống oxy hóa làm chậm q trình lão hóa Ngồi giúp tăng cường trí nhớ, cải thiện vi tuần hồn chữa số bệnh da… Như rau má có ứng dụng rộng rãi lĩnh vực dược phẩm mỹ phẩm Ngày ngành công nghiệp dược phẩm phát triển nhanh chất lượng dược phẩm ngày quan tâm Chất lượng dược liệu yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu điều trị chế phẩm chiết xuất từ dược liệu Chất lượng dược liệu bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: giống, điều kiện ni trồng, mùa thu hái, quy trình sơ chế bảo quản… Hiện dược liệu chất lượng mua bán tràn lan như: dược liệu giả, dược liệu bị chiết kiệt hoạt chất… chế phẩm từ dược liệu chưa rõ nguồn gốc người dân truyền tay sử dụng Điều gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người bệnh, đồng thời gây lòng tin người dùng vào chế phẩm từ dược liệu không nhận thấy hiệu điều trị Vì xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu điều quan trọng để nâng cao hiệu điệu trị chế phẩm từ dược liệu Vì thực đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rau má” Đề tài thực với ba mục tiêu sau: - Quan sát vi học để đề xuất đặc điểm nhận diện dược liệu rau má Chiết xuất phân tích sơ thành phần hóa học, đối chiếu với kết - công bố Tổng hợp tài liệu, đề xuất tiêu kiểm nghiệm dược liệu rau má CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ Đặc điểm thực vật chi Centella 1.1 Vị trí phân loại Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Thù Du (Cornidae) Bộ Ngũ Gia Bì (Araliales) Họ Hoa Tán (Apiaceae) Chi Centella Lồi Centella asiatica Urb [1] 1.2 Đặc điểm thực vật họ hoa tán (Apiaceae) chi Centella Họ hoa tán họ lớn hệ thực vật trái đất Các họ hoa tán thân thảo hay nhiều năm Thân thường có gióng mấu Lá mọc so le có bẹ lá, phiến chẻ thùy lơng chim hay nhiều lần, mọc cách, khơng có kèm, thường có mùi thơm Hoa nhỏ, cụm hoa tán đơn hay tán kép Hoa đều, lưỡng tính mẫu 5, đài 5, tràng 5, số rụng sớm Nhị xếp xen kẽ với cánh hoa Bộ nhụy noãn dính mặt trong, vòi tự với đầu nhụy phồng lên Đỉnh bầu có đĩa mật loe Quả bế thường có cánh dẹt hai mảnh ghép lại, chín tách thành bế dính đỉnh [1] Họ hoa tán với 400 chi, 3800 lồi Việt Nam có khoảng 20 chi 30 loài, phần lớn trồng để làm gia vị, hương liệu, lấy tinh dầu (Thìa là, Rau mùi, Cần Tây, Mùi tàu), làm thuốc [1] Theo APG II, họ hoa tán chia làm bốn phân họ: phân họ Apioideae với khoảng 400 chi, 3200 loài; phân họ Azorelloideae với khoảng 21 chi, 155 loài; phân họ Mackinlayoideae với 10 chi, 98 loài; phân họ Saniculoideae với 10 chi, 355 loài [6, 7] Chi Centella - Rau má thuộc phân họ Mackinlayoideae, gồm 20 loài Đặc điểm thực vật: cỏ, mọc bò, mọc so le, phiến hình thận, gân chân vịt, cụm hoa tán đơn, gồm 1-5 hoa Phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, Nam Phi Ôxtrâylia Ở nước ta có lồi Centella asiatica [1] Những nghiên cứu Rau Má 2.1 Danh pháp Tên khoa học: Centella asiatica Urb Tên tiếng Việt: Rau má Tên khác: Tinh tuyết thảo 2.2 Đặc điểm thực vật Rau má loại cỏ mọc bò, rễ mọc mấu thân Lá hình mắt chim, rộng cm đến cm, khía tai bèo, gân hình chân vịt, gốc hình tim Cuống dài cm đến cm nhánh mang hoa cm đến 12 cm nhánh thường Cụm hoa tán đơn gồm hoa nhỏ, mọc nách Quả rủ mọc đơi, dẹt, tròn, rộng mm đến mm, có cạnh dọc nhơ lên vân lưới nhỏ rõ rệt, cuống ngắn Dược liệu khô thường cuộn lại thành khối Rễ dài cm đến cm, đường kính mm đến 1,5 mm; mặt màu nâu vàng nhạt màu vàng xám Thân dài nhỏ, cong queo, màu vàng nâu, có vân nhăn dọc, mấu thường thấy rễ Phiến có nhiều vết nhăn rách, đường kính cm đến cm, màu lục xám, mép có thô Cuống dài cm đến cm, cong queo Mùi nhẹ, vị nhạt [2, 3, 4] Hình 1: Cây Rau má Centella asiatica Urb 2.3 Phân bố sinh thái Cây mọc hoang ruộng vườn, bãi cỏ… vùng nhiệt đới như: Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấn Độ, Pakistan… Ở nước ta, Rau má trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt tỉnh duyên hải miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm cao có loại đất sét pha cát thích hợp cho loại phát triển [4] 2.4 Bộ phận dùng Phần mặt đất [2,3,4] 2.5 Thành phần hóa học 2.5.1 Nghiên cứu nước Phần mặt đất Rau má có saponin triterpen vòng sapogenin chúng, chủ yếu thuộc nhóm ursan Một số thuộc nhóm olean lupan Ngồi ra, Rau má có flavonoid, tinh dầu, số hợp chất khác với hàm lượng thấp Saponin: Các hợp chất triterpenoid nhóm ursan xem hoạt chất Rau má Cho đến nay, 20 chất phân lập với phân nửa số saponoid Các saponin quan trọng Rau má asiaticosid madecassoid Hàm lượng asiaticosid thay đổi nhiều phụ thuộc vào nơi mọc, từ 1% đến 6,4% Một số saponin có cấu trúc ursan khác với hàm lượng thấp như: methyl asiatat, methyl brahmat, brahmol, acid madasiatic, acid isothankunic, acid 2α-3β20,23-tetrahydroxy-urs -28-oic, acid 2α-3β-23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic, asiaticosid B-F, centellasaponin B C, brahminosid, isothankunisid, arabinosid 3O-α-L [ 3] Các dẫn chất oleanan acid terminolic, acid 2α-3β-23-trihydroxy-olean-12en-28-oic, acid 3β-6β-23-trihydroxyolean-12-en-28-oic, centellasapogenol A, asiaticosid B, centellasaponin A,D dẫn chất lupan acid betulinic acid phân lập từ Rau má [3] Flavonoid: xác định có Rau má dạng tự gắn kết với gốc đường qua nhóm chức hydroxyl như: quercetin-3-O-β-Dglucuronid, kaempferol, quercetin, kaempferol-3-O-β-D-glucoside, quercetin-3-Oβ-D-glucoside [3] Tinh dầu: Một nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Rau má Kết thành phần hóa học tinh dầu má tìm thấy so sánh với nghiên cứu khác giới sau: [5] ST T Hợp chất Hàm lương % GC/MS Việt Malaysi Banglases Nam a h Apiol Biciclogermacren Oxid cariphilen 3,64 1,9 2,51 β-cariophilen 4,56 26,8 20,3 10 α-Copaen β-Elemen Micren β-Farnesen Germacren D α-Humulen Sri Lank a Himalay a Ấn Độ Nam Phi 4,49 3,3 12 23,3 15, 10, 11,22 0,27 19,8 14 4,28 0,4 56,09 Vết 10 33,7 4,71 0,85 4,45 6,02 23,9 1,58 6,55 6,3 5,4 23,1 4,6 6,29 11,3 21,06 Các nhóm hợp chất khác: Trong Rau má có carbohydrat (như mesoinositol, oligosaccharid centellose pectin S3A), alcaloid chưa xác định cấu trúc hydrocotylin (C23H33O8N) Ngoài có hợp chất polyacetylen (acetonxycentellymol), sterol, lipid, vitamin C, carotenoid [3] 2.5.2 Nghiên cứu nước Brinkhaus cộng tóm tắt cơng thức hóa học rau má trước năm 2000 [8] Shukla cộng tách triterpenoid khung ursane từ Rau má [9] Sau đó, Matsuda cộng phân lập olean-13ene triterpenoid mới, centellasapogenol A, oligoglycoside từ Rau má trồng Việt Nam [10] Từ dịch chiết n-BuOH Rau má, Jiang cộng tách triterpenoid glycoside asiaticoside C, D, E, F [11] Từ rau má Sirilanka, nhóm tác giả người Nhật (Hisashi Matsuda Trường đại học Dược Kyoto-Nhật Bản) phân lập triterpene glycoside là: centellasaponin A, centellasaponin B, centellasaponin C, centellasaponin D, madecassoside, asiaticoside, asiaticoside B sceffoleoside [12] Wan-Joo-Kim cộng - Trường đại học Seoun, Hàn Quốc phân lập triterpenoid từ rau má Indonesia là: madecassoside, asiaticoside, asiatic acid madecassic acid, với hàm lượng cao [13] Yu Q.L cộng phân lập hợp chất acid 2α-3β20,23-tetrahydroxy-urs-28-oic.[14] Năm 2007, nhóm phân lập docosyl ferulat, bayogenin, 3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid , 3β,6β,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid, D-gulonic acid Đây chất lần tìm thấy rau má [15] Theo nghiên cứu O A Oydefi A J Afolayan năm 2005 hàm lượng tinh dầu rau má xấp xỉ 0,1% tính theo khối lượng khơ Thành phần monoterpene gồm: α-pinene, β-pinene, micrene, γ- terpinene, borneol, sesquiterpene gồm: α-copaene, β- elemene, β-caryophyllene, trans-β-farnesene, germacrene bicycloelemene [16] 2.6 Tác dụng dược lý 2.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dùng phần mặt đất Rau má thu hái phường Điện Nam Trung, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Cây Rau má cắt nhỏ phơi sấy khơ, đóng gói bảo quản để tiến hành thí nghiệm Hóa chất - Thuốc thử - Dung mơi - Phương tiện nghiên cứu Thuốc thử, dung mơi, hóa chất đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V Phương tiện nghiên cứu: Kính hiển vi Leica, cân phân tích Ohaus PA213, tủ sấy, máy xay dược liệu, tủ hút, bếp cách thủy, đèn soi UV bước sóng, lò nung Phương pháp nghiên cứu 3.1 Đặc điểm thực vật Phân tích hình thái thực vật, vi phẫu Nghiên cứu đặc điểm vi học dựa theo dược liệu 3.1.1 Vi phẫu a Chọn mẫu: Thường mẫu tươi mẫu ngâm cồn 70 độ Đối với mẫu vật hình dạng phải ngun vẹn, chọn khơng già không non (lá bánh tẻ) Đối với mẫu vật cành, thân rễ nên chọn đoạn tương đối thẳng, có đường kính từ 0,1 – 0,5cm Các mẫu khơ nên luộc hay ngâm nước sôi trước cắt, thời gian ngâm hay luộc tùy thuộc vào mức độ rắn mẫu vật Phương pháp cắt mẫu: Cắt trực tiếp b Mẫu đặt lên “thớt” (làm vật liệu có độ cứng nhỏ lưỡi dao cạo gỗ khoai lang, v.v.), dùng lưỡi dao cạo cắt thành lát mỏng Các lát cắt sau ngâm vào đĩa petri có sẵn nước cất c Tẩy nhuộm mẫu: 13 Tẩy: Tẩy mẫu dung dịch Cloramin B thời gian 30 phút Rửa Cloramin lần nước cất Nếu mẫu chứa nhiều tinh bột ngâm dung dịch cloran hydrat 30 phút, sau rửa Ngâm mẫu acid acetic 15 phút Rửa mẫu lần nước cất Nhuộm: Nhuộm màu xanh dung dịch xanh Methylen Thời gian từ 5-30 giây Rửa mẫu lần nước cất Nhuộm màu đỏ cách ngâm mẫu vào dung dịch đỏ Carmin khoảng 30 phút Rửa mẫu lần nước cất Lên tiêu bản: Vi phẫu sau nhuộm, lên kính theo phương pháp giọt ép Cách thực sau: Nhỏ vào phiến kính giọt chất lỏng dùng làm môi trường quan sát (nước, glycerin, vv.), dùng kim mũi mác bút lông đặt vi phẫu cần quan sát vào giọt chất lỏng Đậy kính lại (chú ý khơng để lẫn bọt khí kính) Có cách đặt kính: Cách 1: Đặt cạnh kính tỳ vào bề mặt phiến kính, bên cạnh giọt chất lỏng Dùng kim mũi mác đỡ lấy cạnh đối diện hạ từ từ xuống Cách 2: Nhỏ giọt chất lỏng (cùng loại với chất lỏng phiến kính) vào kính Lật ngược kính lại hạ từ từ lên giọt chất lỏng phiến kính Khi giọt chất lỏng chạm bỏ tay Sau đậy kính, chất lỏng kính phải vừa đủ để chiếm tồn diện tích kính, khơng thừa chảy ngồi khơng thiếu Nếu thiếu, dùng ống hút nhỏ thêm chất lỏng dùng để lên kính vào Nếu thừa, dùng mảnh giấy lọc để hút Trong số trường hợp cần phải thay đổi chất lỏng mà không muốn bỏ kính làm sau: cạnh kính, đặt miếng giấy lọc để hút chất lỏng kính cạnh đối diện, dùng ống hút 14 cho giọt chất lỏng vào thay Khi cho chất lỏng vào đồng thời hút chất lỏng cũ Chất lỏng thay cho chất lỏng cũ kính 3.1.2 Bột Sấy khơ thân, rau má tủ sấy nhiệt độ 55-60 oC Sau dùng thuyền tán cối chày sứ nghiền nhỏ Ray lấy bột mịn, bột dược liệu quan sát kính hiển vi chụp ảnh đặc điểm bột máy ảnh chuyên dụng 3.2 3.2.1 Thành phần hóa học Định tính nhóm hoạt chất phản ứng hóa học Đối với tồn cây, saponin hoạt chất có rau má Bên cạnh việc định tính saponin, ta cần định tính thêm số thành phần khác có ảnh hưởng đến tác dụng điều trị flavonoid, tanin dược liệu Rau má Định tính Saponin Phản ứng tạo bọt Cho 0,5g dược liệu vào ống nghiệm, thêm vào 10ml cồn 70%, đun nhẹ bếp cách thủy phút lọc nóng qua bơng Lấy dung dịch cho vào ống nghiệm 1,6 x 16 cm Thêm nước cất dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm lắc theo chiều dọc ống nghiệm phút, ống nghiệm bọt bề mặt dung dịch chứng tỏ có saponin Cách tiến hành: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút Lấy ống nghiệm cỡ nhau, cho vào ống thứ 5ml HCl 0,1N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13) Cho thêm vào ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết bịt ống nghiệm, lắc mạnh ống 15 giây Ðể yên, cột bọt ống cao ngang bền sơ xác định dược liệu có saponin triterpenoid Nếu ống kiềm có cột bọt cao ống sơ xác định saponin steroid 15 Phản ứng Liebermann-Burchardt Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70% đun cách thủy phút Lọc qua vào chén sứ, cô bếp cách thủy đến cắn thật khô Để nguội Cho vào cắn 1ml anhydrid acetic, 1ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan Lọc pipet Pasteur bịt bông, cho dịch lọc vào ống nghiệm khô Để ống nghiệm nguyên giá, dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 1ml H 2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính mặt ngăn cách lớp có màu từ nâu đỏ tới đỏ tím hay tím; lớp dung dịch phía có màu xanh lá, xanh rêu hay nâu đỏ,… Định tính Flavonoid Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 10% (TT): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + 2-3 giọt thuốc thử (TT), lắc Quan sát màu, tủa so sánh ống Phản ứng dương tính ống thử đậm màu Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl (TT): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + 2-3 giọt thuốc thử (TT), lắc Quan sát màu, tủa so sánh ống Phản ứng dương tính ống thử tạo phức màu Phản ứng cyanidin: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + bột Mg + 2-3 giọt HCl đậm đặc Quan sát màu, tủa Ống có dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon có màu đỏ cam, đỏ thẫm đỏ tươi Để phân biệt glycoside với aglycon lắc với octanol, lớp octanol lên màu aglycon, khơng màu glycoside Định tính tanin Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón 50ml, thêm 30ml nước sôi, đun bế cách thủy sơi 10 phút, lắc đun Lọc nóng lấy dịch lọc Chiết tiếp bã dược liệu lần với 10ml nước, cần Dịch lọc thu dùng làm phản ứng định tính tannin 16 Kết tủa với gelatin Dung dịch tanin (0,5-1%) thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid Phản ứng dương tính có xuất tủa Phản ứng Stiasny Để phân biệt loại tanin người ta dựa vào phản ứng Stiasny: Lấy 50ml dung dịch tanin, thêm 10ml formol 5ml HCl, đun nóng Tanin pyrogallic khơng tủa tanin pyrocatechic cho tủa Nếu dung dịch có loại tanin cho dư thuốc thử (formol + HCl), đun nóng đem lọc để loại tủa tanin pyrocatechic, sau thêm vào dịch lọc natri acetat dư thêm muối sắt, có mặt tanin pyrogallic có tủa màu xanh đen 3.2.2 Định tính nhóm hoạt chất SKLM Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Saponin Bản mỏng: Silica gel GF254 Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho hệ dung môi sau: Hệ 1: Cloroform – methanol – nước (7 : : 0,5) Hệ 2: Cloroform-metanol (8: 2) Hệ 3: Chloroform – acetic acid băng – methanol – nước (6:2:1:1) Hệ 4: Chloroform – acetic acid băng – methanol – nước (60:32:12:8) Hệ 5: Ethyl acetat – acid acetic – nước (8 : : 1) Dung dịch thử: Lấy 1,0 g bột dược liệu qua cỡ rây số 250, thêm 25 ml ethanol 96% (TT), đun hồi lưu 30 phút, lọc, bốc dịch lọc đến khơ Hồ tan cắn 20 ml nước, chiết hai lần với n-butanol bão hoà nước (TT), lần 15 ml Gộp dịch chiết n-butanol, rửa 15 ml nước bão hoà nbutanol (TT), bỏ lớp nước lấy lớp n-butanol bốc đến khơ Hồ tan cắn ml methanol (TT) dùng làm dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 10 μl dung dịch thử Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun 17 lên mỏng dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT) Sấy mỏng 105oC đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường, soi UV bước sóng 254nm 366nm Ghi nhận lại sắc ký đồ Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Flavonoid Bản mỏng: Silica gel GF254 Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho hệ dung môi sau: Hệ 1: Chloroform: ethanol (9:1) Hệ 2: Chloroform: Methanol (18:2) Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài, thêm ml methanol 80 % (TT), đậy kín, lắc 15 min, lọc Dịch lọc dùng làm dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 μl dung dịch thử Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phòng Quan sát ánh sáng thường, soi UV bước sóng 254nm 366nm Ghi nhận lại sắc ký đồ 3.3 Định lượng Định lượng chất chiết rau má phương pháp khối lượng làm khô (Phụ lục 12.10 – DĐVN V) Cân xác khoảng 2,000g đến 4,000g bột dược liệu (m bột)có cỡ bột nửa thơ cho vào bình nón 100 ml 250 ml Thêm xác 50,0 ml 100,0 ml ethanol 50%, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1h, sau đun sơi nhẹ hồi lưu 1h, đề nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng ethanol 50% để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh cân bì trước (m bì) cách thủy đến cắn khơ, cắn thu sấy 105°c 3h, lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cân (m bì+cắn) Tính phần trăm lượng 18 chất chiết ethanol 50% theo dược liệu khô (thực mẫu để lấy giá trị trung bình) Cơng thức tính hàm lượng chất chiết được: M% = Trong đó: M%: Hàm lượng chất chiết A: Độ ẩm nguyên liệu a: Khối lượng chất chiết (g) b: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) Đánh giá: Khơng 25,0 % tính theo dược liệu khô kiệt Độ ẩm (Phụ lục 9.6 – DDVN V) 3.4 Dược liệu rau má làm thành mảnh nhỏ đường kính khơng q mm; lượng đem thử 1g; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy mm không 10 mm dược liệu có cấu tạo xốp Nhiệt độ 85oC thời gian sấy 4h Được tính theo cơng thức: Trong đó: p: Số gam mẫu thử trước sấy a: Số gam mẫu thử sau sấy 3.5 3.5.1 Độ tro Tro không tan acid (Phụ lục 9.7 – DDVN V) Nếu khơng có hướng dẫn khác chuyên luận dùng phương pháp1 Phương pháp 1: Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2M (TT) vào tro tồn phần, đun sơi min, lọc để tập trung chất không tan vào phễu thủy tinh xốp cân bì, vào giấy lọc khơng tro, rửa nước nóng đem nung 500°C đến khối lượng khơng đổi Tính tỷ lệ phần trăm tro không tan acid so với dược liệu làm khơ khơng khí 19 3.5.2 Tro tồn phần (Phụ lục 9.8 – DDVN V) Nếu khơng có hướng dẫn khác chuyên luận áp dụng phương pháp Phương pháp 1: Cho 2g đến 3g bột mẫu thử vào chén sứ chén platin nung cân bì Nung nhiệt độ khơng q 450 0C đến khơng carbon, làm nguội cân Bằng cách mà tro chưa loại hết carbon dùng nước ấm cho vào khối chất than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro Rửa đũa thủy tinh giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc Cho giấy lọc cắn vào chén nung nung đến thu tro màu trắng gần trắng Tập trung dịch lọc vào cắn chén nung, đem bốc đến khô nung nhiệt độ không 450 0C đến khối lượng không đổi Tính tỷ lệ phần trăm tro tồn phần theo dược liệu làm khơ khơng khí Tạp chất (Phụ lục 12.11 – DDVN V) 3.6 Cân lượng mẫu vừa đủ (50g), dàn mỏng tờ giấy, quan sát mắt thường kính lúp, cần dùng rây để phân tách tạp chất dược liệu Cân phần tạp chất tính phần trăm sau: X% = x100 Trong đó: a: khối lượng tạp chất tính bẳng gam p: khối lượng mẫu thử tính gam 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Về mặt thực vật Về mặt vi phẫu Thân: Biểu bì gồm 2-3 hàng rào tế bào hình chữ nhật Mơ dày chỗ lồi thân Ống tiết sát biểu bì, đường kính 23-24 um gồm có 5-7 tế bào tiết Mơ mềm ruột Các bó libe gỗ chồng kép, xếp theo vòng tròn liên tục, bó gồm: đám mơ cứng, libe gỗ Tầng sinh libe gỗ gồm lớp tế bào xếp đặn libe gỗ Mô mềm ruột Lá: • Gân giữa: biểu bì gân tế bào hình chữ nhật nhỏ, bên cạnh tế bào kích thước lớn hơn; biểu bì tế bào hình chữ nhật, kích • thước khơng Mơ dày: gồm 3-4 lớp tế bào hình đa giác, kích thước khơng Mơ mềm khuyết gồm 2-5 lớp tế bào hình tròn đa giác gần tròn, kích thước không Túi tiết ly bào mô mềm Bó dẫn xếp thành hình cung, libe gỗ Mạch gỗ kích thước khơng đều, hình tròn gần tròn; mơ mềm gỗ hình đa giác, vách cellulose Libe gồm nhiều lớp tế bào kích • thước nhỏ, xếp lộn xộn Phiến lá: Biểu bì có hình chữ nhật, tế bào biểu bì lớn gấp đơi tế bào biểu bì Mơ mềm giậu lớp tế bào sâu phần gân Mô mềm khuyết gồm 5-6 lớp tế bào thn dài, vách uốn lượn Lỗ khí mặt biểu bì, nhiều biểu bì Tinh thể calci oxalate cầu gai kích • thước lớn Cuốn lá: Tiết diện gần tròn khuyết mặt Biểu bì tế bào hình chữ nhật, rải rác có lỗ khí Mơ dày góc gồm 1-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước khơng Mơ mềm khuyết gồm 6-9 lớp tế bào hình tròn đa giác gần tròn, kích thước lớn, có nhiều túi tiết ly bào, lục lạp, tinh thể calci oxalate hình cầu gai, có tinh thể hình khối Trụ bì 2-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô cứng thành cụm libe Libe gỗ xếp thành bó lớn 2-3 bó nhỏ Mơ mềm tủy bị tiêu hủy 2-3 lớp Bột 21 Bột màu xám Mảnh mô mềm thân tế bào có hình đa giác gần tròn, vách mỏng Mảnh biểu bì tế bào gần đa giác, lỗ khí kiểu dị bào Sợi khoang rộng Tế bào mơ cứng hình đa giác thuôn dài đầu nhọn Tinh thể calci oxalate kích thước lớn Mảnh mạch xoắn, mạch vạch Thành phần hóa học 4.1 Kết phân tích sơ Nhóm chất Saponin Phản ứng định tính Kết sơ Kết +/- Kết luận Có/Khơng - Phản ứng tạo bọt - Phản ứng LierbermannBurchard Flavonoid - Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 10% - Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 - Phản ứng cyanidin Tanin - Kết tủa với gelatin - Phản ứng Stiasny Ghi chú: (-) Khơng có, (+) Rất ít, (++) Có, (+++) Rất nhiều 4.2 Kết sắc ký lớp mỏng Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Saponin Hệ dung mơi khai triển tốt Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Flavonoid Hệ dung mơi khai triển tốt Định lượng Lầ Lần Lần Trung bình n1 mbì mbột mbì+cắn mchất chiết = mbì+cắn – mbì 22 M%= mchất chiết *100%/(mbột-mbột*A) Thử tinh khiết Lần Lần Lần Trung bình Độ ẩm P trước sấy (g) a sau sấy (g) P (g) – a (g) Độ ẩm (%) Tạp a tạp chất (g) chất p mấu thử (g) Tạp chất ( %) Xác Tỉ lệ phần định trăm tro tro toàn phần (%) toàn phần Tro Tỉ lệ phần không trăm tro tan không tan trong acid (%) acid 23 CHƯƠNG 4: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU Từ kết nghiên cứu tổng hợp tài liệu, đề xuất tiêu chuẩn dược liệu Rau má () sau: RAU MÁ Bộ phận dùng Mơ tả Vi phẫu Định tính A Định tính phản ứng hóa học B Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng Định lượng Độ ẩm Tro khơng tan acid Tro tồn phần Tạp chất Chế biến, bảo quản Rau má mua rửa sạch, loại bỏ hư, tạp chất Cắt thành đoạn nhỏ, để nước Để nơi khơ ráo, thống mát, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp Tính vị quy kinh Tính vị: Vị khổ,tân Tính Hàn Quy Kinh: Can, Tỳ, Thận Công chủ trị Thanh nhiệt trừ thấp, giải độc, tiêu sưng Chủ trị: Hoàng đản thấp nhiệt, tiêu chảy, thổ huyết, chảy máu cam nhọt độc sưng Tiểu tiện rắt buốt Cách dùng, liều dùng Ngày dùng từ 30g đến 40g Rau má tươi, vò nát, lấy nước sắc uống Đối với dược liệu khô, ngày dùng từ 15g đến 30g dạng thuốc sắc Dùng ngoài: Dùng dược liệu tươi, giã nát, đắp chữa vết thương ngã, gây xương, bong gân làm tan ung nhọt, lượng thích hợp 24 Tài liệu tham khảo: I Tiếng việt Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, 2007, Giáo trình Thực vật học, NXB Y học, trang 293-296 Bộ Y tế, 2018, Dược Điển Việt Nam V, NXB Y học Nguyễn Vân Thu, Trần Hùng, 2011, Dược liệu học tập 1, NXB Y học, trang 237 – 240 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, 2006, NXB Y học, trang 631 - 632 Tạp chí Dược học số 428, 2011, Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Rau má, trang 27 – 30 II Tiếng anh Nicolas A N & Plunkett G M, 2014, Diversification times and biogeographic patterns in Apiales, page 30-58 Calvino C I Teruel F E & Downie S R, 2016, The role of the Southern Hemisphere in the evolutionary history of Apiaceae, a mostly north temperate plant family J Biogeog page 398-409 B Brinkhaus, M Lindner, D Schuppan, 2000, Chemical pharmacological and clinical profile of the East Asian medical plant Centella asiatica, page 427-448 Y N Shukla, R Srivastava, A K Tripathi, et al, 2000, Characterization of an ursane triterpenoid from Centella asiatica with growth inhibitory activity against Spilarctia bliqua, page 262-267 10 H Matsuda, T Morikawa, H Ueda, et al, 2001, Saponin constituents of gotu kola(2): structures of new ursane and oleanane type triterpene oligoglycosides, centellasaponins B, C and D from Centella asiatica cultivated in Sri Lanka, Medicinal foodstuffs, XXVII, Chem Pharm Bull ( Tokyo), page 1368-1371 25 11 Z Y Jiang, X M Zhang, J Zhou, 2005, New triterpenoid glycosides from Centella asiatica, Helv Chim Acta, page 297-303 12 Y N Shukla, R Srivastava, A K Tripathi, et al, 2000, Characterization of an ursane triterpenoid from Centella asiatica with growth inhibitory activity against Spilarctia bliqua, Pharm Biol, page 262-267 13 W J Kim, Jaehoonkim, B Veriansyah, J Kim, 2009, Extraction of bioactive components from Centella asiatica using subcritical water, J of supercritical Fluids, page 211-216 14 Q L Yu, H Q Duan, Y Takaishi, W Y Gao, 2006, A novel triterpene from Centella asiatica, Molecules 15 Q L Yu, W Y Gao, Y W Zhang, J Teng, H Q Duan, 2007, Studies on chemical constituents in herb of Centella asiatica, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 16 O A Oydefi, A J Afolayan, 2005, Chemical composition and Antibacterial activity of the Essential oil of Centella asiatica Growing in South Africa, Pharmaceutical Biology, Vol.43, page 249-252 17 B Mamtha, K Kavitha, K K Srinivasan, P G Shivananda, 2004, An in vitro study of the effect of Centella asiatica [Indian pennywort] on enteric pathogens, Research Letter, Indian J Pharmacol , Vol 36, Issue 1, page 41-44 18 M N Somchit et al, 2004, Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Centella asiatica, Indian J Pharmacology, page 377-380 19 X X Weng, Y Shao, Y Y Chen, W Gao, L Cheng, D Y Kong, 2011, Two new dammarane monodesmosides from Centella asiatica, J Asian Nat Prod Res 20 M Subathra, S Shila, M A Devi, C Panneerselvam, 0 , Emerging role of Centella asiatica in improving age-related neurological antioxidant status, Experimental Gerontology , page 707–715 26 21 Garo et al, 2007, Asiatic acid and Corosolic acid Enhance the Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa Biofilm to Tobramycin, Antimicrobial Agents and chemotherapy, page 1813-1817 22 Dewi Sondari, Sri Budi Harmami, M Ghozali, Ahmad Randy, Athanasia Amanda S., Yan Irawan (2011), Determination of The Active Asiaticoside Content in Centella asiatica as Anti-Cellulite Agent, Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, ISSN: 2088–0197, 222 – 227 23 Jacinda James, Ian Dubery (2011), Identification and Quantification of Triterpenoid Centelloids in Centella asiatica (L.) Urban by Densitometric TLC, Journal of Planar Chromatography - Modern TLC, 24(1), 82-87 24 Mariappan Senthilkumar (2018), Preliminary phytochemical screening of bioactive compounds from leaves of Centella asiatica L Urban, International Journal of Biology Research, ISSN: 2455-6548, 57-65 25 N.A Zainol, S.C Voo, M.R Sarmidi, R.A Aziz (2008), Profiling of centella asiatica (l.) Urban extract, The Malaysian Journal of Analytical Sciences, Vol 12, No 2, 322 -327 26 Sanjay R Biradar, Bhagyashri D Rachetti (2013), Extraction of Some Secondary Metabolites &Thin Layer Chromatography from Different Parts of Centella Asiatica L (URB), American Journal of Life Sciences, Vol 1, No 6, 243-247 27 ... không tan trong acid (%) acid 23 CHƯƠNG 4: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU Từ kết nghiên cứu tổng hợp tài liệu, đề xuất tiêu chuẩn dược liệu Rau má () sau: RAU MÁ Bộ phận dùng Mơ tả Vi phẫu Định tính... phẩm từ dược liệu không nhận thấy hiệu điều trị Vì xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu điều quan trọng để nâng cao hiệu điệu trị chế phẩm từ dược liệu Vì thực đề tài: Xây dựng tiêu chuẩn. .. phần hóa học, đối chiếu với kết - công bố Tổng hợp tài liệu, đề xuất tiêu kiểm nghiệm dược liệu rau má CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ Đặc điểm thực vật chi Centella 1.1 Vị trí phân loại