Nghiên cứu vị trí đa hình đơn nucleotide (rs221634 a t) của gen lin28b trên mẫu u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật emzym cắt giới hạn

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU VỊ TRÍ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (rs221634 A>T) CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN s 
 C ủ ềt Tiế sĩ Bùi Chí Bảo BỘ Y TẾ 
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ B O C O TỔN ĐỀ TÀI INH ẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
 HOA HỌC VÀ C N N HỆ CẤP TRƢỜN NGHIÊN CỨU VỊ TRÍ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (rs221634 A>T) CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN s 
 C ủ ( T H C t ềt ọt ) DANH CH NH N h STT H v t n BÙI CHÍ BẢO THÀNH VI N THA th VÕ VĂN THÀNH NIỆM TRƯƠNG INH KIỀU DIỄM IA N HI N CỨU nh qu tr nh n vị nhiệm v h nhiệm ề t i Trung t m Y Sinh h - Thành viên Thành viên ng t ih Y TP H Trung t m Y Sinh h - ih Y ih Y Ph n t TP H Trung t m Y Sinh h - Ph n t Ph n t TP H i ỤC LỤC NH S H NH NG THÀNH VI N TH GI NGHI N U i ii NH H VI T TẮT iii DANH MUC HÌNH iv DANH M C BẢNG v BÁO CÁO THỐNG KÊ vi h ng I HƯƠNG GIỚI THIỆU h ng II PHƯƠNG PH P Nguồn mẫu Thiết kế th nghiệm L a ch n kiểu gen SNP SNP qu n t m li n qu n ến NB c xuất báo (He et al., 2016) rs221634 A> T 4 Thiết kế mồi 5 Enzyme cắt h n chế Phân lập DNA gen từ máu toàn phần Trình t Sanger h ng III K T QUẢ Kết chuẩn hoá sản phẩm PCR ịnh tính chất l 1.1 ng mẫu DNA 1.2 nh gi mẫu ch y PCR với mồi thiết kế 1.3 Kết chuẩn hoá sản phẩm RFLP 1.4 Kiểm ịnh kết kiểu gen qua giải trình t Sanger 12 1.5 T ng qu n kiểu gen quần thể UNBTK 13 h ng IV THẢO LUẬN – K T LUẬN 15 h ng V K T LUẬN 18 T i liệu th m khảo 19 ii DANH ỤC CH VIẾT TẮT RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SNP: Single nucleotide polymorphism NB: Neuroblastoma UNBTK: U nguyên bào thần kinh LIN28B: Lin-28 Homolog B GWAS: Genome-wide association study OR: odds ratios I: onfi en e interv l iii DANH MUC HÌNH Hình Kết iện di Agarose gel 8-10% với DNA gen c tách chiết từ máu Cột 1: DNA ladder (1kb); Cột 2: DNA gen H nh iện di gel agarose c a sản phẩm PCR với nhiệt ộ khác Ngõ 1: thang kb; ngõ 2-5: Sản phẩm PCR giá trị T o ộng từ 54 ° ến 60 ° C; ngõ 6: kiểm sốt âm tính (dH2O thay DNA mẫu) Hình Kết RFLP mẫu ch ng C8 với băng c a enzyme SspI Lan 1: Thang kb; lan 2-5: theo khung thời gi n tăng ần từ ến tiếng 10 Hình Các mẫu RFLP c a mẫu ối ch ng (C8) sau phân h y sản phẩm khuếch i PCR enzyme SspI, s u iện di (A) tối u hó khối l ng sản phẩm PCR n ớc khơng có nuclease Lan 1: thang kb; lan 2-4: mẫu ối ch ng (C8) cho thời gian k khác nhau, từ ến (B) tối u hó khối l ng sản phẩm P R, n ớc khơng có nuclease enzyme SspI Lan 1: thang kb; Lan 2-4: mẫu ối ch ng (C8) cho thời gian khác nhau, từ ến 11 Hình Kiểu gen PCR-RFLP c h nh IN28B rs221634 > T ( ) ẫu RFLP c a sáu mẫu DNA sau tiêu hóa sản phẩm khuế h i PCR enzyme SspI, sau iện di Ngõ 1: thang 1kb; ngõ 2-4: mẫu NB; ngõ 5-7: mẫu ối ch ng; ngõ 8-10: kiểm sốt tích c c xác nhận Sanger Sequences; ngõ 11: Sản phẩm PCR không h n chế enzyme; ngõ 12: kiểm sốt âm tính (dH2O thay DNA mẫu) (B) Kiểu gen AA, AT, TT cx ịnh theo mẫu h n chế qu n s t c 12 Hình Phân tích trình t S nger ( ), (B) v ( ) t ng ng với trình t DNA t i vùng UTR tr n gen IN28B mũi t n hỉ kiểu gen AA, AT TT * 1430, t ng ng cho rs221634 LIN28B 13 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Thông tin di truyền c SNPs c ch n Bảng 2: Trình t mồi s d ng Bảng Các thành phần tối u hó xét nghiệm RFLP Bảng Tần số kiểu gen c IN28B rs221634 /T tr ờng h p u nguyên bào thần kinh kiểm so t kh ng g y ung th 14 Bảng Tần số kiểu gen c IN28B rs221634 > T tr ờng h p u nguyên bào thần kinh với thông số lâm sàng 14 v CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VIỆT NAM ộc lập - T - H nh phúc y t BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG T ề tài: NGHIÊN C U VỊ TRÍ HÌNH ƠN NU EOTI E (rs221634 >T) ỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN C ủ vụ: H tên: BÙI CHÍ BẢO Ng y, th ng, năm sinh: Nam/ Nữ: Nam H c hàm, h c vị: Tiến sĩ Ch c danh khoa h c: Không Ch c v : Nghiên c u viên iện tho i: Tổ ch c: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không Mobile: 0947753083 Fax: Không Tên tổ ch E-mail: bcbao@ump.edu.vn ng ng t : Y ih c Thành phố Hồ Chí Minh ịa tổ ch c: 217 Hồng B ng, ph ờng 11, quận 5, TP.HCM ị hỉ nh ri ng: vụ(1): Tổ c ức c ủ trì Tên tổ ch c ch trì nhiệm v : ih iện tho i: (+84-28) 3855 8411 Y c Thành phố Hồ Chí Minh Fax: (+84-28) 3855 2304 E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn Website: http://yds.edu.vn/yds2/ ịa chỉ: 217 Hồng B ng, ph ờng 11, quận 5, TP.HCM T qua c ủ T n Kho hoặ Trung t m, ềt ih n vị - n i quản lý tr Y th nh phố Hồ hí tiếp inh nh n l m h nhiệm ề t i vi II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực hi n nhi m vụ: - Theo H p ồng ã ký kết: từ th ng năm 2018 ến th ng năm 2019 - Th c tế th c hiện: từ th ng năm 2018 ến th ng năm 2019 - c gia h n (nếu có): Khơng Từ th ng… năm… ến th ng… năm… Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí th c hiện: tr , ó: + Kính phí hỗ tr từ ngân sách khoa h c c nh tr ờng: tr + Kinh phí từ nguồn kh : tr b) Tình hình cấp s d ng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa h c: Số TT Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr ) Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Th ng, năm) (Tr ) năm 2018 ến tháng năm 2019 Ghi (Số đề nghị toán) 5 c) Kết s d ng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả ng l o ộng (khoa h c, phổ thông) Nguyên, vật liệu, l ng Thiết bị, máy móc Xây d ng, s a chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Thực tế đạt Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Tổng NSKH Nguồn khác 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 - ý o th y ổi (nếu có): vii Tổ chức ph i hợp thực hi n nhi m vụ: Số TT Tên tổ chức tham gia thực Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - ý o th y ổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực hi n nhi m vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Bùi Chí Bảo Tên cá nhân tham gia thực Bùi Chí Bảo Nội dung tham gia Ch nhiệm ề tài Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - ý o th y ổi ( có): Tình hình hợp tác qu c tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - ý o th y ổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - ý o th y ổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công vi c chủ yếu: viii Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh μ sản phẩm PCR Các sản phẩm P R c 37oC 15 phút 75oC 15 phút Giải trình t chu trình BigDye Terminator v1.1 (Hệ sinh h c ng d ng) bắt ầu với sản phẩm tinh khiết μ , ệm giải trình t BigL 10X 10X BigDye, 0,5 Big ye, n ớc vô trùng mồi pmol nh s u: ho rs221634, tr nh t ng l i c tối u hó Qu tr nh hu tr nh uy tr c iều kiện liên tiếp: b ớc biến tính b n ầu 96oC phút 30 chu kỳ 96oC 10 giây, 50oC gi y v 60o phút B ớc tinh chế th hai s d ng ph Các mẫu ng ph p kết t a Ethanol c phân tách iện di mao quản Máy phân tích di truyền ABI 3500XL (Hệ sinh h c ng d ng) c trang bị mao quản dài 36 cm polymer POP-7 Phần mềm CLC Main Workbench phiên ũng S nger Sequen es v c ch ể phân tích liệu ăn hỉnh mẫu với tham chiếu tr c tuyến Phân tích th ng kê Giá trị t ng qu n a kiểu gen giá trị lâm sàng UNBTK SPSS (phiên 24) Xét nghiệm hi b nh ph ng c s d ng ể so s nh h p kiểm soát u nguyên bào thần kinh Mối liên quan giữ SNPs v nguyên bào thần kinh gian xá x tr ờng ộ nh y cảm với u ịnh cách tính tỷ lệ chênh lệch (OR) khoảng thời ịnh 95% (CIs), s d ng phân tích hồi quy logisti v iều kiện ể phân tích tính nh y cảm S kết h p yếu tố lâm sàng kiểu gen TT cách s d ng xét nghiệm hính x c phân tích ớc tính h i u i χ2 th nghiệm xác Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh C ƣơ III KẾT QUẢ Kết chuẩn hoá sản phẩm PCR 1.1 Định tính chất lƣợng mẫu DNA Tất ả mẫu N ã h n ho P R th ng th ờng với hất l ng v số l ng A260 / A230: 1.7-2 2) r o (tỷ lệ ới ng N ung ị h r o (tr n 70 ng / ) ó thể nh n thấy 280: 7-1.9; ng hú ý, tất ả giải 50-100 buffer nồng ộ N 260 / ải bp hiết xuất giải ể thu o n N kết x ịnh rõ r ng (H nh 1) Hình Kết n di Agarose gel 8-10% với DNA gen ƣợc tách chiết từ máu Cột 1: DNA ladder (1kb); Cột 2: DNA gen 1.2 Đ ặp mồi P R ẫu chạy PCR với m i thiết kế thiết kế ể khuế h i ể ph vùng gen nhắm m ti u b o gồm vị trí SNP (rs221634 A>T) v vị trí enzyme h n hế kh hs ng N BI Primer B kh ng phù h p với m ti u kh h ịnh ho phép khuế h kh ng ó ấu trú th gi trị ST ể kiểm tr tính ặ hiệu theo 54 ° - 60 ° i kh ng mong muốn h th ột ặp Primer ũng tối u N gen Bằng h ng huyển ổi UV, ải s ng v nhỏ g n kiến (466 bp) ã h so s nh với th ng 1kb ó thể P R ộ ố nhiệt ộ (H nh 3) B n P R với 35 hu kỳ ho sản phẩm P R s với kí h th mồi ấp m nh v t bổ sung th ng qu I T Oligo Ph n tí h, ó nh ó, húng t i ã th h nh ung mồi, h ớng ịnh v khoảng elt G l -6,3 k l / mol Theo mồi Tm Tm, nhiệt ộ hó m Bằng o ó, nhiệt ộ qu n s t rõ r ng l n tối u l 56 ° (H nh 2) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình Đ n di gel agarose sản phẩm PCR với nhi t ộ ủ khác Ngõ 1: thang kb; ngõ 2-5: Sản phẩm PCR giá trị Ta dao ộng từ 54 ° C ến 60 ° C; ngõ 6: kiểm soát âm tính (dH2O thay DNA mẫu) 1.3 Kết chuẩn hoá sản phẩm RFLP Bản enzyme cắt h n chế cho thấy vị trí SspI cắt sản phẩm PCR Chúng khảo sát vùng Theo ề xuất c a nhà sản xuất enzyme SspI Restriction Enzyme (Thermo S ien e), húng t i ã th c thí nghiệm với mẫu ối ch ng (C8), xác nhận kiểu gen rs221634 T/T giải trình t Sanger Bảng Các thành phần t Tối u ho ƣu óa xét m RFLP Thời gian ủ RFLP thành phần Thể tích (μL) Nuclease-free water 18 14 10 10X Buffer G 2 PCR product 10 Restriction enzyme (10 U Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh μ _1 ) Tổng cộng 32 Kết kiểm tr thời gi n 25 18 tr n nhiệt ộ kh 37oC từ - tiếng cho phản ng tham khảo (Bảng 1) Sau ch y gen 75 V, 30 p 100 V cho 15p 3% (wt/vol) agarose, kết ho băng từ enzyme SsspI theo hình 3, theo biến thiên, từ ặc hiệu thấp (l n 2) ến ộ nh y o (l n 7) Nh kết tốt giờ, lan số bp Hình Kết RFLP mẫu chứng C8 vớ c c b cắt enzyme SspI Lan 1: Thang kb; lan 2-5: ủ theo khung thờ a t dần từ ến tiếng Theo giao th khuế h c khuyến nghị ể tiêu hóa sản phẩm PCR sau i (Bảng 1), th giảm l ng sản phẩm PCR, mẫu ch ng nuclease Theo cách này, chúng tơi quan sát thấy dãi băng 2, hai mảnh bị cắt ã bị xuống cấp bị vấy bẩn (Hình 4A) Tiếp theo, l ng sản phẩm P R, n ớc khơng có nuclease enzyme h n chế ã giảm Kết dải sáng c quan sát mà khơng có dải bất ngờ l n hai mảnh bị cắt ã bị xuống cấp (H nh 4B) ối với 4, o ó, qu tr nh ti u hó ho n to n sản phẩm PCR xảy 37oC 10 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình Các mẫu RFLP mẫu i chứng (C8) sau phân hủy sản phẩm khuếc ại PCR bằ e zy e s I sau n di (A) t ƣu óa kh lƣợng sản phẩ PCR v ƣớc khơng có nuclease Lan 1: thang kb; lan 2-4: mẫu i chứng (C8) cho thời gian ủ k khác nhau, từ ến (B) t ƣu óa lƣợng sản phẩ PCR ƣớc khơng có nuclease enzyme SspI Lan 1: thang kb; Lan 2-4: mẫu i chứng (C8) cho thời gian ủ khác nhau, từ ến o ó, ể x ịnh biến thể gen LIN28B, 50 mẫu máu bao gồm 25 mẫu ối ch ng, 25 mẫu NB ã x RFLP Kết cho thấy kiểu gen ịnh kiểu gen AA, TT, AT xét nghiệm c biểu thị mẫu DNA khác (Hình 5A B) 11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh bp Hình Kiểu gen PCR-RFLP a ì LIN28B rs221634 A> T (A) Mẫu RFLP sáu mẫu DNA sau tiêu hóa sản phẩm khuếc ại PCR enzyme s I sau n di Ngõ 1: thang 1kb; ngõ 2-4: mẫu NB; ngõ 5-7: mẫu i chứng; ngõ 8-10: kiểm sốt tích cực ƣợc xác nhận Sanger Sequences; ngõ 11: Sản phẩm PCR không hạn chế enzyme; ngõ 12: kiểm sốt âm tính (dH2O thay DNA mẫu) (B) Kiểu e AA AT TT ƣợc x c ịnh theo mẫu hạn chế qua s t ƣợc B c t ƣớc sản phẩm cắt (bp) Kiểu gen 305 220 163 85 AA - + + + AT + + + + TT + - + - 1.4 Kiểm ịnh kết kiểu gen qua giải trình tự Sanger Các kiểu gen c a rs 221634 A/A; A/T T/T c a gen LIN28B c kiểm tra l i S nger ể kiểm ịnh ộ ặc hiệu c a enzyme cắt Từ giao th vật liệu v ph ng ph p, mẫu c mô tả c ch n theo trình t : mẫu ối ch ng từ ng ời lớn b nh th ờng (C1, C2, C3 C8) mẫu NB (NB167, NB170, NB182 NB183) Trong tr ờng h p rs221634, khu v c poly A nằm liền kề với trình cần thiết ể c tối u hó nhiều lần tr t h nh, o ó, qu c kết sâu sắc T i 12 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh vị trí c a rs221634, mẫu (C2, C3 NB183) ch a alen AT, mẫu (C1, NB167 NB182) mang alen AA, mẫu (C8 NB170) (Hình 6) Hình Phân tích trình tự a er (A) (B) v (C) tƣơ ứng với trình tự DNA vù UTR tr e LIN28B C c ũ t c ỉ kiểu gen AA, AT TT c * 143 tƣơ ứng cho rs221634 LIN28B 1.5 Tƣơ qua ểu gen quần thể UNBTK Chúng áp d ng ch y mẫu UNBTK Mẫu máu bệnh nh n tính c kiểm tra hình c a vị trí rs221634 gen iN28B 25 tr ờng h p UNBTK 25 kiểm soát kh ng g y ung th ã x ịnh thành công kiểu gen xét nghiệm RFLP Trong thí nghiệm này, xét nghiệm hi b nh ph ng c s d ng ể so s nh tr ờng h p kiểm soát u nguyên bào thần kinh Tuy nhiên, kết c a ng ời mang kiểu gen rs221634 T/T kh ng ó ý nghĩ li n qu n ến UNBTKkhi so sánh với ng ời mang kiểu gen A/A A/T (p = 0,758, OR = 1,210, 95% CI = 0,36013 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 4,065) (Bảng 6) Ngồi ra, khơng có mối li n qu n ng kể kiểu gen rs221634 T/T thông số lâm sàng (P> 0,05) (Bảng 7) Bảng Tần s kiểu gen LIN28B rs221634 A/T tro bào thần kinh kiể so t ô ây u t ƣ Genotype c c trƣờng hợp u nguyên Case Control *P- OR (95% CI) P-value No (%) No (%) value 17 (68.00) 18 (72.00) P>0.05 0.826 (0.246-2.776) rs221634 AA/AT 0.758 (B T tro bào thần kinh với thông s lâm sàng Variables c c trƣờng hợp u nguyên rs221634 (case) AA/AT TT No (%) No (%) Nam (69.23) (30.77) Nữ (58.33) (41.67) ≤18 (37.50) (62.50) >18 13 (76.47) (23.53) P-value Giới tính 0.538 Tuổi (tháng) 0.283 14 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh C ƣơ í h M rs221634 IV THẢO LUẬN – KẾT LUẬN a thí nghiệm n y l ể tối u hó xét nghiệm RF P ể phát > T gen IN28B v s u ó t m r mối liên quan kiểu gen TT thông số lâm sàng Trong thí nghiệm này, SspI (Thermo khoa h c) endonuclease h n chế, nhận chuỗi DNA kép c thể xúc tác cho s phân cắt ối x ng ối x ng c a liên kết phosphodiester chuỗi c nhận ngắn, số l c t o Do trình t N , o ó ng mảnh ầu cùn c t o từ enzyme n y th ờng có cặp trình tiêu hóa lớn, vị trí nhận biết c sở iểm phân tách nằm trình t nhận biết Ngồi ra, khoảng cách c a hai vị trí enzyme h n chế q gần nhau, nên khó ể thiết kế tính ặc hiệu c a mồi ng vị trí SNP vị trí enzyme h n chế Theo cách này, cặp mồi tối u khuế h c thiết kế ể i m c tiêu c a vùng gen bao gồm hai vị trí enzyme h n chế, o ó, cần thiết ể ớc tính khoảng cách o n (> 50 bp) v thu Khuế h c iP R tr n h c th c d nhiệt ộ , thời gi n c kết mong ng tr nh khuế h i tiêu chuẩn Nồng ộ, p xe cho cặp mồi thể tích DNA mẫu ngăn hặn s diện c a sản phẩm khuế h i bổ sung v chu trình nhiệt xác Kết cho thấy 56 ° C nhiệt ộ i c tối u hó ảm bảo h ể ng tr nh tối u ho ặp mồi Ngoài r , ể lo i bỏ tất nguồn gây nhiễm, c chế làm bất ho t endonuclease h n chế, d ng c tinh l số l N ã c s d ng ể lấy DNA mẫu chất l ng cao ng cao phù h p h n ho quy tr nh P R Tối u hó RF P c th c d a giao th sản phẩm PCR sau khuế h i Thời gian , ầu vào sản phẩm P R v l enzyme (10U / μ ) l b th nh phần hính lo t thời gian bệnh cấp thời gian sản phẩm P R h thừ enzyme c khuyến nghị ể tiêu hóa c chúng tơi tối u hó t ng ng ng ầu tiên, c th c 1-6 giờ, mảnh vỡ ã bắt ầu xuống i h n Ngo i r , ti u hó kh ng ầy ti u hó c quan sát 1-2 Th hai, l c thêm vào phản ng, thời gian thời gi n Tuy nhi n, th y v tăng l ũng ẫn ến ng c giảm xuống ể tiết kiệm ng enzyme h n chế tiền, ầu vào sản phẩm PCR 15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh v n kh ng ó nu le se ã giảm Theo ề xuất c a SspI Restriction Enzyme (Thermo Science), cần tối thiểu 0,1 n vị h n chế ể ti u hó ho n to n μg N 16 37 ° , ó ó 20 vị trí nhận d ng DNA Theo enzyme h n chế c yêu cầu khoảng μ (10 U) 37 ° sản phẩm PCR tiêu hóa (0,1-0,2 μg enzyme h n y, l ng ể hoàn thành N ) với vị trí enzyme h n chế Ngoài ra, c cung cấp 50% gly erol, n n l 10% tổng khối l l mb ng enzyme c thêm vào kh ng v ng phản ng ể giữ nồng ộ glycerol phản ng t ới 5% (Ota, Fukushima, Kulski, & Inoko, 2007) Rõ ràng, enzyme nên thành phần cuối ùng thêm vào phản ng H n nữa, khối l h n chế lớn h n 10 Trống B n ng kể ti u hó c ng th c tế nhỏ ể th c tóm tắt ới iều này, lỗi iều kiện phản ng Khối l ờng ống r lỗi ng n y ũng ho phép to n hệ thống c n p v o gel iện di sau bổ sung ệm tải H n nữa, ệm sai có ng kể ho t ộng, ộ ặc hiệu bị th y ổi hồn tồn khơng có ho t thể làm giảm ộng, Bộ ệm G 10X ã c thêm vào lần tiêu hóa khoảng μ , kh ng v t 1/10 thể tích phản ng cuối PCR-RFLP kỹ thuật cổ iển n lẻ nh ng ó ộ xác cao, nhanh chóng dễ th c Bằng cách cho phép phát nh nh trình t gen c khuế h endonuclease h n chế c thể Ph ph n tí h S nger, Ph h nh nu leoti e i P R, c phân biệt tiêu hóa với ng ph p thuận tiện v n giản n y n So với th nghiệm c áp d ng ể i nh Giải trình t ng ph p T qm n v Giải trình t hệ tiếp theo, PCR-RFLP tốn h n o kh ng y u ầu d ng c hi phí ph ột biến iểm sau tiền (Trình t Sanger có gi 13,6 ng ph p T qm n v NGS tốn 400 -RF P) Tuy nhi n, ph ể ph n tí h th ng l l so với ng ph p n y òi hỏi số l ng t l mẫu, l lần PCR Phản ng ng ối lớn không phù h p ng cao Quang sai di truyền NB ã c quan sát bao gồm khuế h LIN28B (rs221634 có liên quan cao với s tộc h c Hán-Trung) v th y ổi số l óng góp NB ó nguy i gen: h nh o n ng nhiễm sắc thể (Matthay et al., 2016) Theo nghiên c u c a GWAS, rs221634 (kết h p P = 0,030, OR = 1,50, 95% CI = 16 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 1,04-2,17) ã th c th c với 256 tr ờng h p NB v 531 tr ờng h p kiểm sốt ung ó kiểu gen TT ồng h p t ó li n qu n ến kiểu gen 17 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh C ƣơ V KẾT LUẬN Trong nghiên c u n y, húng t i ã tối u hó th nh công xét nghiệm o n giới h n o n (RFLP) cho kiểu gen IN28B rs221634 >T h nh Ph h nh ng ph p n giản rẻ tiền n y ặc biệt thuận tiện ể t o chuỗi nucleotide t i vị trí quan tâm c thể mà không cần ph ng ph p gõ ph c t p nh lai, chip DNA trình t nucleotide, v.v hữu ích nghiên c u t p Tuy nhiên, nghiên c u tiến c u nhỏ bệnh di truyền ph c c thiết kế tốt c khuyến khí h ể xác minh nghiên c u c a chúng tôi, với cỡ mẫu lớn h n v th ng tin chi tiết nh ph i nhiễm c h , gi i o n lâm sàng v.v 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh T l ut a ảo Brodeur, G M (2003) Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma Nature Reviews Cancer, 3(3), 203 Carmel-Gross, I., Bollag, N., Armon, L., & Urbach, A (2015) LIN28: a stem cell factor with a key role in pediatric tumor formation Stem cells and development, 25(5), 367-377 Cimadamore, F., Amador-Arjona, A., Chen, C., Huang, C T., & Terskikh, A V (2013) SOX2–LIN28/let-7 pathway regulates proliferation and neurogenesis in neural precursors Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(32), E3017-E3026 Diskin, S J., Capasso, M., Schnepp, R W., Cole, K A., Attiyeh, E F., Hou, C., & Jagannathan, J (2012) Common variation at 6q16 within HACE1 and LIN28B influences susceptibility to neuroblastoma Nature genetics, 44(10), 1126 He, J., Yang, T., Zhang, R., Zhu, J., Wang, F., Zou, Y., & Xia, H (2016) Potentially functional polymorphisms in the LIN28B gene contribute to neuroblastoma susceptibility in Chinese children Journal of cellular and molecular medicine, 20(8), 1534-1541 Kiyonari, S., & Kadomatsu, K (2015) Neuroblastoma models for insights into tumorigenesis and new therapies Expert opinion on drug discovery, 10(1), 53-62 Matthay, K K., Maris, JM., Schleiermacher, G., Nakagawara, A., Mackall, CL (2016).Neuroblastoma Nature Reviews Disease Primers, 2, 16078 Molenaar, J J., Domingo-Fernández, R., Ebus, M E., Lindner, S., Koster, J., Drabek, K., & Broekmans, M (2012) LIN28B induces neuroblastoma and enhances MYCN levels via let-7 suppression Nature genetics, 44(11), 1199 Monclair, T., Brodeur, G M., Ambros, P F., Brisse, H J., Cecchetto, G., Holmes, K., & von Schweinitz, D (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) staging system: an INRG task force report Journal of Clinical Oncology, 27(2), 298-303 10 Nguyen, L H., Robinton, D A., Seligson, M T., Wu, L., Li, L., Rakheja, D., & Yang, E H (2014) Lin28b is sufficient to drive liver cancer and necessary for its maintenance in murine models Cancer cell, 26(2), 248-261 11 Ota, M., Fukushima, H., Kulski, J K., & Inoko, H (2007) Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism Nature protocols, 2(11), 2857 12 Powers, J T., Tsanov, K M., Pearson, D S., Roels, F., Spina, C S., Ebright, R., & Tu, H C (2016) Multiple mechanisms disrupt the let-7 microRNA family in neuroblastoma Nature, 535(7611), 246 13 Schmidt, R., & Plath, K (2012) The roles of the reprogramming factors Oct4, Sox2 and Klf4 in resetting the somatic cell epigenome during induced pluripotent stem cell generation Genome biology, 13(10), 251 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 14 Schnepp, R W., Khurana, P., Attiyeh, E F., Raman, P., Chodosh, S E., Oldridge, D A., & Madison, B B (2015) A LIN28B-RAN-AURKA signaling network promotes neuroblastoma tumorigenesis Cancer cell, 28(5), 599-609 15 Smith, D R (1996) Restriction endonuclease digestion of DNA In Basic DNA and RNA protocols (pp 11-15) Humana Press 16 Viswanathan, S R., Powers, J T., Einhorn, W., Hoshida, Y., Ng, T L., Toffanin, S., & Shah, S P (2009) Lin28 promotes transformation and is associated with advanced human malignancies Nature genetics, 41(7), 843 17 Zhou, J., Ng, S B., & Chng, W J (2013) LIN28/LIN28B: an emerging oncogenic driver in cancer stem cells The international journal of biochemistry & cell biology, 45(5), 973-978 18 Zhu, H., Shyh-Chang, N., Segrè, A V., Shinoda, G., Shah, S P., Einhorn, W S., & Urbach, A (2011) The Lin28/let-7 axis regulates glucose metabolism Cell, 147(1), 81-94 20 ... TÀI (TOÀN VĂN)
 HOA HỌC VÀ C N N HỆ CẤP TRƢỜN NGHIÊN C? ?U VỊ TRÍ ? ?A HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE (rs221634 A> T) C? ?A GEN LIN28B TRÊN M? ?U U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN s 
 C ủ ( T... C? ?U KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG T ề tài: NGHIÊN C U VỊ TRÍ HÌNH ƠN NU EOTI E (rs221634 >T) ? ?A GEN LIN28B TRÊN M? ?U U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT EMZYM CẮT GIỚI HẠN C ủ vụ: H tên: BÙI CHÍ... Minh bp Hình Ki? ?u gen PCR-RFLP a ì LIN28B rs221634 A> T (A) M? ?u RFLP s? ?u m? ?u DNA sau ti? ?u h? ?a sản phẩm khuếc ại PCR enzyme s I sau n di Ngõ 1: thang 1kb; ngõ 2-4: m? ?u NB; ngõ 5-7: m? ?u i chứng;