Nghiên cứu in silico trên các chất đối vận thụ thể 5 hydroxytryptamin 6 trong điều trị bệnh alzheimer

Xây dựng các mô hình in silico 3D-pharmacophore, mô tả phân tử docking và 2D-QSAR dựa trên cấu trúc phối tử đối vận thụ thể 5-HT6.. Các vị trí gắn kết trên cấu trúc tương đồng của thụ th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TĂNG THỊ THIÊN MY

NGHIÊN CỨU IN SILICO TRÊN CÁC CHẤT ĐỐI VẬN

THỤ THỂ 5-HYDROXYTRYPTAMIN 6 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TĂNG THỊ THIÊN MY

NGHIÊN CỨU IN SILICO TRÊN CÁC CHẤT ĐỐI VẬN

THỤ THỂ 5-HYDROXYTRYPTAMIN 6

TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

Ngành : Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

Mã số : 527187009

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS THÁI KHẮC MINH

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực vàchưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tăng Thị Thiên My

NGHIÊN CỨU IN SILICO TRÊN CÁC CHẤT ĐỐI VẬN

THỤ THỂ 5-HYDROXYTRYPTAMIN 6 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

Tăng Thị Thiên My Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Thái Khắc Minh ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự gia tăng về số lượng bệnh nhân mắc Alzheimer đã và đang tạo nên một gánhnặng về sức khỏe cũng như chi phí y tế khi không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đếnngười bệnh mà còn ảnh hưởng đến thân nhân người bệnh Tuy nhiên, thực hành lâmsàng điều trị AD hiện tại lệ thuộc vào 2 nhóm thuốc cũ với hiệu quả hạn chế lại đikèm nhiều tác dụng phụ Thụ thể 5-hydroxytryptamin 6 là phân nhóm thụ thể mớinhất được xác định, thuộc họ thụ thể serotonin và đối vận thụ thể 5-HT6 đang là cơchế tiềm năng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đánh giá lựa chọn protein mẫu thích hợp và xây dựng mô hình tương đồng thụ thể

5-HT6 Xây dựng các mô hình in silico (3D-pharmacophore, mô tả phân tử docking

và 2D-QSAR) dựa trên cấu trúc phối tử đối vận thụ thể 5-HT6 Sàng lọc cơ sở dữ

liệu ChemDiv và Drugbank qua các mô hình in silico để bước đầu tìm ra các chất

có tiềm năng trong điều trị Alzheimer với cơ chế đối vận thụ thể 5-HT6

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Mô hình 3D-pharmacophore 5 điểm được xây dựng gồm F1:Aro|PiR, F2:Hyd,F3:Hyd, F4:Acc2 và F5:Acc2 Mô hình docking cho thấy vai trò của các acid aminquan trọng và tương tác của túi kỵ nước trong sự gắn kết với thụ thể 5-HT6 Môhình 2D-QSAR đạt R2 = 0,59 và đánh giá Roy nhưng không đạt RMSE = 0,55 Kếtquả sàng lọc cho thấy 6 chất: Y041-6420, S824-0053, Y206-1266, S664-4811,SA85-1058 và S824-2332 có tiềm năng nhất từ thư viện ChemDiv và Drugbank,được đề nghị tiến hành các nghiên cứu xa hơn nhằm đánh giá hiệu quả điều trị AD

IN SILICO SCREENING FOR 5-HYDROXYTRYPTAMIN 6

RECEPTOR ANTAGONIST ON ALZHEIMER TREATMENT

Thien-My T Tang Supervisors: Assoc Prof Khac-Minh Thai INTRODUCTION

Alzheimer’s disease is an important condition with a considerable and unmetdisease burden in large need of continued research and more treatment options The5HT6 antagonists are a new class of medications to be proposed as a target forimproving cognitive dysfunction in Alzheimer

MATERIALS AND METHODS

Selecting the most appropriate protein template and developing 5-HT6 tương đồng

Building in silico models (3D-pharmacophore, docking molecular descriptions and

2D-QSAR) based on the structure of the 5-HT6 receptor antagonist ligands Usingthose on ChemDiv and Drugbank database to figure out potential structures in ADtreatment through 5-HT6 receptor antagonism mechnism

RESULTS

A 5-point 3D-pharmacophore model was developed including F1:Aro|PiR, F2:Hyd,F3:Hyd, F4:Acc2 và F5:Acc2 The docking model showed the important aminoacids and hydrophobic interaction between ligands and 5-HT6 receptor The 2D-QSAR model reached R2 = 0.59 and Roy’s validation method but did not achieve

RMSE = 0.55 In silico screening showed that Y041-6420, S824-0053, Y206-1266,

S664-4811, SA85-1058 and S824-2332 were the 6 top potential structures from theChemDiv and Drugbank database and suggested running in other studies to evaluatethe effectiveness on Alzheimer treatment

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh Alzheimer 3

1.2 Thụ thể 5-hydroxytryptamin 6 4

1.3 Các đích tác động khác đang được nghiên cứu trong điều trị Alzheimer 10

1.4 Các mô hình sàng lọc in silico 12

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Xây dựng mô hình tương đồng của thụ thể 5-HT6 19

2.2 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking 21

2.3 Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore 24

2.4 Đánh giá ADME 31

2.5 Xây dựng mô hình 2D-QSAR 37

2.6 Ứng dụng sàng lọc ảo 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48

3.1 Kết quả mô hình tương đồng của thụ thể 5-HT6 48

3.2 Kết quả mô hình mô tả phân tử docking 50

3.3 Kết quả mô hình 3D-pharmacophore 55

3.4 Kết quả mô hình 2D-QSAR 63

3.5 Ứng dụng các mô hình in silico để tìm các chất đối vận thụ thể 5-HT6 có tiềm năng điều trị Alzheimer 67

3.6 Bàn luận 77

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84DANH MỤC PHỤ LỤC PL-1

cAMP Adenosin monophosphat vòng

ChemDiv Discovery Chemistry Public Available

FDA U.S Food and Drug Administration

(Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc của Mỹ)GABA Acid γ-aminobutyric

GPCR G-protein-coupled receptor

(Thụ thể bắt cặp với G protein)LOO Leave-One-Out

L-20%-O Leave-20%-Out

PCA Principle Components Analysis

(Phân tích thành phần chính)PDB Protein Data Bank

(Ngân hàng dữ liệu protein)PLS Partial Least Squares

(Thuật toán bình phương tối thiểu từng phần)RCT Randomized controlled trial

(Thử nghiệm lâm sàng đối chứng ngẫu nhiên)RMSE Root-mean-square deviation

(Căn bậc hai của tổng bình phương phần dư)TKTW Thần kinh trung ương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các khung cấu trúc đối vận 5-HT6 đang được thử nghiệm lâm sàng 9

Bảng 1.2 Chất đối vận thụ thể 5-hydroxytryptamin 6 đã được tiến hành thử nghiệm lâm sàng trong điều trị bệnh Alzheimer 9

Bảng 2.1 Các chất đối vận 5-HT6 được lựa chọn làm “Tập xây dựng” 26

Bảng 2.2 Luật Ghose, Verber, Muegge và Egan 34

Bảng 2.3 Các mô hình và tiêu chí đánh giá ADME 36

Bảng 2.4 Khung cấu trúc của 112 hợp chất của cơ sở dữ liệu 38

Bảng 2.5 Một số nhóm thông số mô tả phân tử 2D tính bằng MOE 2015.10 39

Bảng 3.1 Mức độ tương đồng trình tự của các protein mẫu với thụ thể 5-HT6 48

Bảng 3.2 Các thông số đánh giá 5 mô hình tương đồng dựa trên protein mẫu 6A94 hoặc 4IB4 49

Bảng 3.3 Các acid amin tương tác với ligand tại khoang trung tâm 52

Bảng 3.4 Bảng đánh giá các pharmacophore xây dựng bằng phương pháp cơ bản 57 Bảng 3.5 Bảng đánh giá và so sánh pharmacophore B01 với A01, A02, A03 58

Bảng 3.6 Mô hình QSAR trung gian từ tập xây dựng và các thông số của mô hình 63

Bảng 3.7 Các giá trị đánh giá nội trên tập xây dựng của mô hình QSAR trung gian 64

Bảng 3.8 Các giá trị đánh giá trên tập ngoại của mô hình QSAR trung gian 65

Bảng 3.9 Mô hình QSAR hoàn chỉnh từ toàn tập dữ liệu và các giá trị đánh giá 66

Bảng 3.10 Kết quả sàng lọc cơ sở dữ liệu với 5-lipinski và pharmacophore B01 68

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá ADME 69

Bảng 3.12 Kết quả docking của 9 hợp chất có khả năng gắn kết tốt với thụ thể HT6 từ thư viện ChemDiv và Drugbank 71Bảng 3.13 Kết quả dự đoán hoạt tính của 9 chất gắn kết tốt với thụ thể 5-HT6 74Bảng 3.14 So sánh mô hình pharmacophore B01 với mô hình pharmacophore từcác nghiên cứu khác 78Bảng 3.15 Mô hình 2D-QSAR từ các nghiên cứu khác 80

5-DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế sinh hóa thông qua thụ thể 5-HT6 5

Hình 1.2 Cấu trúc của chất đối vận thụ thể 5-HT6: SB-271046 và SB-399885 7

Hình 1.3 Cấu trúc của chất chủ vận thụ thể 5-HT6: WAY-181187 7

Hình 2.1 Các vị trí gắn kết trên cấu trúc tương đồng của thụ thể 5-HT6 được xác định bằng Site Finder của phần mềm MOE 22

Hình 2.2 Cấu trúc các chất thuộc “Tập xây dựng”: SYN-120, SUVN-502, Intepirdin 26

Hình 2.3 Cấu trúc các chất thuộc “Tập xây dựng”: Idalopidin, AVN-322 27

Hình 2.4 Giao diện công cụ SwissADME 32

Hình 2.5 Minh họa mô hình BOILED-Egg 33

Hình 2.6 SwissADME synthesis accesibility score được chia làm 3 mức 35

Hình 2.7 Các bước xây dựng mô hình 2D-QSAR 37

Hình 2.8 Loại chất gây nhiễu bằng phương pháp phân tích thành phần chính 42

Hình 2.9 Quy trình sàng lọc tìm các chất đối vận 5-HT6 có tiềm năng điều trị AD 47

Hình 3.1 Kết quả gióng hàng dựa trên trình tự và cấu trúc của thụ thể 5-HT6 xây dựng được với 5-HT2A (6A94) và 5-HT2B (4IB4) 50

Hình 3.2 Mô hình thụ thể 5-HT6 được xây dựng bằng server I-TASSER 50

Hình 3.3 Vị trí docking tại khoang trung tâm và túi gắn kết của SUVN-502 51

Hình 3.4 Biểu đồ thống kê điểm số docking của 100 chất có hoạt tính mạnh 53

Hình 3.5 Tần suất tạo tương tác của các acid amin tại khoang gắn kết với 100 chất có hoạt tính mạnh 54

Hình 3.6 Tương tác của AVN-322, SYN-120, Intepirdin và SUVN với khoang gắn

kết trên thụ thể 5-HT6 55

Hình 3.7 Các pharmacophore được xây dựng bằng phương pháp cơ bản 56

Hình 3.8 Pharmacophore xây dựng bằng phương pháp sử dụng cấu dạng ligand gắn kết với đích tác động 58

Hình 3.9 Sơ đồ mô tả tóm tắt phương pháp xây dựng mô hình 3D-pharmacophore dựa vào cấu dạng docking so với phương pháp cơ bản 59

Hình 3.10 Sự tương đồng giữa pharmacophore và các chất trong “Tập xây dựng” 60 Hình 3.11 Cấu trúc và tương tác của Idalopirdin với khoang gắn kết trên 5-HT6 61

Hình 3.12 Khoang gắn kết của 5-HT6 chứa SUVN-502: A Túi gắn kết nhìn từ bên ngoài; B Bên trong túi gắn kết 62

Hình 3.13 Đồ thị tương quan giá trị pKi thực nghiệm và pKi dự đoán từ mô hình QSAR hoàn chỉnh của toàn tập dữ liệu 66

Hình 3.14 Biểu đồ thống kê điểm số docking của 47 chất docking thành công vào khoang gắn kết của thụ thể 5-HT6 70

Hình 3.15 Phân tích FLIP của 47 hợp chất docking thành công vào khoang gắn kết của thụ thể 5-HT6 70

Hình 3.16 Sự gắn kết của S824-2332 với thụ thể 5-HT6 71

Hình 3.17 Sự gắn kết của E002-0772 với thụ thể 5-HT6 72

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của S617-0323 và S823-4333 72

Hình 3.19 Kết quả phân tích PCA giữa tập dữ liệu dùng xây dựng mô hình QSAR và “TẬP 49” 73

Hình 3.20 Cấu trúc 6 chất được dự đoán có hoạt tính mạnh bằng mô hình 2D-QSAR 75

Hình 3.21 Kết quả ứng dụng các mô hình in silico trên ChemDiv và Drugbank 76

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gởi lời cảm ơn đến Thầy PGS.TS Thái Khắc Minh.Thầy đã tận tình dìu dắt em từ khi chập chững tìm hiểu về thiết kế thuốc ở lớp đạihọc cho đến thời điểm hoàn thành luận văn cao học này Thầy luôn hết lòng giảnggiải, hướng dẫn để em hiểu rõ và thực hiện tốt đề tài của mình

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến anh Đồng Quốc Hiệp, đã không ngại dùtrong giờ làm việc hay khi cuối tuần đều dành thời gian quan tâm, hướng dẫn emmỗi khi em cần

Em cũng xin cảm ơn anh Mai Thành Tấn và Quang Đạt đã hỗ trợ em nhiều trongquá trình hoàn thành đề tài này

Em xin cảm ơn quý Thầy Cô trong hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian xembài và nhận xét chỉnh sửa để luận văn của em hoàn thiện hơn

Đối với em, thời gian học tập tại Khoa Dược - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh là

kỷ niệm đẹp không thể nào quên Và cũng từ nơi này, em có những người Thầy,những người anh và người bạn tuyệt vời nhất

Cuối cùng con xin gởi lòng kính trọng và cảm ơn đến gia đình và anh Thân, nhữngngười luôn bên cạnh và yêu thương con

MỞ ĐẦU

Phát triển thuốc mới là một quá trình lâu dài và tốn kém Bên cạnh việc xác định

chất khởi nguồn, tổng hợp dẫn chất có hoạt tính, thử nghiệm in vitro, in vivo; các

dẫn chất còn phải thử nghiệm lâm sàng kéo dài nhiều năm và khả năng thất bại ởbước này là rất cao Theo ước tính, chi phí để đưa một thuốc mới ra thị trường cóthể vượt 800 triệu đô la Mỹ [18] Vì vậy, các phương pháp sàng lọc ảo ra đời như làmột công cụ đắc lực cho quá trình khám phá thuốc mới, giúp tiết kiệm thời gian vàchi phí [24]

Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh lý về não gây suy giảm trí nhớ không những ảnhhưởng đến công việc mà còn cả sinh hoạt cuộc sống hằng ngày của người bệnh lẫnngười thân, người chăm sóc Tốc độ gia tăng số lượng bệnh nhân mắc AD theo thờigian và số lượng bệnh nhân tử vong vì AD đang là gánh nặng của toàn cầu

Hiện nay chỉ có hai nhóm thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc của

Mỹ (FDA) chấp thuận để điều trị triệu chứng AD là thuốc ức chế cholinesterase vàchất đối vận thụ thể N-methyl-D-aspartic Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của cả hainhóm thuốc này vẫn còn hạn chế và đi kèm nhiều tác dụng phụ [39] Do đó đặt ranhu cầu cần các thuốc mới có hiệu quả điều trị cao hơn và ít tác dụng phụ hơn.Gần đây, sự đối vận thụ thể 5-HT6 đã xuất hiện như một liệu pháp điều trị mới đểcải thiện nhận thức của người AD Thụ thể 5-HT6 hầu như chỉ được tìm thấy ở hệthần kinh trung ương (TKTW), vì vậy việc đối vận thụ thể này có thể ít gây ra cáctác dụng phụ ngoại biên [46] Đã có 16 cấu trúc được thực hiện các thử nghiệm lâmsàng chứng minh tính hiệu quả - an toàn trong điều trị AD, trong đó có 4 cấu trúcđược tiến hành đến các thử nghiệm pha 3 (Idalopirdin, Intepirdin, Latrepirdin vàSUVN-502)

“Nghiên cứu in silico trên các chất đối vận thụ thể 5-hydroxytryptamin 6 trong điều

trị bệnh Alzheimer” được thực hiện với mục tiêu tổng quát là dự đoán thuốc có tiềmnăng phát triển điều trị AD với cơ chế đối vận thụ thể 5-HT6 từ tập cơ sở dữ liệucủa ChemDiv và Drugbank

Trong đó, các mục tiêu cụ thể bao gồm:

i Đánh giá và lựa chọn thụ thể mẫu thích hợp để xây dựng mô hình mô phỏng cấutrúc tương đồng của thụ thể 5-HT6

ii Xây dựng mô hình mô phỏng cấu trúc tương đồng của thụ thể 5-HT6 dựa vào kỹthuật mô tả tính tương đồng

iii Xây dựng các mô hình in silico (bao gồm mô hình mô tả phân tử docking, mô

hình 3D-pharmacophore và mô hình 2D-QSAR) dựa trên cấu trúc phối tử đối vậnthụ thể 5-HT6

iv Sàng lọc cơ sở dữ liệu ChemDiv và Drugbank qua các mô hình in silico để bước

đầu tìm ra các chất có tiềm năng đối vận thụ thể 5-HT6

Các mục tiêu này được thực hiện thành công sẽ giúp tiết kiệm thời gian và chi phítrong con đường tìm kiếm chất có triển vọng phát triển thành thuốc điều trị bệnhAlzheimer

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH ALZHEIMER

Bệnh Alzheimer là một bệnh lý về não tác động đến trí nhớ, suy nghĩ và hành vi

AD không phải là bệnh lão khoa thông thường hoặc bệnh thần kinh, mà là một dạngcủa hội chứng suy giảm trí nhớ Hội chứng suy giảm trí nhớ là thuật ngữ tổng quát

về việc mất trí nhớ và các khả năng tư duy nghiêm trọng đến nỗi gây trở ngại chocuộc sống thường ngày AD là dạng phố biến nhất, chiếm khoảng 60% đến 80%những bệnh làm suy giảm trí nhớ [58] Hiện nay có khoảng 56 triệu bệnh nhân đangchung sống với AD trên toàn cầu và con số này sẽ tăng liên tục mỗi năm khi tỉ lệdân số ở độ tuổi trên 65 tiếp tục gia tăng Ước tính trước năm 2050 sẽ có 88 triệubệnh nhân mắc AD [57] AD không chỉ người bệnh mà cả người chăm sóc ngườibệnh cũng bị ảnh hưởng Chăm sóc người AD thường rất khó khăn và nhiều giađình hoặc bạn bè giúp trông nom người bệnh đã phải trải qua những cảm xúc vôcùng căng thẳng, có thể dẫn đến trầm cảm [58] AD trầm trọng hơn theo thời gian

và cuối cùng gây tử vong, thống kê năm 2017 cho thấy AD là nguyên nhân dẫn đến

tử vong xếp hạng thứ 6 [57] Cho đến nay, cơ chế sinh lý bệnh của AD vẫn chưađược giải thích một cách chính xác, giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết liên quan

hệ thống dẫn truyền thần kinh bằng acetylcholin (cholinergic) - giả thuyết này là cơ

sở của các thuốc sử dụng trong điều trị AD hiện tại Bên cạnh đó, một giải thuyếtđược chú ý gần đây là sự thoái hóa thần kinh liên qua đến stress oxy hóa và viêmthần kinh do việc tích tụ của các mảng bám hình thành từ protein β-amyloid và cácđám rối sợi thần kinh (hình thành từ các protein tau bất thường) trong não [7] Biểuhiện lâm sàng của AD ở người bệnh có thể rất khác nhau, nhưng vấn đề đầu tiên mànhiều người nhận thấy là tính hay quên nghiêm trọng, bao gồm lú lẫn, đi lạc ởnhững nơi quen thuộc, để đồ đạc không đúng chỗ, gặp khó khăn khi nói và viết[58]

Hiện nay vẫn chưa có liệu pháp điều trị chấm dứt và ngăn chặn tiến triển AD,những phương pháp điều trị hiện tại chỉ có thể tạm thời làm chậm các triệu chứng sa

sút trí tuệ và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người AD và những người chămsóc họ [58] Chỉ có hai nhóm thuốc hiện đang được FDA chấp thuận để điều trị triệuchứng AD là thuốc ức chế cholinesterase (donepezil, rivastigmine, galantamine) vàchất đối vận thụ thể N-methyl-D-aspartic (memantine) Đích tác động của hai nhómthuốc này là các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine và glutamate Tuy nhiên,hiệu quả điều trị suy giảm nhận thức cho bệnh nhân AD của hai nhóm thuốc nàyvẫn còn hạn chế, phụ thuộc nhiều vào sự phát hiện sớm bệnh, đi kèm tác dụng phụtrên hệ tiêu hóa, chậm nhịp tim, sụt cân, đau đầu và kích động [39] Vì bệnh nhân

AD là những người lớn tuổi nên các tác dụng phụ này cũng là một rào cản của việc

sử dụng thuốc Do đó đặt ra nhu cầu cần các thuốc khác có hiệu quả điều trị cao hơn

và ít tác dụng phụ hơn

1.2 THỤ THỂ 5-HYDROXYTRYPTAMIN 6

1.2.1 Cơ chế sinh hóa thông qua thụ thể 5-hydroxytryptamin 6

Thụ thể 5-HT6 là một phân nhóm thụ thể thuộc họ thụ thể serotonin (hay còn gọi là

họ thụ thể 5-hydroxytryptamin), được phát hiện vào năm 1993 Họ thụ thể serotoningồm ít nhất 16 loại thụ thể khác nhau và được phân thành 7 phân nhóm: từ 5-HT1đến 5-HT7 dựa trên cơ chế hoạt động của chúng 5-HT6 là phân nhóm thụ thể đặcbiệt nhất trong họ vì mức độ tương đồng trình tự so với các thụ thể serotonin kháctương đối thấp (<50%) Bên cạnh đó, 5-HT6 còn có đặc tính biểu hiện chuyên biệt

và có nhiều con đường truyền tín hiệu tế bào trong hệ TKTW

Gen thụ thể 5-HT6 đầu tiên được nhân bản ở chuột đã mã hóa cho chuỗi proteingồm 438 acid amin và sau đó được xác định chính xác ở người gồm 440 acid amin

Cơ chế truyền tín hiệu của 5-HT6 được minh họa bằng hình 1.1, bao gồm:

- Cơ chế chung của thụ thể họ GPCR: (i) kích thích hoạt động của adenylyl cyclase

làm gia tăng giải phóng adenosin monophosphat vòng (cAMP) - chất truyền tin thứhai, nồng độ của cAMP còn có thể được dùng để phân loại các phối tử có hoạt tính

chủ vận hoặc đối vận thụ thể 5-HT6 (ii) Thông qua kênh Fyn-Tyrosin kinas, (iii)

- Cơ chế truyền tín hiệu độc lập với họ protein G: (i) điều hòa tín hiệu ngoại bào bởikinase 1/2 (ERK 1/2), con đường này đóng vai trò trong sự tăng sinh tế bào, sự sống

và chết tế bào, (ii) thông qua kích hoạt Jun, (iii) và cuối cùng là con đườngrapamycin (mTOR), có vai trò quan trọng trong sự phát triển thần kinh [15]

Hình 1.1 Cơ chế sinh hóa thông qua thụ thể 5-HT6 [29]

Thụ thể 5-HT6 được biểu hiện sớm trong quá trình phát triển não bộ và mARN của

nó được tìm thấy với mật độ cao nhất trong ống khứu giác, vỏ não trước, phầnvỏnão phụ trách khướu giác (entorhinal cortex), hải mã lưng, nhân cạp và ở vùng vân.Mật độ thấp hơn được quan sát thấy ở vùng dưới đồi, hạch hạnh nhân (amygdala)

và vùng đặc chất đen (substantia nigra) Chỉ có hai nghiên cứu cho thấy sự hiện diệncủa mARN thụ thể 5-HT6 trong các tế bào máu ngoại biên, nhưng không có vai tròchức năng nào liên quan đến các thụ thể 5-HT6 ở vị trí này Các nghiên cứu hóamiễn dịch cũng đã chứng minh sự biểu hiện của thụ thể 5-HT6 bị hạn chế ở hệ thầnkinh cholinergic có liên quan với hệ GABA (acid gamma-aminobutyric) vàglutamate [15], [29] Do đó, các thụ thể 5-HT6 dường như biểu hiện khu trú trongcác vùng não tham gia vào quá trình học tập và ghi nhớ Bởi vì sự biểu hiện chuyên

biệt này nên các chất chủ vận hoặc đối vận thụ thể 5-HT6 ít gây ra kết quả tác động

ở ngoại biên

Các chất đối vận thụ thể 5-HT6 tạo hiệu quả cải thiện nhận thức bằng cơ chế tăngglutamat, giảm GABA trong các mạch thần kinh khác nhau và tạo điều kiện giảiphóng các chất dẫn truyền thần kinh khác như dopamin, norepinephrin vàacetylcholin - vốn bị thiếu hụt trong bệnh lý AD SB-271046, một chất đối vận thụthể 5-HT6, được chứng minh làm tăng nồng độ ngoại bào của glutamat ở hồi hải mã

và vỏ não trước lên gấp 2-3 lần và tác động này không bị đảo ngược khi sử dụngatropine, điều đó chứng minh sự kích thích dẫn truyền thần kinh bởi SB-271046không phải là kết quả của sự kích thích dẫn truyền thần kinh cholinergic [29], [46].Một điều thú vị là kết quả từ nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, không chỉ chấtđối vận mà ngay cả chất chủ vận thụ thể 5-HT6 cũng có thể tăng cường khả năngnhận thức nhưng cơ chế đằng sau phát hiện nghịch lý này chưa được hiểu rõ WAY-

181187, chất chủ vận thụ thể 5-HT6, được chứng minh làm tăng nồng độ GABAngoại bào ở vỏ não chuột mà không ảnh hưởng đến nồng độ chất dẫn truyền thầnkinh khác như glutamat, serotonin, norepinephrin hoặc dopamin, trong khi chất đốivận thụ thể 5-HT6 làm tăng nồng độ ngoại bào của glutamat, acetylcholin, vànorepinephrin tại những vùng khác nhau của não Chất chủ vận thụ thể 5-HT6 còncho thấy tác động ức chế sự dẫn truyền của hệ glutamatergic tại mạng lướicorticostriatal (khu vực kết nối đến khả năng nhận thức về kết quả để kiểm soáthành vi ở não) Ngoài ra, các phối tử thụ thể 5-HT6 còn được cho là có tác độngđiều chỉnh độ mềm dẻo của khớp nối thần kinh (synaptic plasticity) và có tác độngtại hồi hải mã: tại trường CA1 của đồi hải mã WAY-181187, làm tăng tần số củaxung thần kinh ức chế sự giải phóng tự phát của nơ-ron nhận; hiệu ứng này bị chặnbởi chất đối vận SB-399885, ngăn cản sự gia tăng tần số của xung thần kinh trên.Trên động vật gặm nhấm, chất chủ vận thụ thể 5-HT6, LU-586713 tăng cường biểuhiện mRNA của yếu tố dinh dưỡng thần kinh xuất phát từ não (BDNF, brain-derived neurotropic factor) thuộc hồi hải mã và protein ARC (Activity-Regulated

và hồi hải mã Nhưng các tác động đến sự nhận thức của LU-586713 lại bị chặn bởichất đối vận SB-271046 Điều này cho thấy sự chủ vận thụ thể 5-HT6 có thể kíchhoạt một cơ chế sinh hóa nào đó chưa được biết dẫn đến điều nghịch lý này Mộtgiả thuyết khác để giải thích cho việc cả chất chủ vận và chất đối vận đều có đặctính tăng cường nhận thức là hai nhóm chất này tác động lên các thụ thể nằm trêncác quần thể nơ ron khác nhau [46] Cấu trúc hóa học của chất đối vận SB-271046,SB-399885 và chất chủ vận WAY-181187 lần lượt được trình bày tại hình 1.2 vàhình 1.3.

Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng hiện nay, trên cả độngvật và người được thực hiện với các chất đối vận thụ thể 5-HT6 Do đó, mục tiêucủa nghiên cứu chỉ tập trung vào chất đối vận thụ thể 5-HT6 trong điều trị AD Cấutrúc thụ thể 5-hydroxytryptamin 6

Trong họ thụ thể GPCR thì 5-HT6 là protein bảy vực xuyên màng cổ điển (7TM) vàcác domain này được kết nối với nhau bằng ba vòng bên trong (internal loop) và bavòng bên ngoài (external loop) [16] Cho đến nay cấu trúc tinh thể của 5-HT6 vẫnchưa được xác định nên các nghiên cứu về gắn kết phối tử - thụ thể 5-HT6 đều đượcthực hiện trên các mô hình mô phỏng cấu trúc tương đồng Các cấu trúc tương đồngđược xây dựng dựa trên cấu trúc kết tinh đã biết của các thụ thể khác trong cùngphân nhóm 5-HT như thụ thể 5-HT1B[7], 5-HT2B[38] Dựa trên lập luận trình tựcủa thụ thể 5-HT6 tương đồng kém với các phân nhóm thụ thể khác trong họ 5-HTnên đa phần các nghiên cứu lại dựa trên các cấu trúc GPCR khác như rhodopsin(sắc số nhạy cảm với ánh sáng tại võng mạc mắt) [19], [30], [44] hoặcadrenoreceptor (β2-adrenegic G protein-coupled receptor) [28], [36] Đến nay chưa

có nghiên cứu nào so sánh các mô hình tương đồng được xây dựng và chưa có tàiliệu nào công bố cấu trúc tương đồng của 5-HT6 được xây dựng dựa trên cấu trúcprotein nào là tối ưu

1.2.2 Các khung cấu trúc có cơ chế đối vận thụ thể 5-HT6 đang được

nghiên cứu trong điều trị AD

Cơ chế đối vận thụ thể 5-HT6 là một trong các đích tác động có tiềm năng nhất vì

có nhiều chất được các công ty dược tiến hành chương trình thử nghiệm lâm sàngnhất Bảng 1.1 tóm tắt các khung cấu trúc đang được nghiên cứu và bảng 1.2 tổnghợp các chất đối vận thụ thể 5-HT6 đang được tiến hành nghiên cứu về khả năng cảithiện sự nhận thức, trí nhớ và điều trị bệnh AD

Bảng 1.1 Các khung cấu trúc đối vận 5-HT6 đang được thử nghiệm lâm sàng STT Nhân cấu trúc Số lượng chất được đưa vào thử nghiệm lâm sàng

Bảng 1.2 Chất đối vận thụ thể 5-hydroxytryptamin 6 đã được tiến hành thử nghiệm

lâm sàng trong điều trị bệnh Alzheimer [40], [46]

Tiền lâm sàng SAM-315, AVN-216, BVT-74316, 11C-LuAE60157, 11

C-GSK215083 (cấu trúc chưa được công bố), AND-1184,

SB-258585, Ro 4368554, SB-357134, SB-399885, SB-214111,SB-699929, Ro 63-0553, Ro 04-6790, MS-245, Ro 66-0074,CMP X

Pha 1 PRX-07034, ABT-354 (cấu trúc chưa được công bố),

SYN-114, SB-271046, R-1485, AVN-322Pha 2 AVN-101, AVN-211 (CD-008-0173), SAM-760 (PF-

05212377, WYE-103760), SGS-518 (Ly 483518), SYN-120(landipirdin), PF-05212365 (SAM-531, cerlapirdin)

Pha 3 Idalopirdin (LuAE58054, SGS518, LY483518)

Intepirdin (SB-742457, RVT-101, GSK-742457)Latrepirdin (Dimebon, dimebolin, PF-01913539)SUVN-502

1.3 CÁC ĐÍCH TÁC ĐỘNG KHÁC ĐANG ĐƯỢC NGHIÊN CỨU TRONG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER

Ngoài hai đích tác động có các thuốc đang được FDA chấp thuận trong điều trị AD(ức chế cholinesterase, đối vận thụ thể N-methyl-D-aspartic) và đối vận thụ thể 5-HT6 đang được nghiên cứu, thì còn có các đích tác động tiềm năng khác đang đượcnhắm đến để tìm kiếm một thuốc mới trong điều trị AD [21]:

- Chủ vận thụ thể muscarinic: một số cấu trúc đã thực hiện các thử nghiệm lâm sàngRCT pha 1 (ví dụ: talsaclidin, AF-102B, AF267B), đã bị ngừng bởi tác dụng phụ dokích thích cholinergic ngoại biên gây ra

- Chất chủ vận thụ thể nicotinic (điều biến các thụ thể nicotinic α7, α2β2, α4β2,α6β2), tác dụng lên một số chất dẫn truyền thần kinh (acetylcholin, dopamin,noradrenalin, GABA, glutamat):

+ AZD-3480 (điều biến thụ thể nicotinic α4β2, α2β2): không chứng minh được hiệuquả trong các thử nghiệm RCT pha 2 kéo dài 3 tháng trên 567 bệnh nhân AD mức

+ MK-7622 (điều biến thụ thể α7): đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng pha 2b, 12đến 24 tuần trên 640 bệnh nhân AD mức độ nhẹ - trung bình (nghiên cứu dò liều).

- Chủ vận thụ thể N-methyl-D-aspartat: Memantine (hiệu quả trên AD mức độ trungbình - nặng, không hiệu quả ở mức độ nhẹ), DAOI-B (chất tăng cường NMDA),AVP-923 (dextromethorphan / quinidin)

- Ức chế monoamin oxidase (tăng cường hoạt tính hệ serotoninergic, noradrenergic

và chức năng của dopamin):

+ Selegilin: phân tích tổng hợp từ 17 nghiên cứu RCT bao gồm 1143 bệnh nhân ADmức độ trung bình - nặng, thời gian từ 3 đến 105 tuần cho thấy một số tác dụng tíchcực nhưng nhìn chung không có lợi ích ý nghĩa thống kê

+ RO4602522 (EVT 302): đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng RCT pha 2 trên 495bệnh nhân AD mức độ trung bình trong 1 năm

- Tác động đa hướng đích : Ladostigil (TV-3326) là dẫn chất của rasagiline vàrivastigmine, hoạt động như một chất ức chế cholinesterase và ức chế monoaminoxidase - có đặc tính chống oxy hóa, điều chỉnh quá trình xử lý APP (protein tiềnchất amyloid), đang được tiến hành thử nghiệm lâm sàng RCT pha 2 trên bệnh nhânsuy giảm nhận thức nhẹ (thời gian 3 năm, 200 bệnh nhân) và AD mức độ nhẹ -trung bình (26 tuần + 26 tuần mở nhãn, 188 người bệnh nhân)

- Anti-amyloid β (Aβ) : Aβ là thành phần chính của các mảng suy thoái do tuổi ởbệnh nhân AD, được cho là đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của

AD, do đó Aβ cũng đang là mục tiêu được nghiên cứu để điều trị AD Liệu phápmiễn dịch Aβ trên mô hình động vật và bệnh nhân AD ở người đã được chứng minh

là tạo ra kháng thể chống Aβ, giảm nồng độ Aβ trong não và trong một số nghiêncứu ổn định hoặc cải thiện nhận thức Mục tiêu của sử dụng liệu pháp miễn dịch Aβchủ động là tạo ra vắc xin lâu dài, an toàn và hiệu quả về chi phí để giảm Aβ trongnão và / hoặc ngăn chặn sự kết tụ Aβ Mục tiêu của chủng ngừa Aβ thụ động làgiảm Aβ trong não một cách an toàn thông qua việc tiêm kháng thể hàng tháng.Mục tiêu cuối cùng của cả hai loại vắc-xin này là ngăn ngừa hoặc làm giảm tác

động của Aβ lên khớp thần kinh và tế bào thần kinh, do đó mang lại lợi ích về nhậnthức Nhiều thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp miễn dịch Aβ chủ động và thụ độnghiện đang được tiến hành.

- Anti-tau: ức chế sự sản xuất protein tau (nhóm ức chế GSK-3 là giảm sựphosphoryl hóa tau : Lithium, Valproat), ngăn cản sự lắng đọng protein tau(Methylene blue, Davunetid)

1.4.1.2 Xây dựng mô hình tương đồng của thụ thể 5-HT6 bằng I-Tasser

I-TASSER server là một dịch vụ internet có khả năng dự đoán cấu trúc và chứcnăng từ trình tự acid amin của protein và một số thông tin liên quan do người dùngtải lên Để xây dựng cấu trúc 3D và dự đoán chức năng sinh học của một protein, I-TASSER server tiến hành 4 bước sau:

- Khi trình tự acid amin của protein được tải lên, server sẽ tìm các protein có nếpgấp tương đồng làm mẫu từ ngân hàng PDB (Protein Data Bank) bằng dịch vụ dựđoán cấu trúc protein trên internet LOMETS (Local Meta Threading Server)

- Các phân mảnh protein mẫu được tập hợp lại thành các mô hình đầy đủ bằng bảnsao trao đổi Monte Carlo Trong trường hợp LOMETS không xác định được protein

mẫu tương ứng, server sẽ xây dựng toàn bộ cấu trúc của mô hình ab intio Các vùng

có năng lượng tự do thấp thường được xác định bởi SPICKER (một thuật toán phânnhóm để xác định các mô hình gần như nguyên bản từ rất nhiều các cấu trúc mồiprotein)

- Các mảnh được lắp ráp lại dựa trên mô phỏng được thực hiện lại lần nữa dựa trêntrung tâm các cụm SPICKER Các mồi được tạo ra trong lần 2 này được nhóm lại

và chọn lấy cấu trúc có năng lượng thấp nhất Cấu trúc protein cuối cùng được xâydựng bằng thuật toán REMO Thuật toán này tạo ra một protein hoàn chỉnh dựa trêndấu vết từ C-alpha bằng cách tối ưu hóa mạng lưới hydro

- Để dự đoán chức năng sinh học của protein, server so sánh mô hình protein đượcxây dựng với 3 thự viện độc lập bao gồm: EC (Enzyme Classification), GOvocabulary (Gene Ontology), ligand-binding sites Kết quả về dự đoán chức năngcuối cùng được rút ra từ sự đồng thuận của các cấu trúc mẫu khớp nhất dựa trên C-score (confidence score-điểm số tin cậy), TM-score (template modeling score-điểm

số tương đồng giữa mô hình và khuôn mẫu) và trình tự nhận dạng trong các khu vực

có cấu trúc liên kết [47]

1.4.1.3 Tìm vị trí gắn kết

Công cụ Site Finder của MOE được sử dụng với mục đích tính toán các vùng gắnkết có khả năng xảy ra trên một thụ thể dựa trên các tọa độ không gian 3D của cácnguyên tử cấu tạo nên thụ thể Thay vì sử dụng các loại mô hình mô phỏng nănglượng, Site Finder sử dụng phương pháp hình học được mô tả theo trình tự như sau[53]:

- Tạo ra các khối cầu alpha trên vùng tác động bằng cách kết nối các điểm 3D đãxác định trên vùng tác động.

- Loại bỏ các khối cầu alpha tương ứng với vùng khó tiếp cận hoặc vùng dễ tiếp xúcvới dung môi, chỉ những khối cầu alpha có kích thước nhỏ được giữ lại vì nhữngkhối này tương ứng với các vùng có sự gắn kết chặt chẽ các nguyên tử

- Phân loại khối cầu alpha vào nhóm kỵ nước hay thân nước

- Nhóm các khối cầu alpha để tạo ra vùng tác động Mỗi vùng tác động có thể baogồm một hay nhiều khối cầu alpha trong đó có ít nhất một khối thuộc nhóm kỵnước

1.4.2 Mô hình mô tả phân tử docking

1.4.2.1 Định nghĩa

Docking là phương pháp thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc mục tiêu tác động, nghiêncứu gắn kết của một hay nhiều phân tử hợp chất (phối tử) vào mô hình điểm gắn kết(binding site, active site) của protein, enzym, DNA… trong không gian ba chiều.Docking tìm các tương tác giữa phân tử hợp chất và điểm tác động theo 3 hướng:

- Xem hợp chất và protein đều là những phân tử cứng (docking cứng)

- Xem hợp chất là những phân tử linh động (docking bán linh động)

- Xem hợp chất và protein đều linh động (docking linh động hoàn toàn), nhưng tínhlinh động chỉ giới hạn ở những chuỗi bên đặc trưng nào đó của điểm gắn kết

Phương pháp được sử dụng phổ biến là docking bán linh động Các phần mềmdocking như Gold, FlexX, Dock, AutoDock sử dụng docking bán linh động

1.4.2.2 Docking bằng phần mềm LeadIT 2.1

Trong nghiên cứu này, phần mềm FlexX được tích hợp sẵn trong LeadIT 2.1, được

sử dụng để dự đoán tương tác protein-phối tử Đối với một phức hợp protein-phối

tử, FlexX sẽ dự đoán cấu trúc hình học cũng như ước lượng độ mạnh của liên kết

[8] Trong phiên bản FlexX, protein được giả định cứng nhắc, vì vậy protein phảiđược xuất dưới dạng tương tự như trạng thái gắn kết tự nhiên Các thuật toándocking trong FlexX thường làm việc mà không cần sự can thiệp thủ công Nhưvậy, FlexX là lý tưởng cho việc docking protein-phối tử, cũng như để sàng lọc mộttập hợp lớn của các phối tử để tìm ra những chất mới tiềm năng cho thiết kế thuốc.Thuật toán trong FlexX được xây dựng từ nhiều kỹ thuật thuận lợi cho việc thiết kếthuốc Những mảnh vỡ cơ sở được lựa chọn tự động và đặt vào vùng hoạt độngbằng cách sử dụng những thuật toán dựa trên kỹ thuật nhận diện mẫu được gọi làtạo ra vùng cụm Tiếp theo, phần còn lại của phối tử được xây dựng từng bước từnhững mảnh vỡ khác Mảnh vỡ mới ở tất cả các cấu dạng sẽ được đặt vào vị trí đãđược tìm thấy trước đó nhưng chỉ có vị trí tốt nhất mới được tiến hành bước tiếptheo phương pháp GROW.

Vị trí của phối tử được đánh giá thông qua tương tác protein-phối tử Cuối cùng,năng lượng liên kết được tính toán và dùng để đánh giá những vị trí gắn kết này [7]

1.4.3 Mô hình 3D-pharmacophore

Pharmacophore (nhóm quyết định tác dụng sinh học) bao gồm tất cả các yếu tốkhông gian (steric) và điện tử (electron) cần thiết để đảm bảo cho sự tương tác củaphân tử hợp chất với cấu trúc của điểm tác động sinh học chuyên biệt và kích thích(hay ức chế) đáp ứng sinh học của điểm tác động này Một pharmacophore khôngđại diện bởi một phân tử cụ thể hoặc nhóm chức cụ thể nào nhưng khái niệm nàydùng để mô tả các cấu trúc có khả năng liên kết của một nhóm hoạt chất lên điểmtác động Pharmacophore có thể được xem như là mẫu số chung lớn nhất của cáccấu trúc có tác dụng sinh học (cấu trúc hiện diện ở tất cả các phân tử có hoạt tính).Pharmacophore được mô tả bằng các yếu tố có khả năng tạo liên kết hydro (cho vànhận), khả năng kỵ nước, khả năng tích tĩnh điện và được xác định bằng các nguyên

tử, các vòng, các điểm giả định (Virtual points)

Mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng bằng công cụ xây dựng pharmacophore

tự động Pharmacophore Elucidation trong MOE 2015 bằng cách sử dụng các cấu

dạng vừa tìm được để tạo ra các truy vấn (pharmacophore query) có sự chồng phủtốt với hầu hết các phân tử hợp chất trong tập xây dựng Do đó, tính hợp lý của môhình pharmacophore được đo bởi sự chồng phủ các phân tử có hoạt tính (cách thứcgắn kết phổ biến) và mối tương quan với hoạt tính sinh học Hoạt tính đối với mộtđiểm tác động sinh học được xác định bởi nhiều nhân tố tác động solvat hóa,entropy, enthalpy, do đó các so sánh về pharmacophore không đủ để dự đoán hoạttính.

Về nguyên tắc, để xây dựng mô hình 3D-pharmacophore cần đưa vào một tập hợp

dữ liệu N phân tử với Ci cấu dạng N1 là số phân tử có hoạt tính N0 là số phân tửkhông hoạt tính Chương trình Pharmacophore Eclucidator sẽ tạo các truy vấnpharmacophore liên quan tới ít nhất n phân tử có hoạt tính Do đó, mỗi truy vấn tạo

ra sẽ có độ chồng phủ n (n thường là 80-90% của N1) Các truy vấn pharmacophorelớn hơn được xây dựng từ các truy vấn pharmacophore nhỏ hơn

Các thông số sử dụng:

- Độ chồng phủ hoạt tính (Active coverage): nghiên cứu sử dụng hai giá trị 0,9 và0,8; tương ứng với việc truy vấn pharmacophore phải liên quan đến tối thiểu lầnlượt là 90% và 80% trong tổng số các phân tử đưa vào

- Giới hạn số yếu tố (Feature Limit): sử dụng thông số mặc định là 5

- Phân cụm truy vấn (Query Cluster): sử dụng giá trị mặc định là 1,25 Giá trị này

có ý nghĩa sau khi các truy vấn được tạo ra, nếu có hai truy vấn bất kỳ có RMSDdưới 1,25 Å thì hai truy vấn đó sẽ được lấy giá trị trung bình Chức năng này làmgiới hạn số lượng các truy vấn gần giống nhau, tạo điều kiện cho các bước xử lýtiếp theo được dễ dàng

Ứng dụng của mô hình 3D-pharmacophore là tìm những phân tử hợp chất có hoạttính từ cơ sở dữ liệu cấu trúc 3D dựa vào mô hình pharmacophore, giúp cho quátrình thiết kế thuốc hợp lý Mô hình pharmacophore có thể được xây dựng bằngnhiều cách như:

- Suy ra từ một hợp chất gắn kết đã biết.

- Suy ra từ một dãy các phân tử hợp chất có hoạt tính không giống nhau

- Phân tích trực tiếp cấu trúc của mục tiêu tác động (protein)

Các thông tin dùng để mô tả mô hình pharmacophore:

+ Cover: Số phân tử có hoạt tính liên quan đến mô hình

+ Overlap: Độ chồng phủ

+ Accuracy: Độ chính xác

+ Size: Tổng số các yếu tố trong mô hình

+ Acc: Ký hiệu của trung tâm nhận liên kết hydro, đại diện cho các nguyên tố O, N,

S, ngoại trừ S=C, S-, =N=, >N<, >N-π, >N-C+, >N-S=O, >N-P=O, =O=, >O=,

+ Hyd: Ký hiệu của nhóm kỵ nước

1.4.4 Mối quan hệ định lượng giưa cấu trúc và tác dụng - QSAR

Mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng (Quantative Structure - ActivityRelationship, QSAR) là một quá trình mang tính định lượng mối liên hệ giữa cấutrúc, tính chất hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất Từ đó tìm ra nhữngquy luật tương quan để đánh giá hoạt tính sinh học của những hợp chất mới

Công việc của QSAR là xác định được những tham số C0, C1,…, Cn trong phươngtrình:

- Hoạt tính sinh học (Biological activity) = C0 + (C1*P1) +…+ (Cn*Pn)

- Với sai số dự đoán là nhỏ nhất cho một tập dữ liệu có sẵn.

Phương pháp được áp dụng để xác định các tham số trên là phương pháp hồi quy(hồi quy tuyến tính hay hồi quy phi tuyến), trong đó thuật toán bình phương tốithiểu từng phần (PLS), tính toán máy vector hỗ trợ (SVM) và mạng neuron nhân tạo(ANN) thường được áp dụng

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 XÂY DỰNG MÔ HÌNH TƯƠNG ĐỒNG CỦA THỤ THỂ 5-HT6 2.1.1 Xây dựng mô hình tương đồng thụ thể 5-HT6 bằng I-Tasser

Cho đến nay, cấu trúc tinh thể của protein 5-HT6 vẫn chưa được xác định và chưa

có thông tin mô hình tương đồng của thụ thể 5-HT6 nào là tối ưu nên nghiên cứutiến hành đánh giá mức độ tương đồng của 5-HT6 với 6 protein mẫu (specifictemplate) Các protein mẫu được lựa chọn dựa theo tiêu chí: 4 protein mẫu thuộccùng họ thụ thể 5-HT (trong đó có 2 protein mẫu 5-HT2C, 5-HT2A mới được xácđịnh cấu trúc vào tháng 02/2018 và tháng 02/2019) và 2 protein mẫu thuộc cùng họGPCR [60]

- 5-HT1B: PDB 4IAR (độ phân giải: 2,70 Å)

- 5-HT2A: PDB 6A94 (độ phân giải: 2,90 Å)

- 5-HT2B: PDB 4IB4 (độ phân giải: 2,70 Å)

- 5-HT2C: PDB 6BQH (độ phân giải: 2,70 Å)

- Bovine rhodospin: PDB 3C9L (độ phân giải: 2,65 Å)

- β2-adrenergic receptor : PDB 2RH1 (độ phân giải: 2,40 Å)

Protein có tỉ lệ tương đồng với thụ thể 5-HT6 cao nhất sẽ được nghiên cứu lựa chọn

là “specific template” để xây dựng mô hình tương đồng thụ thể 5-HT6 bằng kỹthuật mô tả tính tương đồng

Trình tự acid amin của 5-HT6 được lấy từ trang web National Center forBiotechnology Information (NCBI) gồm 440 acid amin [54] Sau đó, trình tự này(có số acid amin nhỏ hơn 1500 theo quy định của server I-Tasser) được tải lênserver I-Tasser (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/, Protein Structureand Function Predictions), các thông tin cần có thể cung cấp cho server bao gồm[55]:

- ID: tên của protein

- Assign contact/distance restraints: thông tin về các cặp nguyên tử tiếp xúc nhauhay khoảng cách giữa các cặp nguyên tử

- Specific template without alignment: cấu trúc dạng PDB muốn I-Tasser dùng như

1 đĩa để xây dựng tương đồng

- Specific template without alignment: khi có cả thông tin về cấu trúc đĩa và liên kếtđĩa-đích

Sau khi điền thông tin tiến hành Run I-Tasser và bắt đầu quá trình xây dựng Server

sẽ gởi mô hình cấu trúc tương đồng của thụ thể 5-HT6 về trong vòng vài tuần

2.1.2 Đánh giá cấu trúc tương đồng từ server tự động

Cấu trúc tương đồng được đánh giá dựa trên các thang điểm C-score, TM-score,RMSD và mật độ đám (Cluster density)

C-score đánh giá mức độ tin cậy về chất lượng của mô hình dự đoán Điểm số nàyđược tính toán dựa trên sự gióng hàng với các cấu trúc mẫu tương tự và sự đồngquy của các thông số cấu trúc C-score thường nằm trong khoảng [-5,2], trong đó,C-score càng cao chứng tỏ mô hình có chất lượng càng tốt và ngược lại [47]

TM-score và RMSD được dùng để đo lường mức độ tương đồng giữa hai cấu trúc.Các điểm số này thường được áp dụng để đánh giá độ chính xác của mô hình khi cóprotein mẫu Khi không có protein mẫu, các điểm số này được dùng để đánh giáchất lượng của mô hình cùng với C-score TM-score lớn hơn 0,5 chứng tỏ mô hình

có dạng hình học đúng và TM-score nhỏ hơn 0,17 chứng tỏ có chỉ có một sự tươngđồng ngẫu nhiên giữa hai cấu trúc [47]

Mật độ đám là số cấu trúc mồi tại một đơn vị không gian trong đám SPICKER Mật

độ đám cao nghĩa là mô hình có chất lượng tốt [47]

2.2 XÂY DỰNG MÔ HÌNH MÔ TẢ PHÂN TỬ DOCKING

2.2.1 Quy trình xây dựng mô hình mô tả phân tử docking

Phương pháp docking cần thông tin về cấu trúc của một protein và cấu trúc của cácphối tử Các phần mềm sẽ sử dụng các thông tin cấu trúc này để xây dựng các cấutrúc ảo trên máy tính Tiến trình doking được máy tính thực hiện bằng cách gắn cấutrúc ảo của phối tử vào cấu trúc của protein và đánh giá sự gắn kết tạo thành Kếtquả nhận được là các cấu dạng gắn kết của phối tử kèm theo điểm số đánh giá sựgắn kết Quy trình thực hiện docking gồm các bước:

- Chuẩn bị cấu trúc 3D của protein và cấu trúc 3D của phối tử

- Tiến hành docking

- Đánh giá kết quả thu được gồm cấu dạng và điểm số gắn kết

2.2.1.1 Chuẩn bị cấu trúc 3D protein bằng công cụ QuickPrep

QuickPrep là một bộ các công cụ của MOE 2015.10 dùng để tiến hành các khảo sát

về tương tác giữa đích tác động và phối tử, trong đó bao gồm cả các công cụ để xử

lý protein Quá trình chuẩn bị protein khi sử dụng Quickprep gồm các bước sau[53]:

- Xác định ligand đồng kết tinh (Verify ligand/ Choose ligand): bước này được bỏqua do mô hình protein tương đồng không có ligand đồng kết tinh

- Proton hóa (Protonate): các acid amin trong protein được proton hóa và tích điện

- Cố định và tối thiểu hóa năng lượng (Tether and Minimize): các nguyên tử trongprotein được xác định vùng không gian chuyển động nhằm đảm bảo mọi nguyên tửkhông bị chệch quá xa khỏi tọa độ ban đầu, sau đó phân tử protein được tối thiểuhóa năng lượng

- Xóa các phân tử nước không liên kết (Delete Unbound Waters): do protein 5-HT6được xây dựng bằng phương pháp tương đồng do đó protein này không đi kèm phân

tử dung môi

- Lưu protein vừa được chuẩn bị dưới dạng file *.pdb.

2.2.1.2 Xác định vị trí gắn kết

FlexX trong LeadIT đòi hỏi phải chỉ ra cụ thể vị trí gắn kết trên protein để có thểthực hiện docking Để đáp ứng yêu cầu này, công cụ Site Finder trong MOE2015.10 được áp dụng để tìm ra các vị trí gắn kết có thể trên protein đích Kết hợpcác dữ liệu thực nghiệm và kết quả tìm kiếm của Site Finder để chọn ra một số vị trígắn kết phù hợp nhất Hình 2.1 mô tả ba vị trí gắn kết trên mô hình tương đồng củathụ thể 5-HT6 được xác định bằng Site Finder của phần mềm MOE

Hình 2.1 Các vị trí gắn kết trên cấu trúc tương đồng của thụ thể 5-HT6 được xác

định bằng Site Finder của phần mềm MOECác phối tử được xây dựng cấu trúc 3D bằng MOE 2015.10 và lưu dưới dạng

*.mol2 Sau đó các phối tử được tối thiểu hóa năng lượng bằng Sybyl-X 2.0 để dễdàng tìm ra những cấu dạng bền nhất (có mức năng lượng thấp nhất) trong quá trìnhdocking

Tối thiểu hóa năng lượng hai lần bằng công cụ Compute → Minimize → Molecule,

chọn lựa thông số như sau: Method: Conjugate Gradient; Termination: EnergyChange, 0.0001 Kcal/mol; Max Iterations: 10000; Modify → Charge: Gasteiger-Huckel; các thông số khác để mặc định

Sau khi tối thiểu hóa năng lượng lần một, tiến hành động lực học phân tử bằng công

cụ Compute → Dynamics → Setup Simulated Annealing, chọn Run: 5; các thông số

khác để mặc định Chọn ra cấu dạng có năng lượng thấp nhất trong toàn bộ các cấudạng được tạo ra, từ cấu dạng này tiến hành tối thiểu hóa năng lượng lần hai và lưulại dưới dạng *.mol2 Tất cả các phân tử sau khi đã tối tiểu hóa xong lần hai sẽ đượclưu lại thành một bảng dưới dạng *.sdf

2.2.1.3 Docking với LeadIT 2.1

Để thực hiện docking trong LeadIT 2.1, đầu tiên protein đã chuẩn bị bằng công cụ

LigX được tải vào bằng cách chọn Receptor → Load or Prepare Xác định khoang

gắn kết bằng cách chọn các acid amin trong túi gắn kết (đã được xác định bằng SiteFinder) trong mục Project Tree Lưu khoang gắn kết vừa tạo lại và tiến hànhdocking

Tải các phối tử cần dock vào bằng công cụ Docking → Define FlexX docking →

Docking library → Load file.

Sau đó xác định các thông số cho quá trình docking: Số lượng các cấu dạng liên kết(pose) giữ lại là 10 (chọn Top10) Trong phần chi tiết Docking, chọn số lần tối đacho mỗi lần lặp lại là 1000 và số lần tối đa cho việc bẻ gãy là 200 Các thông số cònlại là mặc định

Chọn Apply and Dock

2.2.2 Đánh giá kết quả docking

Kết quả docking bao gồm cấu dạng gắn kết của các dẫn chất, các tương tác có thểxảy ra giữa các hợp chất với các acid amin và điểm số gắn kết (đơn vị kj.mol-1);trong đó điểm số docking càng âm biểu thị khả năng gắn kết của phân tử vàokhoang tác động càng tốt Các mô hình để tính toán điểm số docking được xây dựng

để phù hợp cho tất cả các đích protein Tuy vậy, độ chính xác của điểm số thườngthay đổi rất nhiều khi đích tác động thay đổi

Do đó, để đảm bảo việc lựa chọn kết quả các cấu dạng tiềm năng được chính xáchơn, nghiên cứu áp dụng phương pháp phân tích dấu vân tay tương tác protein-phối

tử (protein-ligand interaction fingerprint - PLIF) của MOE 2015.10 kết hợp vớiđiểm số docking để phân tích kết quả

Phương pháp PLIF biểu thị tương tác phối tử-protein dưới dạng hình ảnh 1 chiều[53] Trong đó, mỗi tương tác giữa acid amin trong protein và phối tử tương ứng vớimột vạch đen trong biều đồ Kết quả khi xếp chồng nhiều phối tử cùng tương tác tạimột vị trí gắn kết sẽ tạo ra barcode (mã vạch) xếp chồng lên nhau

Kết quả sau docking ở dạng *.sdf sẽ được chuyển thành định dạng *.mdb và mởtrong MOE 2015.10 để tiến hành phân tích kết quả bằng phương pháp PLIF Phântích PLIF bao gồm bước thực hiện:

- Mở kết quả docking dạng *.mdb và cấu trúc thụ thể đã sử dụng để docking bằngMOE 2015.10

- Trong cửa sổ cơ sở dữ liệu (*.mdb) chọn Compute/ PLIF/ Generate…

- Trên cửa sổ PLIF Setup: Chọn Receptor: Receptor + Solvent Ở Ligand: mol để

chọn cột chứa thông tin cấu dạng sau khi docking Các thông số khác sẽ được để

mặc định Cuối cùng, chọn Prepare để thực hiện tính toán các tương giữa protein và

Tổng cộng 933 chất được thu thập từ 18 bài báo khoa học của nhiều nhóm tác giả

và từ cơ sở dữ liệu của ChEMBL được ghi nhận hoạt tính bằng hằng số ức chế (Ki)thông qua thử hoạt tính đối vận thụ thể 5-HT6 Nghiên cứu phân bổ các chất nàylàm 03 tập chất để nghiên cứu: “Tập xây dựng”, “Tập có hoạt tính” và “Tập không

có hoạt tính”:

- “Tập xây dựng” là các chất đối vận thụ thể 5-HT6 được chọn lọc theo điều kiệnnhư sau:

+ Mỗi khung cấu trúc (bảng 1.1) phải có ít nhất một chất được chọn

+ Chọn chất được đưa vào chương trình thử nghiệm lâm sàng AD+ Nếu nhà phát triển công bố nhiều chất có cùng khung thì chọn chất có hoạt tínhđối vận thụ thể 5-HT6 cao hơn

Kết quả chọn lọc được 05 chất đối vận thụ thể 5-HT6 sử dụng làm “Tập xây dựng”trong nghiên cứu này Thông tin về 05 chất thuộc “Tập xây dựng” được trình bày tạibảng 2.1, cấu trúc được trình bày tại hình 2.2 và hình 2.3

- “Tập có hoạt tính” và “Tập không có hoạt tính” được phân chia dựa theo hoạt tínhđối vận thụ thể 5-HT6 (giá trị Ki):

+ “Tập có hoạt tính” bao gồm 401 chất có hoạt tính đối vận thụ thể 5-HT6 mạnh,

Ki <1000 nM

+ “Tập không có hoạt tính” bao gồm 532 chất có hoạt tính đối vận thụ thể 5-HT6yếu hoặc không có hoạt tính, Ki ≥1000 nM

Bảng 2.1 Các chất đối vận 5-HT6 được lựa chọn làm “Tập xây dựng”

Nhà phát triển

1 SYN-120 Aryl-sulfon 0.2 Pha 2 Roche, Biotie

4 AVN-322 Pyrazolopyrimidin 0.39 Pha 1 Avineuro

5 Idalopirdin Indol 0.83 Pha 3 Lundbeck

Pharma

Intepirdin Hình 2.2 Cấu trúc các chất thuộc “Tập xây dựng”: SYN-120, SUVN-502,

Idalopirdin AVN-322

Hình 2.3 Cấu trúc các chất thuộc “Tập xây dựng”: Idalopidin, AVN-322

2.3.2 Quy trình xây dựng 3D-pharmacophore bằng MOE 2015.10

Quy trình xây dựng mô hình 3D-pharmacophore cơ bản theo hướng dẫn sử dụngphần mềm MOE 2015.10 có thể tóm tắt thành các bước như sau:

- Bước 1: Tập hợp cấu trúc 3D của các chất có hoạt tính

- Bước 2: Từ mỗi cấu trúc tạo ra các cấu dạng có thể có tương ứng

- Bước 3: Tạo ra các pharmacophore có thể có (4 hoặc 5 điểm)

Tuy nhiên khi áp dụng quy trình cơ bản này vào nghiên cứu thì các pharmacophoretạo ra không có tính chọn lọc giữa chất có hoạt tính mạnh và các chất có hoạt tínhyếu/ không có hoạt tính Vì vậy trong nghiên cứu này, quy trình xây dựngpharmacophore được sửa lại theo nguyên tắc là chỉ sử dụng cấu dạng gắn kết củaligand để xây dựng pharmacophore Quy trình mới có thể tóm tắt thành các bướcnhư sau:

- Bước 1: Tập hợp cấu trúc 3D của các chất có hoạt tính

- Bước 2: Từ mỗi cấu trúc tạo ra các cấu dạng gắn kết có thể có với thụ thể 5-HT6bằng phương pháp docking

- Bước 3: Tạo ra các pharmacophore có thể có (4 hoặc 5 điểm)