Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của hoa dương cam cúc (capitulum matricariae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÙY DƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HOA DƯƠNG CAM CÚC (Capitulum Matricariae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÙY DƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HOA DƯƠNG CAM CÚC (Capitulum Matricariae) Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM ĐÔNG PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Nguyễn Thuỳ Dương Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Năm học 2016-2018 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOA DƯƠNG CAM CÚC (Capitulum Matricariae) Nguyễn Thùy Dương Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Đông Phương Mở đầu: Dương cam cúc (M chamomilla L.) lồi thực vật có nhiều chế phẩm thị trường trà, hoa khô, tinh dầu trị liệu, dược mỹ phẩm có tác dụng chống oxy hóa, làm lành vết thương, chống trầm cảm, kháng khuẩn, kháng viêm, hạ đường huyết chống ung thư, Dương cam cúc di thực vào Việt Nam từ năm 60, trồng chủ yếu Đà Lạt sử dụng nhiều để làm trà, mỹ phẩm….Cho đến chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu nước cơng bố thành phần hóa học lồi Dương cam cúc Do luận văn thực với mục tiêu phân lập hợp chất từ đầu hoa Dương cam cúc khảo sát tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH Đối tượng: đầu hoa Dương cam cúc (Capitulum Matricariae) Phương pháp nghiên cứu Khảo sát tác dụng chống oxy hóa phân đoạn cao chiết chất phân lập mơ hình DPPH Sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng – rắn, sắc ký cột cổ điển, sắc kí cột chân khơng phương pháp tinh chế khác để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào liệu phổ khối phổ NMR Kết bàn luận Khảo sát tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn phương pháp DPPH Thử nghiệm DPPH đo bước sóng max 517 nm sau thời gian phản ứng 30 phút Kết khả chống oxy hóa cao giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (92,02 %) > cao cloroform (63,37 %) > cao n-hexan (32,1 %) Do cao ethyl acetat tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Chiết xuất phân lập xác định cấu trúc Hoa Dương cam cúc (3 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 96 % thu 465 g cao cồn toàn phần, kỹ thuật lắc phân bố lỏng – rắn thu cao n-hexan (60 g), cao cloroform (60 g) cao EA (40 g) Từ cao EA kỹ thuật sắc ký cột chân không (VLC), phân lập chất apigenin (70 mg), 6’’-O-crotonyl-apigetrin (crotonyl cosmosiin) (10 mg), 6’’-O-acetylapigetrin (70 mg), apigetrin (290 mg) IC50 chất tinh khiết phân lập giảm dần theo thứ tự apigenin (IC50 = 4,7 µg/ml) > apigetrin (IC50 = 12,7 µg/ml) > 6’’-O-crotonyl-apigetrin (IC50 = 13,9 µmol/l) > 6’’-O-acetyl-apigetrin (IC50 = 14,7 µg/ml) Kết luận: từ cao ethyl acetat thu chất tinh khiết: apigenin, 6’’-O-crotonyl-apigetrin (crotonyl cosmosiin), 6’’-O-acetyl-apigetrin, apigetrin Những chất góp phần việc tiêu chuẩn hóa dược liệu hoa Dương cam cúc Thesis of master of pharmacy, course: 2016-2018 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF CAPITULUM MATRICARIAE Nguyen Thuy Duong Supervisor: Dr Pham Dong Phuong Introduction: Matricaria chamomilla is the plant that has many products were used in the market such as tea, dried flowers, essential oils, medicinal and cosmetic because of antioxidant, wound healing, anti-depressant, antimicrobial, anti-inflammatory, hypoglycemic and anti-cancer M.chamomilla was imported into Vietnam since the 60s, grown mainly in Da Lat and is now used to make tea, cosmetics Few studies on the chemical composition and bio-activity of capitulum matricariae As a result, in this thesis our aim is to study on chemical contitutions and antioxidant activity of capitulum matricariae Materials: capitulum matricariae Methods In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant activity on DPPH assay Distribution of liquid-solid extraction, vacuum liquid chromatography, silica gel column chromatography, and recrystallization of crystals in suitable solvents Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods Results and discussions Screening the antioxidant activity in vitro by DPPH assay: DPPH assay was performed at max 517 nm The results showed that the antioxidant activity of extracts was as follows: ethyl acetat extract (92,02 %) > chloroform extract (63,37 %) > n-hexan extract (32,1 %) Therefore, ethyl acetat extract was chosen for isolations later Extraction, isolation and structure elucidation: Capitulum matricariae (3 kg) were extracted with 96% alcohol to yield 465 g of extract Alcohol extract was successively partioned with solvents to obtain n-hexan extract (60 g), cloroform extract (60 g), ethyl acetat extract (40 g) From ethyl acetat extract, by vacuum liquid chromatography and silica gel, substances were obtained: apigenin (70 mg), 6’’-O-crotonyl-apigetrin (crotonyl cosmosiin) (10 mg), 6’’-O-acetylapigetrin, apigetrin (290 mg) Their structures were elucidated by NMR and MS spectrometric methods IC50 values of substances isolated and extracts comparing with vitamin C were as follows: apigenin (IC50 = 4,7 µg/ml) > apigetrin (IC50 = 12,7 µg/ml) > 6’’-O-crotonyl-apigetrin (IC50 = 13,9 µmol/l) > 6’’-O-acetyl-apigetrin (IC50 = 14,7 µg/ml) Conclusion: apigenin, 6’’-O-crotonyl-apigetrin (crotonyl cosmosiin), 6’’-O-acetyl-apigetrin, apigetrin were obtained from EtOAc extract of capitulum matricariae They can be standardized for conference standards using in biotests, in quality control of capitulum matricariae or preparations related i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH vi CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học Dương cam cúc 1.1.1 Vị trí xếp 1.1.2 Đặc điểm chi Matricaria 1.1.3 Đặc điểm thực vật Dương cam cúc 1.2 Tổng quan thành phần hóa học Dương cam cúc 1.2.1 Tinh dầu 1.2.2 Flavonoid 1.2.3 Coumarin 1.2.4 Các thành phần khác 1.3 Tổng quan tác dụng dược lý 1.3.1 Tác dụng chống oxi hóa 1.3.2 Tác dụng làm lành vết thương 3.3 Tác dụng ức chế cytochrome P450 1.3.4 Tác dụng chống trầm cảm 10 1.3.5 Tác dụng kháng khuẩn 10 1.3.6 Tác dụng chống viêm 10 1.3.7 Tác dụng hạ đường huyết 11 1.3.8 Tác dụng chống ung thư 11 1.4 Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 11 1.4.1 Thử nghiệm đánh giá khả loại gốc tự DPPH 12 1.4.2 Thử nghiệm đánh giá khả khử sắt FRAP 12 1.4.3 Thử nghiệm Folin-Ciocalteu 13 1.4.4 Thử nghiệm đo khả hấp thụ gốc oxy - ORAC 13 1.4.5 Thử nghiệm xác định hàm lượng MDA - thử nghiệm TBARS 14 1.4.6 Thử nghiệm đánh giá khả chống oxy hóa sử dụng hệ thống -caroten/acid linoleic 14 1.4.7 Thử nghiệm đánh giá khả loại gốc O2 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 ii 2.2 Dung mơi hóa chất thiết bị 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Khảo sát vi học 16 2.3.2 Thử tinh khiết 16 2.3.3 Khảo sát hoá học 17 2.3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đặc điểm hình thái vi học Dương cam cúc 21 3.1.1 Đặc điểm hình thái 21 3.1.2 Đặc điểm biểu bì tách 21 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu lá, thân Dương cam cúc 22 3.1.4 Soi bột hoa Dương cam cúc 22 3.2 Thử tinh khiết 23 3.2.1 Xác định độ ẩm 23 3.2.2 Xác định độ tro 23 3.3 Hàm lượng chất chiết Dương cam cúc 23 3.4 Nghiên cứu hóa học 24 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 24 3.4.2 Chiết xuất phân lập chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa 25 3.4.3 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy chất tinh khiết 46 BÀN LUẬN 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Stt Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên 13 13 Cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1 Cộng hưởng từ hạt nhân proton br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxid Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetat Ethyl acetat 10 HMBC Heterronuclear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC 11 HSQC Heterronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC 12 HTCO Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa 13 IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% 14 IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại 15 J Coupling constant Hằng số ghép 16 m multiplet Nhiều đỉnh 17 MDA Malonyl dialdehyde Malonyl dialdehyd 18 MeOH Methanol Methanol 19 MHz Mega hertz Mega hertz 20 MS Mass Spectroscopy Phổ khối 21 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 22 ppm parts per million Phần triệu 23 PDA Photodiode Array Dãy diod quang 24 s singlet Đỉnh đơn C-NMR H-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance iv Stt Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên 25 SKC Sắc ký cột Sắc ký cột 26 SKĐ Sắc ký đồ Sắc ký đồ 27 SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng 28 t triplet Đỉnh ba 29 TLTK Tài liệu tham khảo Tài liệu tham khảo 30 TT Thuốc thử Thuốc thử 31 UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 32 VS Vanillin-acid sulfuric Vanillin-acid sulfuric 33 MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu ức chế 34 MBC Minimal Bactericidal Concentration Nồng độ tối thiếu diệt khuẩn 35 GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry Sắc kí khí-phổ khối 36 AUC Area Under The Curve Diện tích đường cong 37 BSA BenzoSalicylic Acid Acid BenzoSalicylic 38 UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng siêu hiệu 39 LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry Sắc kí lỏng-phổ khối 40 COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan 1H 1H v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Cách pha mẫu đo thử nghiệm DPPH 19 Bảng 3.1 Kết thử tinh khiết hoa Dương cam cúc 23 Bảng 3.2 Hàm lượng chất chiết dược liệu hoa Dương cam cúc (%) 23 Bảng 3.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 24 Bảng 3.4 Kết phân tách cao phân đoạn 27 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm HTCO phương pháp DPPH mẫu cao 28 Bảng 6.Các hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết MC1, MC2, MC3và MC5 33 Bảng 3.7 Kết phân tích UPLC MC1, MC2, MC3, MC5 35 Bảng Phổ NMR chất MC1 37 Bảng Phổ NMR chất MC5 40 Bảng 10 Phổ NMR MC3 42 Bảng 11 Phổ NMR MC2 44 Bảng 13 Kết thử nghiệm HTCO thử nghiệm DPPH chất phân lập 47 Bảng 3.14 Kết thử HTCO cao EA với dãy nồng độ 47 Bảng 3.15 Kết thử HTCO acid ascorbic với dãy nồng độ 48 Bảng 3.16 Kết thử HTCO MC1 với dãy nồng độ 49 Bảng 3.17 Kết thử HTCO MC2 với dãy nồng độ 49 Bảng 3.18 Kết thử HTCO MC3 với dãy nồng độ 50 Bảng 3.19 Kết thử HTCO MC5 với dãy nồng độ 51 Bảng 3.20 Phương trình hồi quy IC50 cao EA, acid ascorbic chất phân lập 51 PL-6 Phụ lục Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) MC2 Phụ lục Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC2 (vùng 5-8 ppm) PL-7 Phụ lục Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC2 (vùng 5-8 ppm) Phụ lục 10 Phổ HSQC MC2 PL-8 Phụ lục 11 Phổ HMBC MC2 (vùng 6-8,2 ppm) Phụ lục 12 Phổ HMBC MC2 (vùng 3-5,5 ppm) PL-9 Phụ lục 13 Phổ DEPT MC2 Phụ lục 14 Phổ COSY MC2 PL-10 Phụ lục 15 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) MC3 Phụ lục 16 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC3 (vùng 6-8 ppm) PL-11 Phụ lục 17 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC3 (vùng 3-5,6 ppm) Phụ lục 18 Phổ HSQC MC3 (vùng 5-8 ppm) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-12 Phụ lục 19 Phổ HSQC MC3 (vùng 1-5 ppm) Phụ lục 20 Phổ HMBC MC3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-13 Phụ lục 21 Phổ DEPT MC3 Phụ lục 22 Phổ COSY MC3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-14 Phụ lục 23 Phổ COSY MC3 Phụ lục 24 Phổ COSY MC3 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-15 Phụ lục 25 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) MC5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-16 Phụ lục 26 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC5 (vùng 5-8 ppm) Phụ lục 27 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) MC5 (vùng 3-5,5 ppm) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-17 Phụ lục 28 Phổ HSQC MC5 (vùng 5-8 ppm) Phụ lục 29 Phổ HSQC MC5 (vùng 3,1-3,8 ppm) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-18 Phụ lục 30 Phổ HMBC MC5 Phụ lục 31 Phổ DEPT MC5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-19 Phụ lục 32 Phổ COSY MC5 Phụ lục 33 Phổ COSY MC5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-20 Phụ lục 34 Phổ COSY MC5 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... trình nghiên cứu nước công bố thành phần hóa học lồi Dương cam cúc đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa Dương cam cúc? ?? tiến hành với mục tiêu cụ thể sau: - Nghiên cứu vi học. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÙY DƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HOA DƯƠNG CAM CÚC (Capitulum Matricariae) Chuyên... nhiều cơng trình nghiên cứu nước cơng bố thành phần hóa học lồi Dương cam cúc Do luận văn thực với mục tiêu phân lập hợp chất từ đầu hoa Dương cam cúc khảo sát tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH