Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của dây phục linh adenia cardiophylla (mast ) engl , passifloraceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒNG THANH HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỚNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2020 BỢ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒNG THANH HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỚNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS MÃ CHÍ THÀNH TP Hồ Chí Minh, năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan là cơng trình nghiên cứu tơi Các sớ liệu, kết nêu luận văn là trung thực và chưa công bố cơng trình nào khác Đồng Thanh Hạnh ii TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020 Ngành: Dược liệu- Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỜNG OXY HÓA CỦA DÂY PHỤC LINH (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae) Đồng Thanh Hạnh Người hướng dẫn khoa học: TS Mã Chí Thành Đặt vấn đề Dây Phục linh lồi thuộc chi Adenia, họ Passifloraceae Rễ có vị ngọt, tính nóng; dùng làm th́c bở phởi cho người yếu phổi, hay đau ran vùng phổi phía bả vai Cho đến nay, hầu hết cơng bớ về thành phần hóa học lồi chi Adenia chủ yếu thực loài A volkensii A digitata, cịn đới với Dây Phục Linh (Adenia cardiophylla) chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học tác dụng dược lý Đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa Dây Phục linh (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)” tiến hành nhằm đóng góp về mặt khoa học thực tiễn dược liệu Đối tượng Thân rễ Dây phục linh thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 11/2018 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc hoạt tính chớng oxy hóa phương pháp DPPH Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thuận, sắc ký rây phân tử, kết tinh phân đoạn để phân lập hợp chất tinh khiết Xác định cấu trúc chất đã phân lập phương pháp phổ học (MS, NMR) Kết bàn luận Khảo sát hoạt tính chớng oxy hóa cho thấy hoạt tính cao phân đoạn giảm dần theo thứ tự: cao ethyl acetat > cao n-BuOH > cao nước > cao n-Hexan kg bột dược liệu chiết xuất với cồn 70%, phân tách lỏng – lỏng thu cao phân đoạn: n-hexan (48 g), ethyl acetat (45 g), n-BuOH (37 g) và nước (254 g) Từ cao ethyl acetat đã phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic; demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A deidaclin Trong đó, AC1 là hợp chất mới, lần phân lập tự nhiên Khảo sát hoạt tính chớng oxy hóa hợp chất phân lập cho thấy hầu hết hợp chất đều thể tác dụng yếu, có hợp chất demethoxypinoresinol có tác dụng mức độ trung bình (IC50 = 214,75 µg/ml) Kết luận Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chớng oxy hóa mạnh đã phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic; demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A và deidaclin Trong đó, AC1 là hợp chất mới, lần phân lập tự nhiên Các hợp chất phân lập thử nghiệm hoạt tính chớng oxy hóa cho thấy hầu hết hợp chất đều thể tác dụng yếu, có hợp chất demethoxypinoresinol có tác dụng mức độ trung bình iii ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2018 – 2020 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ADENIA CARDIOPHYLLA (MAST.) ENGL., PASSIFLORACEAE Dong Thanh Hanh Supervisors: PhD Ma Chi Thanh Introduction Adenia cardiophylla is a specie of the genus Adenia, Passifloraceae The roots of the plant have a slightly sweet taste; used as a tonic for people with lungs inflamatory diseases Up to now, most of the published chemical composition of species in the genus Adenia has been made mainly on A volkensii and A digitata, while there has not been any research for A cardiophylla The project "Chemical constituents and antioxidant activities of Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)" was conducted to contribute scientifically and practically of this medicinal herb Materials Stems and roots of A cardiophylla were collected from Tinh Bien district, An Giang province in November 2018 Methods The antioxidant activities of extracts, fractions and isolated compounds were tested by invitro DPPH assay Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography, sizeexclusion chromatography, recrystallization were used for extracting and isolating Structure of isolated compound were determined by MS and NMR spectrometric methods Results and discussion The antioxidant activity survey showed that the results of fractions decreased in order: ethyl acetate > n-BuOH > water > n-hexane kg of medicinal powder was extracted with 70% alcohol, then liquid-liquid separated to give four fractions: n-hexane (48 g), ethyl acetate (45 g), n-BuOH (37 g) and water (254 g) From ethyl acetate fraction was isolated and determined the structure of compounds: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; vanillic acid; demethoxypinoresinol; succinic acid; tetraphyllin A and deidaclin In which, AC1 is a novel compound, isolated in nature for the first time Investigation of antioxidant activity of isolated compounds showed that most of the compounds showed very weak effects, only the demethoxypinoresinol showed a moderate effect (IC50 = 214.75 µg / ml) Conclutions From the ethyl acetate fraction with the strongest antioxidant activity, compounds were isolated: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; vanillic acid; demethoxypinoresinol; succinic acid; tetraphyllin A and deidaclin In which, AC1 is a novel compound The isolates tested for antioxidant activity showed that most of the compounds exhibited very weak effects, only the demethoxypinoresinol compound with a moderate effect iv MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học họ Lạc tiên (Passifloraceae) 1.1.3 Đặc điểm loài Adenia cardiophylla 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CHI ADENIA 1.3.1 Gây độc tế bào 1.3.2 Tác dụng an thần 1.3.3 Tác dụng chống đông máu 1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết 1.3.5 Tác dụng chống sốt rét 1.3.6 Tác dụng chớng oxy hóa 1.3.7 Tác dụng giảm đau 1.4 CÔNG DỤNG CỦA DÂY PHỤC LINH 1.5 CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 1.5.1 Chất chớng oxy hóa 1.5.2 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa 1.5.3 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro 10 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 NGUYÊN LIỆU 12 2.2 DUNG MƠI VÀ HĨA CHẤT 12 2.3 TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 13 v 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.4.1 Nghiên cứu về thực vật học 14 2.4.2 Thử tinh khiết 14 2.4.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 14 2.4.4 Chiết xuất, phân lập chất 14 2.4.5 Thử tác dụng sinh học 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 19 3.1.1 Đặc điểm hình thái 19 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 19 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân 21 3.1.4 Soi bột dược liệu 23 3.2 THỬ TINH KHIẾT 23 3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 24 3.4 KHẢO SÁT HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 24 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 24 3.4.2 Chiết xuất và tách phân đoạn 26 3.4.3 Đánh giá hoạt tính chớng oxy hóa cao phân đoạn 27 3.4.4 Phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat (ACE) 28 3.4.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập SKLM 39 3.4.6 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 40 3.4.7 Đánh giá tác dụng chớng oxy hóa chất phân lập từ cao ACE 51 3.5 BÀN LUẬN 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 4.1 KẾT LUẬN 55 4.2 ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC PL.1 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phân loại chi Adenia Hình 1.2 Thân, lá, hoa, loài Adenia cardiophylla Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu dược liệu Dây phục linh 12 Hình 3.1 Một sớ hình ảnh dược liệu Dây phục linh 19 Hình 3.2 Vi phẫu và sơ đồ Dây phục linh 20 Hình 3.3 Vi phẫu phiến Dây phục linh 21 Hình 3.4 Vi phẫu thân Dây phục linh 22 Hình 3.5 Một sớ cấu tử bột dược liệu Dây phục linh 23 Hình 3.6 Sơ đồ chiết – tách phân đoạn dược liệu Dây phục linh 26 Hình 3.7 Sắc ký đồ cao phân đoạn Dây phục linh 27 Hình 3.8 Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc ký cột nhanh cao ACE 29 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển ACE4 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc ký rây phân tử ACE4.34 32 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc ký rây phân tử ACE4.9 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ phân đoạn thu từ sắc ký rây phân tử ACE4.11 35 Hình 3.13 Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký cột cổ điển ACE11 37 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký rây phân tử ACE11.3 38 Hình 3.15 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat Dây phục linh 38 Hình 3.16 Sắc ký kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập từ cao ACE 39 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY AC2 42 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC AC3 43 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY AC4 46 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học AC7 47 Hình 3.21 Các tương tác HMBC và COSY AC9 48 Hình 3.22 Cấu trúc hóa học Deidaclin (1R) Tetraphyllin A (1S) 49 Hình 3.23 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY AC1 51 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết thử tinh khiết bột dược liệu Dây phục linh 24 Bảng 3.2 Hàm lượng chất chiết dược liệu Dây phục linh 24 Bảng 3.3 Kết phân tích sơ hóa thực vật dược liệu Dây phục linh 24 Bảng 3.4 Kết đánh giá HTCO cao phân đoạn 27 Bảng 3.5 Kết sắc ký cột nhanh cao ACE 28 Bảng 3.6 Kết sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE4 30 Bảng 3.7 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.34 32 Bảng 3.8 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.9 33 Bảng 3.9 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.11 34 Bảng 3.10 Kết sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11 36 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11.3 37 Bảng 3.12 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng chất phân lập từ cao ACE 40 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR AC2 41 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR chất AC3 43 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR AC4 45 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR AC7 46 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR AC9 48 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR AC1 50 Bảng 3.19 Kết thử nghiệm HTCO chất tinh khiết 52 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dimethyl sulfoxide DEPT DMSO DPPH HTCO 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Correlation Hoạt tính chớng oxy hóa IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% J Coupling constant Hằng số ghép m multiplet Đỉnh phức tạp MS Mass Spectroscopy Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu PDA Photodiode array Dãy diod quang s Singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet - Visible VS Vanillin-acid sulfuric HMBC HSQC Tử ngoại - khả kiến ix Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 39 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC4 trích vùng 6,7 – 7,3 ppm Phụ lục 40 Phở HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC4 trích vùng 3,1 – 4,8 ppm PL 28 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 41 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) AC4 Phụ lục 42 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC5 PL 29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 43 Phổ 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC5 Phụ lục 44 Phổ HSQC (MeOD, 100/400 MHz) AC5 PL 30 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 45 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC5 Phụ lục 46 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) AC5 PL 31 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 47 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC6 Phụ lục 48 Phổ 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC6 PL 32 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 49 Phổ HSQC (MeOD, 100/400 MHz) AC6 Phụ lục 50 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC6 PL 33 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 51 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) AC6 Phụ lục 52 Phổ ESI-MS (-) AC7 PL 34 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 53 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC7 Phụ lục 54 Phổ 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC7 PL 35 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 55 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC8 Phụ lục 56 Phổ 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC8 PL 36 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 57 Phổ HSQC (MeOD, 100/400 MHz) AC8 Phụ lục 58 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC8 PL 37 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 59 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) AC8 Phụ lục 60 Phổ ESI-HRMS (+) AC9 PL 38 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 61 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC9 Phụ lục 62 Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) AC9 trích vùng 30 – 140 ppm PL 39 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 63 Phổ 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC9 Phụ lục 64 Phở 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC9 trích vùng 5,9 – 6,3 ppm PL 40 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 65 Phở 1H-NMR (MeOD, 400 MHz) AC9 trích vùng 2,3 – 4,7 ppm Phụ lục 66 Phổ HSQC (MeoD, 100/400 MHz) AC9 PL 41 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 67 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) AC9 Phụ lục 68 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) AC9 PL 42 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... MeOD, 100/400 MHz) [12] δC (ppm) δH (ppm) phân đỉnh (J = Hz) δC (ppm) δH (ppm) phân đỉnh (J = Hz) 6 2,4 3,6 4 dd ( 5,5 ; 3, 2) 2H 6 0,4 3,6 9 dd (1 3, 3) 1H 3,5 2 dd (1 3, 4) 1H 7 4,8 3,8 1 q ( 5, 4) 1H 6 0,5 3,1 9... 4 9,9 4,8 5 d ( 4, 8) 1H 4 2,9 3,3 6 d ( 2, 5) 1H 7 1,2 - 6 9,6 - 7 1,5 - 7 3,0 - 5 7,2 - 6 4,5 - 6 4,5 - 6 6,8 - 6 3,5 - 6 4,8 - 7 7,7 - 7 7,2 - 10 2,4 1,9 9 s 3H 4,1 1,8 5 s 3H Cấu trúc hóa học AC2 và tương tác. .. TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒNG THANH HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỚNG OXY HĨA CỦA DÂY PHỤC LINH Adenia cardiophylla (Mast. ) Engl. , Passifloraceae