Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hoá của cây tra làm chiếu (hibiscus tiliaceus l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÂY TRA LÀM CHIẾU (Hibiscus tiliaceus L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2020 BỢ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÂY TRA LÀM CHIẾU (Hibiscus tiliaceus L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành: Dược liệu –Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO TP Hồ Chí Minh, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các sớ liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa được cơng bớ cơng trình khác Nguyễn Thị Kim Ngân LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cám ơn sâu sắc đến thầy TS Võ Văn Lẹo, người hướng nghiên cứu, động viên, quan tâm lo lắng bảo tận tình cho em trình thực luận văn Em xin cám ơn PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương cô TS Trần Thị Vân Anh dành thời gian để đọc phản biện luận văn giúp luận văn em hoàn thiện hơn, hiểu việc cần làm nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Bộ môn Dược liệu, trường Đại học y dược TP Hồ Chí Minh truyền đạt, hướng dẫn cho chúng em kiến thức chuyên môn sâu sắc Cảm ơn anh chị giảng viên, nghiên cứu viên, cô, chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn anh, chị, bạn lớp cao học Dược liệu 2018 – 2020 nổ lực, phấn đấu nhiệt tình giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt q trình học tập Cuối em xin dành lời cám ơn đến gia đình bạn bè, người ln ủng hộ động viên tinh thần, quan tâm chăm sóc sức khỏe để em thuận lợi hoàn thành luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa 2018-2020 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỚNG OXY HOÁ CỦA CÂY TRA LÀM CHIẾU (Hibiscus tiliaceus L.) Nguyễn Thị Kim Ngân Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu đặt vấn đề Hibiscus tiliaceus L ngập mặn phát triển vùng Đông Bắc Úc, Châu Đại Dương Đông nam Á, Châu Phi, Úc khắp đảo Thái Bình Dương… mọc hoang phổ biến vùng ven biển, ốc đảo, ven sông, kênh rạch Việt Nam Tra làm chiếu đã được thử nghiệm cho thấy có nhiều tác dụng như: chớng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuần, chớng trầm cảm, hạ đường huyết đặc biệt tác dụng chống ung thư Ở Việt Nam, gần cơng trình nghiên cứu về lồi Do luận văn được thực với mục tiêu phân lập hợp chất từ Tra làm chiếu theo định hướng tác dụng chớng oxy hóa thử nghiệm DPPH Đối tượng Lá Tra làm chiếu (9,8 kg khô), thu hái huyện Tiều Cần, tỉnh Trà Vinh vào tháng 03/2019 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chớng oxy hóa phân đoạn cao chiết chất phân lập được thử nghiệm DPPH Sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển phương pháp tinh chế khác để phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chớng oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào dữ liệu phổ UV, phổ khối phổ NMR Kết bàn luận Thử nghiệm DPPH cho thấy khả chớng oxy hóa cao giảm dần theo thứ tự sau: Cao ethyl acetat (72,8 %) > cao nước (27,3 %) > cao cloroform (20,0 %) > cao n-hexan (9,5 %) nồng độ 50 μg/ml Do cao ethyl acetat được tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học Bột dược liệu (9,8 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cô, loại chlorophyll, pha loãng với nước chiết phân bố lỏng-lỏng, loại dung môi thu được cao n-hexan (3 g), cao cloroform (56 g) cao ethyl acetat (130 g) Từ 50 g cao ethyl acetat qua trình phân lập thu được hợp chất: tilirosid (64 mg); quercetin (10 mg); 3,3’,4,4’-tetrahydroxybiphenyl (65 mg); isoquercitrin (10 mg) acid 4,4’-dihydroxy truxillic (8 mg) Hoạt tính chớng oxy hóa chất tinh khiết theo thứ tự giảm dần: 3,3’,4,4’- tetrahydroxybiphenyl (IC50 = 8,35 µM) > quercetin (IC50 = 23,94 µM) > isoquercitrin (IC50 = 38,4 µM), so với chứng dương vitamin C (IC50 = 22,05 µM) Tilirosid 4, 4’-dihydroxy truxillic acid khơng thể khả chớng oxy hóa Kết luận Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chớng oxy hóa mạnh đã phân lập được hợp chất lần lượt là: tilirosid; quercetin; 3,3’,4,4’-tetrahydroxybiphenyl; isoquercitrin 4,4’dihydroxy truxillic acid Trong đó, 3,3’,4,4’-tetrahydroxybiphenyl lần được phân lập từ lồi Hibiscus tiliaceus L có hoạt tính chớng oxy hóa mạnh vitamin C ABSTRACT Master thesis of pharmacy, academic course: 2018-2020 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy, speciality code: 8720206 BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE LEAVES OF HIBISCUS TILIACEUS L Nguyen Thi Kim Ngan Supervisor: Dr Vo Van Leo Introduction Hibiscus tiliaceus L is a mangrove tree that grows in Eastern and Northern Australia, Oceania and Southeast Asia, Africa, Australia and throughout the Pacific islands and grows wildly quite popular in coastal areas, oases, rivers and canals in Vietnam There are many researches proven that Hibiscus tiliaceus L showed many effects such as anti-oxidant, anti-inflammatory, antidepressant, hypoglycemic and especially anti-cancer activity In Vietnam, there are almost no researches works on this tree Therefore, this study was performed to isolate compounds from Hibiscus tiliaceus leaves according to the orientation of antioxidant effects on the DPPH assay Materials: Hibiscus tiliaceus leaves (9.8 kg of dry leaves) were collected in Tieu Can district, Tra Vinh province in March, 2019 Methods In vitro screening of fractions and compounds isolated for the antioxidant activity were conducted on the DPPH assay Distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography, silica gel column chromatography, and recrystallization of crystals in suitable solvents Chemical structure elucidations were based on MS and NMR methods Results and discussions The results showed that the antioxidant activity of extracts were as follows: ethyl acetate extract (72.8 %) > water extract (27.3 %) > chloroform extract (20.0 %) > n-hexan extract (9.5 %) at trial concentration of 50 μg/ml Therefore, ethyl acetate extract was chosen for isolating active compounds Dried leaves of Hibiscus tiliaceus L (9.8 kg) were extracted with 80% ethanol, solvent was removed by evaporating under reduced pressure to give the ethanol extract The extract was diluted with water and distributed into fractions: n-hexan (3 g), chloroform (56 g) and ethyl acetate fraction (130 g) From ethyl acetate fraction (the highest antioxidant fraction), five compounds: tiliroside (64 mg); quercetin (10 mg); 3,3’,4,4’-tretrahydroxybiphenyl (65 mg); isoquercitrin (10 mg) and 4,4’-dihydroxy truxillic acid (8 mg) were isolated IC50 values of substances comparing with vitamin C were as follows: 3,3’,4 ,4’-tetrahydroxybiphenyl (IC50 = 8.35 µM) > ascorbic acid (IC50 = 22.05 µM) > quercetin (IC50 = 23.94 µM) > isoquercitrin (IC50 = 38.4 µM) Tiliroside 4, 4’-dihydroxy truxillic acid exhibited a negligible antioxidant activity on thin-layer chromatography with DPPH reagent Conclusions Tilirosid; quercetin; 3,3’,4,4’-tetrahydroxybiphenyl; isoquercitrin and 4, 4’-dihydroxy truxillic acid were obtained from ethyl acetate extract of Hibiscus tiliaceus leaves 4,4’tetrahydroxybiphenyl has been isolated from Hibiscus tiliaceus L for the first time, with antioxidant activity stronger than vitamin C MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hibiscus 1.1.3 Đặc điểm loài Hibiscus tiliaceus L 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học chi Hibiscus 1.2.2 Thành phần hóa học loài Hibiscus tiliaceus L 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 10 1.3.1 Tác dụng dược lý sớ lồi thuộc chi Hibiscus 10 1.3.2 Tác dụng dược lý Hibiscus tiliaceus L 11 1.4 CÔNG DỤNG 13 1.5 GỐC TỰ DO VÀ CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA 14 1.5.1 Gốc tự 14 1.5.2 Hoạt tính chớng oxy hóa 14 1.5.3 Một số phương pháp xác định khả chớng oxy hóa 15 CHƯƠNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 i 2.1 NGUYÊN LIỆU 19 2.2 DUNG MƠI, HĨA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Dung mơi, hóa chất 19 2.2.2 Trang thiết bị nghiên cứu 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Nghiên cứu thực vật học 20 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 21 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái 26 3.1.2 Đặc điểm vi học 28 3.2 THỬ TINH KHIẾT 33 3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC CỦA LÁ TRA LÀM CHIẾU 33 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 33 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 33 3.4.2 Xác định HTCO cao phân đoạn dịch chiết H tiliaceus 35 3.4.3 Chiết xuất tách phân đoạn 37 3.4.4 Phân tách cao EtOAc (HT-C) 38 3.4.5 Phân lập hợp chất từ cao HT-C 41 3.4.6 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 53 3.5 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT PHÂN LẬP ĐƯỢC 67 3.6 BÀN LUẬN 69 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 ii 4.1 KẾT LUẬN 71 4.2 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC PL.1 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học số flavonoid H tiliaceus L Hình 1.2 Cơng thức hóa học sớ hợp chất khác phân lập từ H tiliaceus L Hình 2.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu nghiên cứu 23 Hình 3.1 Toàn cây, hoa H tiliaceus 26 Hình 3.2 Hoa H tiliaceus 27 Hình 3.3 Vi phẫu sơ đồ 28 Hình 3.4 Vi phẫu chi tiết gân giữa 29 Hình 3.5 Vi phẫu chi tiết phiến 30 Hình 3.6 Vi phẫu sơ đồ cấu tạo cuống 31 Hình 3.7 Vi phẫu chi tiết ćng 31 Hình 3.8 Biểu bì (A) biểu bì có lỗ khí (B) cúa H tiliaceus 32 Hình 3.9 Các cấu tử tìm thầy bột dược liệu H tiliaceus 32 Hình 3.10 Sắc ký đồ đánh giá sơ HTCO cao chiết SKLM 35 Hình 3.11 Biểu đồ kết thử HTCO mẫu cao thử nghiệm 36 Hình 3.12 Sơ đồ chiết xuất tách phân đoạn cao chiết Tra làm chiếu 37 Hình 3.13 Sắc ký đồ tởng kết phân đoạn cao chiết Tra làm chiếu 38 Hình 3.14 Sắc ký đồ tởng kết phân đoạn cao HT-C 40 Hình 3.15 Sắc ký đồ đánh giá HTCO phân đoạn C-1 → C-12 40 Hình 3.16 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-1 SKLM 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-1 UPLC-PDA 42 Hình 3.18 Sắc ký đồ tổng kết phân đoạn C-5 43 Hình 3.19 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-3 HT-4 SKLM 44 Hình 3.20 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-3 HT-4 UPLC-PDA 45 Hình 3.21 Sắc ký đồ tởng kết phân đoạn C-6 46 Hình 3.22 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-7 SKLM 47 Hình 3.23 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-2 SKLM 48 Hình 3.24 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết HT-2 UPLC-PDA 49 Hình 3.25 Sắc ký đồ tổng kết phân đoạn C-10 50 iv Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 31 Phổ 13C-NMR HT-4 (3,3’,4,4’-Tetrahydroxybiphenyl) Phụ lục 32 Phổ 13C-NMR HT-4 vùng 110 – 150 ppm PL-22 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 33 Phổ 1H-NMR HT-4 Phụ lục 34 Phổ 1H-NMR HT-4 vùng 6,6 – 7,0 ppm PL-23 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 35 Phổ HSQC HT-4 Phụ lục 36 Phổ HSQC HT-4 vùng 112 – 117 ppm PL-24 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 37 Phổ HMBC HT-4 Phụ lục 38 Phổ HMBC HT-4 vùng 6,7 – 7,0 ppm PL-25 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 39 Phổ COSY HT-4 HT-6 Phụ lục 40 Phổ APCI-MS (mode âm) HT-6 (Isoquercitrin) PL-26 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 41 Phổ 13C-NMR HT-6 (Isoquercitrin) Phụ lục 42 Phổ 13C-NMR HT-6 vùng 60 – 180 ppm PL-27 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 43 Phổ 1H-NMR HT-6 Phụ lục 44 Phổ 1H-NMR HT-6 vùng 5,4 – 7,7 ppm PL-28 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 45 Phổ 1H-NMR HT-6 vùng 3,0 – 5,6 ppm Phụ lục 46 Phổ DEPT HT-6 PL-29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 47 Phổ HSQC HT-6 Phụ lục 48 Phổ HMBC HT-6 PL-30 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 49 Phổ COSY HT-6 vùng 6,2 – 7,7 ppm Phụ lục 50 Phổ COSY HT-6 vùng 3,0 – 3,6 ppm PL-31 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM HT-7 Phụ lục 51 Phổ ESI-MS (mode âm) HT-7 (Acid 4, 4’-dihydroxy truxillic) Phụ lục 52 Phổ 13C-NMR HT-7 (Acid 4, 4’-dihydroxy truxillic) PL-32 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 53 Phổ 1H-NMR HT-7 Phụ lục 54 Phổ 1H-NMR HT-7 vùng 2,9 – 7,4 ppm PL-33 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 55 Phổ DEPT HT-7 Phụ lục 56 Phổ HSQC HT-7 PL-34 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 57 Phổ HMBC HT-7 PL-35 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 58 Phổ COSY HT-7 PL-36 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÂY TRA LÀM CHIẾU (Hibiscus tiliaceus L. ) LUẬN VĂN... (5,5 L) Tách loại chlorophyll Cao cồn l? ??ng (5,5 Cao cồn l? ??ng loại chlorophyll L) L? ??c phân bố n-Hexan (2 L × l? ??n) Cao n-Hexan (HT-A, g) CHCl3 (2 L × l? ??n) Cao CHCl3 Cao CHCl3 (HT-B, 56 (HT-B, 56 g)... thuận l? ??i hồn thành luận văn TĨM TẮT LUẬN VĂN Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa 2018-2020 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÂY TRA LÀM CHIẾU (Hibiscus tiliaceus