Ứng dụng công nghệ sinh học trong sinh tổng hợp một số Flavonoid glycosides có hoạt tính y dược học

Bời vậy, chúng tôi tiến hành áp dụng các biện pháp công nghệ sinh học hiện đại để sinh tổng họp glycosides nhằm đa dạng hoá sản phẩm, tãng năng suất và hướng tói phát triển công nghệ sản[r]

ỨNG D NG CÔNG NGHỆ SINH HỌG TRONG SINH TỎNG HỢP MỘT SỎ FLAVONOID GLYCOSIDES CÓ HOẠT TÍNH Y D ợ c HỌC

TS Nguyễn H uy Thuần* TÓM T T

Glycosides họp chất hố học có cấu trúc gồm phân tử đường gắn với phần cịn lại có chất khác steroid, flavonoid, térpenoid alkaloid, v.v Glycosides phát chù yếu thực vật có mạch xạ khuẩn (actinomycetes) đưới dạng chất trao đổi thứ sinh có hoạt tính y học quan trọng Ví đụ, chất flavonoid glycosides tách chiết từ gừng, đưa hấu, nghệ có tác dụng chống oxy hố, kháng khuẩn, kháng viêm, v.v Do đó, nhu cầu sử dụng hợp chất glycosides nghiên cứu thực tiễn (thực phẩm ăn kiêng, thuốc chữa bệnh, kháng sinh) ngắy tăng cao Tuy vậy, phương pháp tách chiết hố học để sản xuất glycosiđes có nhiều hạn chế dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, khó tiếp cận Bời vậy, chúng tơi tiến hành áp dụng biện pháp công nghệ sinh học sinh tổng họp glycosides nhằm đa dạng hoá sản phẩm, tãng suất hướng tói phát triển cơng nghệ sản xuất hợp chất Việt Nam, đặc biệt lĩnh vực dược học

* Từ khố: Vi khuẩnEsch richia coli;Cơng nghệ DNAtáitổ họp; Flavonoid; Glycosides

A pp lica tio n o f b io t chn o lo g ica l aprroa ch fo r b iosynth sis o f fla v o n o id glycosid s, th rap utically valuabl ag nts

Sum m ary

Structurally, glycosides are consisting of sugar molecule linking with the remaining one like steroid, flavonoid, terpenoid or alkaloid, etc These compounds are ubiquitous in vascular plants and actinomycetes as secondary metabolites and own lots of significantly medical and pharmaceutical effects As an example, flavonoid glycosides obtained from ginger, watermelon and turmeric display anti­oxidant, anti­inflammatory, anti­bacterial properties, etc Thereby, requirement for glycosides have been increasing in the science as well as in the human life (diet foods, drugs, antibiotics) However, chemical method for glycosides extraction still have much restricts and in this manner obtained products are of high cost as well as limiting their commercial available We have applied modern biotechnological methods for biosynthesis of flavonoid glycosides using recombinantEsch richia colias hosts It is proven as a feasible approach for structural diversification, improvement of productivity as well as green technology for synthesis of glycosidcs Furthermore, we are setting up the bases to scale up production of these valuable compounds in Vietnam

* Key words:Esch richia coli,Recombinant DNA technology; Flavonoid; Glycosides I ĐẶT VÁN ĐÈ

v ề phương diện trao đổi chất, tr nh chuyển hoá nhiều hợp chất steroid, terpenoid, alkaloid, etc thường dẫn tới phản ứng gắn phân tử đường khác (glycosylation) vào chất để tạo phân tử glycoside tan tốt nước, cớ hoạt tính bền vững tham gia nhiều tr nh sinh lý, sinh hoá thể sinh vật Những hợp chất vốn thành phần quan trọng thuốc quercetin kaempferol (Phạm Thanh Kỳ c s , 2005; Bachir c s , 1992) Trước đây, người ta thường sử dụng dạng hợp chất thô cùa glycosides lấy dịch chiết hiệu thu chưa cao Ngày có nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò glycosides chất kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn chống oxy hoá mạnh (Kren c s , 2001; Di Carlo CTV, 1999; Fuchs c s , 1993; Lê Thị Diễm Hồng c s , 2007) đó,

nhu cầu với nhóm hợp chất tăng lên Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoá học với nhược điểm phụ thuộc vào nguồn cung thực vật, hàm lượng glycoside cần tách chiết thấp, tinh phức tạp không tạo sản lượng glycosides lớn (Srivastava vàcs,2009)

Phương pháp tổng hợp hố học có hạn chế tạo sản phẩm hỗn hợp nhiều dẫn xuất, khó thiết lập điều kiện phản ứng, tinh tốn đòi hỏi nhiều thời gian (Ren vàcs, 2012) Bởi vậy, giá thành cùa glycosides thị trường cao, khó tiếp cận

Những năm gần đây, phát triển ngành thuộc công nghệ sinh học công nghệ gen protein tái tổ hợp, công nghệ vi sinh tạo bước đột phá cho phép sinh tổng họp hàng ioạt hợp chất glycoside khác góp phần tạo đa dạng hố sản phẩm, tăng suất điều quan trọng cơng nghệ sạch, gây nhiễm mơi trường Trong báo cáo này, chứng mô tả số thành tựu sinh tổng họp flavonoid glycosides thực bước xây dựng tiến hành Trường Đại học Duy Tân (Đà Nằng) nhằm hướng tới sản xuất hợp chất glycosides Việt Nam biện pháp công nghệ sinh học

1 2 3

H nh l Cấu trúc số hợp chất flavonoid dùng thí nghiệm sinh tổng họp flavonoid glycosides 1: apigenein; 2: baicalein; 3: myricetin

II. ĐÓITƯỢNG VÀ PHƯƠNGPH Á PNGHIÊN c ứ u

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Sinh tổng hợp số hợp chất flavonoid glycosides từ chất chọn lựa ban đầu (h nh 1) biện pháp công nghệ sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

* Sinh tổng hợp flavonoid glycosides: Phương pháp chuyển hóa chất sử dụng trực tiếp tế bào vi khuẩn E.coỉỉ tái tổ hợp Nguyên tắc phương pháp chuyển gen mã hóa cho flavonoid glycosyltransferase vào vi khuẩn E.coli Đồng thời, vi khuẩn cải biến gen tham gia vào chuỗi sinh tổng hợp phân tử đường (UDP­glucose TDP­rhamnose) Thí nghiệm bắt đàu việc ni cấy vi khuẩntrên mơi trường dinh dưỡng thích hợp, sau mật độ vi khuẩn đạt đến ngưỡng định th bổ sung chất flavonoid (myricetin, apigenein baicalein) Vi khuẩn chuyển hóa chất thành dạng glycosides tương ứng, giải phóng môi trường (h nh 2a, 2b) Sử dụng phương pháp tách chiết, phát sản sân phẩm TLC, HPLC, LC­ESI/MS (Thuanvàcs, 2013)

OH

O il Õ Mỵrỉcctin

Recombtiwrt E coil 8121<DEjy ^^iJfV /A iO T ­J Jỉữ

H nh 2a Sơ đồ mơ q tr nh chuyển hóa, tổng hợp myricetin­3­O­L­rhamnosides ví khuẩn

E coỉitái tổ hợp Trong đó, gen tham gia vào tr nh sinh tổng hợp TDP­L­rhamnose từ D­g ucose bao gồm:h xos kinas (HK),phosphoglyc rat mutas (PGM),TDP-gỉucos synthas (TGS),d hydrog n as

(DH), pim ras (EP) k tor ẩuctas (KR) Những gen tăng cường biểu vi khuẩn

E coli nhờ góp mặt chúng plasmid tái tổ hợp pAC­EPKR, pCDTGSDH Gen mã hoá cho rhamnosyltransferase biểu nhờ vector tái tổ hợp pGT Vi khuẩnE coỉisẽ hấp thụ myricetin từ môi trường, sau đó, xảy tr nh gắn phân tử đường TDP­rhamnose vào myricetin vị trí 3­OH nhờ có mặt enzym glycosyltransferase ưên Quá tr nh tạo sản phẩm xảy nội bào Sau glycoside xuất mơi trường ngồi

glucos -l-phosphat uridyltransf ras glucosyltransferase (tách từ Arabìdopsỉs) Sản phẩm tạo thành apigenein­7­ỡ­glucoside baicalein­7­ỡ­glucoside Một số gen tham gia vào chuỗi trao đổi chất nhánh bên bị xố để nhằm tăng tích luỹ ƯDP­glucose nội bào nhưD-gỉucos phosphat ỉsom ras (pgi),

UDP-glucos hydrolas (ushA) vàD-gỉucos -6-phosphat d hydrog n as (zwf)

* Các phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm:Sử dụng thao tác kỹ thuật di truyền đại mô tả theo protocol chuẩn (Sambrook c s , 2001) việc cắt, nối, nhân đoạn gen mong muốn (PCR) Hàm lượng chất sử dụng cho chuyển hoá 100 fiM Phương pháp sắc ký để phát hiện, đo hàm lượng tinh sản phẩm mô tả chi tiết theo tài liệu (Simkhada vàcs.2010; Thuan vàcs.2013)

m K ẾT QUẢ

* Sinh tong hợp hợp chatflavonoid glycosid s:

Bằng phương pháp tiến hành mơ tả ờHình 2a 2by sử dụng gen 3­ỡ­rhanmosyl glycosyltransferase biến nạp vào chủng vi khuẩnE coỉi

MG3, đồng thời chủng vi khuẩn cài biến đường sinh tổng hợp đường TDP­L­rhamnose để tăng sinh nhiều loại đường Cuối cùng, thu chủng tái tổ hợpE coỉiM3G3 Chủng sau sử dụng để chuyển hóa chất thuộc nhóm flavonol myricetin, cho sản phẩm myricetin­ 3­O­L­rhamnoside Sản phẩm phát hiện, đo hàm lượng phương pháp sắc ký TLC, HPLC LC­ESI/MS (h nh 3a, 3b, 3c) Hàm lượng sản phẩm tối đa thu nhận 55,6 ỆiM

i

m ỵricetm

m ỉd cetm -th ao m osỉđe

H nh 3a sắc ký lớp mỏng (TLC) myricetin dẫn xuất rhamnosiđes (2) so với đối chứng (1)

A

iĩ

+Ả H1 A (12hí

_ A

ử

|Ị (24hí

/ t _

ử

ẳ Ầ h (36h) _aa_.

+

1 ủ

h ị*m

ứ

h (60h)

6 ỉ 10 n 14 it II 20

H nh 3b: Phân tích HPLC tr nh chuyển hoá myricetin (khoảng phút thứ 8) thành rayricetm­3­O­L­rhamnosiđe (khoảng phút thứ 10)

Oil

[Myricclín­3­f>­rỉ)atti K>s dc]'

46S.10ỈI

1 Ọ » T

p »K

319.0444

rnm

1 IB MI «s «1 a ĩ» ỉe 260 % 3JJ a 3« Ỉ60 so « eo w I HI SĐQ S20' m/z

H nh 3c Dữ liệu LC­ESI/MS phân tử myricetin­3­O­rhamnoside

Tương tự, tiến hành thiết kế tạo chủng E coli MA3F mang gen mã hóa cho

1-0-glucosyltransferase từArabidopsis thaỉỉana.Chuỗi gen sinh tổng hợp UDP­Đ­glucose cải biến để tăng cường tích lữy hợp chất Vi khuẩn sử dụng nhà máy tế bào (microbial factory) thực chuyển hóa chất thuộc nhóm flavones apigenein baicalein thành sàn phẩm tương ứng apigenein­7­O­glucoside baicalein­7­ơ­ghicosiđe Các sản phẩm phát hiện, đo hàm lượng phương pháp TLC, HPLC, LC­ESI/MS (H nh 4a, 4b, 4c, 4d, 4e) Hiệu suất chuyển hóa chất điều kiện tối ưu 90,88 76,82 %tương ửng với 90,88 76,82 |iM

1 3

*

Re

lat

ive

a

bn

jjd

ao

ce

(

Vi

)

Minutes

H nh 4b Dữ liệu HPLC phân tích chuyển hố apigenin (khoảng phút thứ 5) thành glucoside tương ứng (khoảng phút thứ 9)

' W í r

271.0620

120^812 J46.0617225.0650 247.Ị44Ô

m trn n TTTtmi IT*>y

433.1144

272,0543

7

273.0664 9MIWI] 331.2108 368 0061

434.1173/

^35-1188 521.1299

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

l l/z

H nh 4c Dữ liệu LC­ESI/MS phân từ apigenin­7­O­glucosiđe

H nh 4e Dữ liệu LC­ESI/MS phân tử baicalein­7­O­glucoside

IV M Ộ T SÓ NỘ I DUNG N G HIÊN c ứ u ĐÃ VÀ ĐANG ĐƯỢC TR I N K H AI TẠ I ĐẠI HỌC DUY TÂN

Phương pháp kết nghiên cứu sinh tổng hợp glycosiđes đă tr nh bày có ý nghĩa quan trọng giúp cho tác giả vàc s có sở thiết lập phịng thí nghiệm, máy móc thiết bị, chủng giống vi khuẩn, vật liệu di truyền hóa chất liên quan Bắt đầu từ tháng 01 năm 2012, nay, nhờ đầu tư đặc biệt Hội đồng quản trị lãnh đạo Ban giám hiệu nhà trường, chúng tơi xây dựng Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử với thiết bị đại, đồng phục vụ cho nghiên cứu giảng dạy Cụ thể với thí nghiệm làm sinh tổng hợp glycoside nói riêng hợp chất có hoạt tính nói chung, chúng tơi đầu tư đầy đủ trang thiết bị, vật tư thí nghiệm để làm tách dịng (gen cloning), biểu gen, làm thí nghiệm sinh tổng hợp in­vitro in­vivo Ngoài ra, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu phát hiện, tách chiết, tinh đă đầu tư TLC, HPLC, cột tinh vật tư kèm, thiết bị lên men, chưng cất đông khô Hiện nay, triển khai sinh tổng hợp số dẫn xuất cùa flavonoid flavonoid glycoside, flavonoid bị methyl hóa họp chất carotenoid Hướng ưu tiên chúng tồi thiết lập quy tr nh sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học sử dụng biện pháp công nghệ sinh học đại tập trung đầu tư trọng điểm cho lĩnh vực dược học

V K ẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân Nguyễn Xuân Thắng, 2007 Nghiên cứu tác đụng chống viêm mạn saponin flavonoid kim ngân(Lonic rajaponicaThunb.) Tạp chí dược học, 378, tr.24­29

2 Phạm Thanh Kỳ, Phí Tùng Lâm Vũ Thị Nguyệt Minh, 2005 Kết nghiên cứu flavonoid mức hoa Irắng (Holarrhena anditysenterica wall­Apocynaceae) Tạp chí Thơng tin Y được, 11, tr.25­27

3 Bachir B; Albert JC; Mourad K; and Francois T 1992 FJavonoid glycosides from Erica cinerea Phytochemistry 31, pp.2483­2486

4 Di Carlo G; Mascolo N, Izzo, AA; and Capasso F 1999 Flavonoids: old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs Life Science, 65, pp.337­353

5 Fuchs J, Milbrađt R, 1993 Skin anti­inflammatory activity of apigenein­7­glucoside in rats Aizneimittelforschung, 43, pp.370­372

6 KrenV, Martinkova L 2001 Glycosides in medicine: the role of glycosidic residue in biological activity Current Medicial Chemistry 8, pp.1303­1328

7 Nguyen Huy Thuan, 2013 Synthesis of flavonoid and sterol glycosides by biotransformation, (doctoral dissertation), Sun Moon University, Korea

8 Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang, L, and Wang PG (2012) Synthesis of flavonoi 3­O­glycoside by UGT78D1 Glycoconjugate Journal, 29, pp.425­432

9 Sambrook J, Russell Dw,2001 Molecular cloning: A laboratory manual 3rdedition.Cold Spring: Harbor Laboratory Press NewYork, USA

10 Sirakhada D, Lee HC, Sohng JK., 2010 Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyi fiavonoids from Escherichia coll Biotechnology and bioengineering, 107(1), pp.154­62

11 Srivastava, JK, Gupta, s, 2009 Extraction, characterization, stability and biological activity of fiavonoids isolated from chamomile flowers Molecular and celỉular Pharmacology, , pp.138

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MƠ u TRÊN CHUỘT

THIẾU H T MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ THANH QUẢN NGƯỜI

Ths Nguyễn T hị B ình*

H ởng dẫn; PGS TS Trịnh Xuân Đàn*

TĨM T T

Ung thư biểu mơ quản bệnh lý ác tính thường gặp đứng thứ hai ung thư vùng đầu cổ sau ung thư vòm Xuất phát từ thực tế, Việt Nam vẩn đề tạo mô h nh ung thư biểu mô quan người chuột nuđe chưa nghiên cứu nhiêu Chính v vậy, chúng tơi tiên hành nghiên cứu với mục tiêu: Xây đựng mô h nh tạo khối ung thư quản người chuột thiểu hụt miễn dịch kỹ thuật ghép dị lồi; Mơ tả đặc điểm h nh thái mả u chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư quản người

Đối tưọ­ng phương pháp nghiên cứu: 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, khơng có tế bào lympho T (nude mice, Foxnlnu) nhập từ Công ty Charles­River (Hoa Kỳ) Dòng tế bào úng thư biểu mô quản n p ố i Hep­2 mua từ công ty ATCC, Hoa Kỳ Tiến hành tiêm vào đa đui bên phải chuột dung dịch chứa tê bào ung thư với số lượng lx 106 tế bào/chuột cho tổng số 10 chuột Sau theo dõi h nh thành khồi u ưên chuột lấy mô u làm giải phẫu bệnh sau ghép tuần

Kết quả: 10 ngày sau ghép tế bào, 10/10 (Ỉ00%) chuột h nh thành khối u, kích thước khối u đạt 37,2±7,1 mm3 Sau tuần, khối u phát triển đạt kích thước trung b nh 593,6±117,2 mm3 Trên tiêu nhuộm HE: tế bào uCO

h nh đa điện, nhân to nhỏ không đều, tăng kiềm tính, chất màu thơ đậm, nhiều h nh ảnh nhân chia bất thường tỷ lẹ nhân so với bào tương lớn Một sổ nơi tế u bị loạn sừng tạo thành cầu sừng Quan sát mô u kính hien vi điện tửừuỵền qua cho thấy tế bào ung íhư có h nh cầu, h nh bẩú dục h nh đa diện có nhân lớn chiếm gần 2/3 tể bào phản ánh tỷ iệ hạt nhân cao Một số tế bào ung thư có h nh ảnh lõm hạt nhân

* Đại học Y Dược Thái Nguyên