Ứng dụng công nghệ sinh học trong sinh tổng hợp một số flavonoid glycosides có hoạt tính y dược học

ỨNG D NG CÔNG NGHỆ SINH HỌG TRONG SINH TỎNG HỢP MỘT SỎ FLAVONOID GLYCOSIDES CĨ HOẠT TÍNH Y D ợ c HỌC TS N guyễn H uy Th uần * TÓM T T Glycosides họp chất hố học có cấu trúc gồm phân tử đường gắn với phần cịn lại có chất khác steroid, flavonoid, térpenoid alkaloid, v.v Glycosides phát chù yếu thực vật có mạch xạ khuẩn (actinomycetes) đưới dạng chất trao đổi thứ sinh có hoạt tính y học quan trọng Ví đụ, chất flavonoid glycosides tách chiết từ gừng, đưa hấu, nghệ có tác dụng chống oxy hố, kháng khuẩn, kháng viêm, v.v Do đó, nhu cầu sử dụng hợp chất glycosides nghiên cứu thực tiễn (thực phẩm ăn kiêng, thuốc chữa bệnh, kháng sinh) ngắy tăng cao Tuy vậy, phương pháp tách chiết hoá học để sản xuất glycosiđes có nhiều hạn chế dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, khó tiếp cận Bời vậy, tiến hành áp dụng biện pháp công nghệ sinh học sinh tổng họp glycosides nhằm đa dạng hoá sản phẩm, tãng suất hướng tói phát triển cơng nghệ sản xuất hợp chất Việt Nam, đặc biệt lĩnh vực dược học * Từ khoá: Vi khuẩn Esch richia coli; Công nghệ DNA tái tổ họp; Flavonoid; Glycosides A p p lic a tio n o f b io t c h n o lo g ic a l a p r ro a c h f o r b io s y n th sis o f f la v o n o id g lycosid s, th rap u tica lly valu ab l a g n ts S u m m ary Structurally, glycosides are consisting of sugar molecule linking with the remaining one like steroid, flavonoid, terpenoid or alkaloid, etc These compounds are ubiquitous in vascular plants and actinomycetes as secondary metabolites and own lots of significantly medical and pharmaceutical effects As an example, flavonoid glycosides obtained from ginger, watermelon and turmeric display anti­oxidant, anti­inflammatory, anti­bacterial properties, etc Thereby, requirement for glycosides have been increasing in the science as well as in the human life (diet foods, drugs, antibiotics) However, chemical method for glycosides extraction still have much restricts and in this manner obtained products are of high cost as well as limiting their commercial available We have applied modern biotechnological methods for biosynthesis of flavonoid glycosides using recombinant Esch richia coli as hosts It is proven as a feasible approach for structural diversification, improvement of productivity as well as green technology for synthesis of glycosidcs Furthermore, we are setting up the bases to scale up production of these valuable compounds in Vietnam * Key words: Esch richia coli, Recombinant DNA technology; Flavonoid; Glycosides I ĐẶT VÁN ĐÈ v ề phương diện trao đổi chất, qu tr nh chuyển hoá nhiều hợp chất steroid, terpenoid, alkaloid, etc thường dẫn tới phản ứng gắn phân tử đường khác (glycosylation) vào chất để tạo phân tử glycoside tan tốt nước, cớ hoạt tính bền vững tham gia nhiều tr nh sinh lý, sinh hoá thể sinh vật Những hợp chất vốn thành phần quan trọng thuốc quercetin kaempferol (Phạm Thanh Kỳ c s , 2005; Bachir c s , 1992) Trước đây, người ta thường sử dụng dạng hợp chất thô cùa glycosides lấy dịch chiết hiệu thu chưa cao Ngày có nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò glycosides chất kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn chống oxy hoá mạnh (Kren c s , 2001; Di Carlo CTV, 1999; Fuchs c s , 1993; Lê Thị Diễm Hồng c s , 2007) đó, * Đại học Duy Tân Đà Năng 574 nhu cầu với nhóm hợp chất tăng lên Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoá học với nhược điểm phụ thuộc vào nguồn cung thực vật, hàm lượng glycoside cần tách chiết thấp, tinh phức tạp không tạo sản lượng glycosides lớn (Srivastava cs, 2009) Phương pháp tổng hợp hố học có hạn chế tạo sản phẩm hỗn hợp nhiều dẫn xuất, khó thiết lập điều kiện phản ứng, tinh tốn đòi hỏi nhiều thời gian (Ren cs, 2012) Bởi vậy, giá thành cùa glycosides thị trường cao, khó tiếp cận Những năm gần đây, phát triển ngành thuộc công nghệ sinh học công nghệ gen protein tái tổ hợp, công nghệ vi s in h tạo bước đột phá cho phép sinh tổng họp hàng ioạt hợp chất glycoside khác góp phần tạo đa dạng hoá sản phẩm, tăng suất điều quan trọng cơng nghệ sạch, gây nhiễm môi trường Trong báo cáo này, chứng mô tả số thành tựu sinh tổng họp flavonoid glycosides thực bước xây dựng tiến hành Trường Đại học Duy Tân (Đà Nằng) nhằm hướng tới sản xuất hợp chất glycosides V iệt Nam biện pháp công nghệ sinh học H nh l Cấu trúc m ột số hợp chất flavonoid dùng thí nghiệm sinh tổng họp flavonoid glycosides 1: apigenein; 2: baicalein; 3: myricetin II Đ Ó I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG P H Á P NGHIÊN c ứ u 2.1 Đối tượ ng n gh iên cứu Sinh tổng hợp số hợp chất flavonoid glycosides từ chất chọn lựa ban đầu (h nh 1) biện pháp công nghệ sinh học 2.2 P h ương p h p ng hiên u * Sinh tổng hợp flavonoid glycosides: Phương pháp chuyển hóa chất sử dụng trực tiếp tế bào vi khuẩn E.coỉỉ tái tổ hợp Nguyên tắc phương pháp chuyển gen mã hóa cho flavonoid glycosyltransferase vào vi khuẩn E.coli Đồng thời, vi khuẩn cải biến gen tham gia vào chuỗi sinh tổng hợp phân tử đường (UDP­glucose TD P­rhamnose) T hí nghiệm bắt đàu việc nuôi cấy vi k h u ẩ n trê n môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau m ật độ vi khuẩn đạt đến ngưỡng định th bổ sung chất flavonoid (myricetin, apigenein baicalein) Vi khuẩn chuyển hóa chất thành dạng glycosides tương ứng, giải phóng mơi trường (h nh 2a, 2b) Sử dụng phương pháp tách chiết, phát sản sân phẩm n hư TLC, HPLC, LC­ESI/MS (T hu anv cs, 2013) 575 OH Recombtiwrt E coil 12 1­rỉ)atti K>s dc]' p 46S.10ỈI Ọ »T »K 319.0444 rnm IB MI « s «1 a ĩ» ỉe 260 % 3JJ a 3« Ỉ60 so « eo w I H I SĐQ S20' m/z H nh 3c D ữ liệu LC­ESI/MS phân tử myricetin­3­O­rhamnoside Tương tự, tiến hành thiết kế tạo chủng E coli MA 3F mang gen mã hóa cho 1-0glucosyltransferase từ Arabidopsis thaỉỉana Chuỗi gen sinh tổng hợp UDP­Đ­glucose cải biến để tăng cường tích lữy hợp chất Vi khuẩn sử dụng nhà máy tế bào (microbial factory) thực chuyển hóa chất thuộc nhóm flavones apigenein baicalein thành sàn phẩm tương ứng apigenein­7­O­glucoside baicalein­7­ơ­ghicosiđe Các sản phẩm phát hiện, đo hàm lượng phương pháp TLC, HPLC, LC­ESI/MS (H nh 4a, 4b, 4c, 4d, 4e) Hiệu suất chuyển hóa chất điều kiện tối ưu 90,88 76,82 % tương ửng với 90,88 76,82 |i M * substrates H nh 4a sắ c ký lớp mỏng phát chuyển hoá flavones thành dẫn xuất apigenin­7­O­glucoside (2) baỉcaỉein~7­ơ­glucoside (3) so với đối chứng (1) Minutes H nh 4b Dữ liệu HPLC phân tích chuyển hố apigenin (khoảng phút thứ 5) thành glucoside tương ứng (khoảng phút thứ 9) Relative abnjjdaoce (Vi) 'W í r 271.0620 433.1144 272,0543 434.1173 120^812 J46.0617225.0650 247.Ị44Ô 273.0664 331.2108 100 m tr n n TTTtmi IT*>y 150 200 250 300 350 l l/z 9MIWI] 368 0061 400 / ^35-1188 450 521.1299 500 550 H nh 4c D ữ liệu LC­ESI/MS phân từ apigenin­7­O­glucosiđe H nh 4d Dữ liệu HPLC phân tích chuyển hoá baicalien (phút thứ 5.5) thành glucoside tương ứng (khoảng phút thử 9,5) H nh 4e D ữ liệu LC­ESI/M S phân tử baicalein­7­O­glucoside IV M Ộ T SÓ N Ộ I D UN G N G H IÊ N c ứ u ĐÃ VÀ ĐAN G Đ Ư Ợ C T R I N K H A I T Ạ I ĐẠ I H Ọ C DUY TÂN Phương pháp kết nghiên cứu sinh tổng hợp glycosiđes đă tr nh bày có ý nghĩa quan trọng giúp cho tác giả c s có sở thiết lập phịng thí nghiệm, máy móc thiết bị, chủng giống vi khuẩn, vật liệu di truyền hóa chất liên quan Bắt đầu từ tháng 01 năm 2012, nay, nhờ đầu tư đặc biệt Hội đồng quản trị lãnh đạo Ban giám hiệu nhà trường, xây dựng Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử với thiết bị đại, đồng phục vụ cho nghiên cứu giảng dạy C ụ thể với thí nghiệm làm sinh tổng hợp glycoside nói riêng v hợp chất có hoạt tính nói chung, đầu tư đầy đủ trang thiết bị, vật tư thí nghiệm để làm tách dịng (gen cloning), biểu gen, làm thí nghiệm sinh tổng hợp in­vitro in­vivo Ngoài ra, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu phát hiện, tách chiết, tinh đă đầu tư TLC, HPLC, cột tinh vật tư kèm, thiết bị lên men, chưng cất đông khô Hiện nay, triển khai sinh tổng hợp số dẫn xuất cùa flavonoid flavonoid glycoside, flavonoid bị methyl hóa họp chất carotenoid Hướng ưu tiên chúng tồi thiết lập quy tr nh sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học sử dụng biện pháp công nghệ sinh học đại tập trung đầu tư trọng điểm cho lĩnh vực dược học V K ẾT LUẬN Chóng tơi ứng dụng số kỹ thuật sinh học phân tử việc sinh tổng hợp thành cơng hợp chất fiavonoid glycosides (chuyển hóa in­vivo) bao gồm myricetin­3­O­L­rhamnoside, apigenein­7­O­glucoside baicalein­7­O­gỉucosiđe Các thí nghiệm tiến hành sở phân tích mối quan hệ ĐNA­ protein để thiết lập hệ thổng sinh học phục vụ chuyển hố Sau đó, k ỹ thuật sắc ký sử dụng để phát (định tính) đo hàm lượng sản phẩm tạo thành (định lượng) Các phương pháp sinh tổng hợp trở nên phổ biến nước phát triển Tuy nhiên, V iệt Nam, việc ửng dụng, cải biến chúng bước đầu Do vậy, chúng tơi thiết lập phịng thí nghiệm sinh tổng hợp tiến tới nghiên cứu quy tr nh sản xuất chất có hoạt tính sinh học sử dụng nguồn gen từ thực vật, động vật vi sinh vật khác cách sử đụng vi khuẩn E coli tái tổ họp làm vật chủ 580 TÀ I LIỆ U TH A M K H Ả O Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân Nguyễn Xuân Thắng, 2007 Nghiên cứu tác đụng chống viêm mạn saponin flavonoid kim ngân (Lonic rajaponica Thunb.) Tạp chí dược học, 378, tr.24­29 Phạm Thanh Kỳ, Phí Tùng Lâm Vũ Thị Nguyệt Minh, 2005 Kết nghiên cứu flavonoid mức hoa Irắng (Holarrhena anditysenterica wall­Apocynaceae) Tạp chí Thơng tin Y được, 11, tr.25­27 Bachir B; Albert JC; Mourad K; and Francois T 1992 FJavonoid glycosides from Erica cinerea Phytochemistry 31, pp.2483­2486 Di Carlo G; Mascolo N, Izzo, AA; and Capasso F 1999 Flavonoids: old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs Life Science, 65, pp.337­353 Fuchs J, Milbrađt R, 1993 Skin anti­inflammatory activity of apigenein­7­glucoside in rats Aizneimittelforschung, 43, pp.370­372 KrenV, Martinkova L 2001 Glycosides in medicine: the role of glycosidic residue in biological activity Current Medicial Chemistry 8, pp.1303­1328 Nguyen Huy Thuan, 2013 Synthesis of flavonoid and sterol glycosides by biotransformation, (doctoral dissertation), Sun Moon University, Korea Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang, L, and Wang PG (2012) Synthesis of flavonoi 3­O­glycoside by UGT78D1 Glycoconjugate Journal, 29, pp.425­432 Sambrook J, Russell D w, 2001 Molecular cloning: A laboratory manual 3rdedition.Cold Spring: Harbor Laboratory Press NewYork, USA 10 Sirakhada D, Lee HC, Sohng JK., 2010 Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyi fiavonoids from Escherichia coll Biotechnology and bioengineering, 107(1), pp.154­62 11 Srivastava, JK, Gupta, s, 2009 Extraction, characterization, stability and biological activity of fiavonoids isolated from chamomile flowers Molecular and celỉular Pharmacology, , pp.138 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MƠ u TRÊN CHUỘT THIẾU H T MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ THANH QUẢN NGƯỜI Ths N guyễn T h ị B ìn h * TÓM T T H ởng dẫn; PGS TS Trịnh X uân Đàn* Ung thư biểu mô quản bệnh lý ác tính thường gặp đứng thứ hai ung thư vùng đầu cổ sau ung thư vòm Xuất phát từ thực tế, Việt Nam vẩn đề tạo mô h nh ung thư biểu mô quan người chuột nuđe chưa nghiên cứu nhiêu Chính v vậy, chúng tơi tiên hành nghiên cứu với mục tiêu: Xây đựng mô h nh tạo khối ung thư quản người chuột thiểu hụt miễn dịch kỹ thuật ghép dị lồi; Mơ tả đặc điểm h nh thái mả u chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư quản người Đối tưọ­ng phương pháp nghiên cứu: 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, khơng có tế bào lympho T (nude mice, Foxnlnu) nhập từ Công ty Charles­River (Hoa Kỳ) Dịng tế bào úng thư biểu mơ quản n p ố i Hep­2 mua từ công ty ATCC, Hoa Kỳ Tiến hành tiêm vào đa đui bên phải chuột dung dịch chứa tê bào ung thư với số lượng lx 106 tế bào/chuột cho tổng số 10 chuột Sau theo dõi h nh thành khồi u ưên chuột lấy mô u làm giải phẫu bệnh sau ghép tuần Kết quả: 10 ngày sau ghép tế bào, 10/10 (Ỉ00%) chuột h nh thành khối u, kích thước khối u đạt 37,2 ± 7,1 mm3 Sau tuần, khối u phát triển đạt kích thước trung b nh 593,6 ± 117,2 mm3 Trên tiêu nhuộm HE: tế bào u CO h nh đa điện, nhân to nhỏ không đều, tăng kiềm tính, chất màu thơ đậm, nhiều h nh ảnh nhân chia bất thường tỷ lẹ nhân so với bào tương lớn Một sổ nơi tế u bị loạn sừng tạo thành cầu sừng Quan sát mơ u kính hien vi điện tửừuỵền qua cho thấy tế bào ung íhư có h nh cầu, h nh bẩú dục h nh đa diện có nhân lớn chiếm gần 2/3 tể bào phản ánh tỷ iệ hạt nhân cao Một số tế bào ung thư có h nh ảnh lõm hạt nhân * Đại học Y Dược Thái Nguyên 581 ... n gh iên cứu Sinh tổng hợp số hợp chất flavonoid glycosides từ chất chọn lựa ban đầu (h nh 1) biện pháp công nghệ sinh học 2.2 P h ương p h p ng hiên u * Sinh tổng hợp flavonoid glycosides: Phương... học sử dụng biện pháp công nghệ sinh học đại tập trung đầu tư trọng điểm cho lĩnh vực dược học V K ẾT LUẬN Chóng tơi ứng dụng số kỹ thuật sinh học phân tử việc sinh tổng hợp thành công hợp chất... khai sinh tổng hợp số dẫn xuất cùa flavonoid flavonoid glycoside, flavonoid bị methyl hóa họp chất carotenoid Hướng ưu tiên chúng tồi thiết lập quy tr nh sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học