Đánh giá quy trình định danh vi khuẩn acinetobacter baumannii bằng kỹ thuật multiplex pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN HỮU THẠNH ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN HỮU THẠNH ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TÚ ANH TS.BS VŨ BẢO CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn nghiên cứu riêng Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tác giả Trần Hữu Thạnh ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÓM TẮT Mục tiêu: - Thực quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR - Đánh giá quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR Phƣơng pháp nghiên cứu: vi khuẩn Gram âm đƣợc phân lập từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân bệnh viện 175 (TP HCM), bệnh viện Bình dân (TP HCM), bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Dƣơng, bệnh viện đa khoa Thống tỉnh Đồng Nai Vi khuẩn phân lập đƣợc định danh 02 phƣơng pháp: (1) thực phản ứng sinh hóa với kit IDS 14 GNR (2) kỹ thuật multiplex PCR, với 02 cặp mồi P-AbITSF; P-Ab-ITSB P-rA1; P-rA2 đƣợc sử dụng để phát vi khuẩn A baumannii Tiến hành đánh giá quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR dựa tiêu độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dƣơng, giá trị tiên đốn âm, độ lặp lại, độ xác Kết quả: 378 vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đƣợc định danh phƣơng pháp sinh hóa kỹ thuật multiplex PCR Bằng phƣơng pháp sinh hóa xác định 252/378 mẫu A baumannii, 76/378 Acinetobacter spp., 50/378 vi khuẩn không thuộc chi Acinetobacter Với quy trình định danh kỹ thuật multiplex PCR xác định 306/378 mẫu A baumannii, 22/378 Acinetobacter spp., 50/378 vi khuẩn chi Acinetobacter Quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR đƣợc đánh giá với kết thông số nhƣ sau: độ nhạy (100%), độ đặc hiệu (100%), giá trị tiên đoán dƣơng (100%), giá trị tiên đoán âm (100%), độ lặp lại (100%), độ xác (100%) EVALUATION OF THE IDENTIFICATION PROCESS OF ACINETOBACTER BAUMANNII APPLYING MULTIPLEX PCR TECHNIQUE SUMMARY Objective: - Identifying A baumannii applying multiplex PCR technique - Evaluating the identification process of A baumannii applying multiplex PCR technique Method: Gram-negative bacteria were isolated from biological samples of patients treated at the 175 Hospital and the Binh Dan Hospital in Ho Chi Minh City, the General Hospital in Binh Duong, the Thong Nhat General Hospital in Dong Nai Bacteria identified by biochemical reaction method were performed using KIT IDS 14 GNR and conducted identification in parallel applying multiplex PCR technique with the two primers P-Ab-ITSF; P-Ab-ITSB and P-RA1; P-rA2 Evaluation the identification process of A baumannii by multiplex PCR technique based on sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, repeatability, and accuracy Results: There were 378 bacterial samples identified by biochemical method and multiplex PCR technique Applying biochemical method, there are 252/378 samples of A baumannii, 76/378 of Acinetobacter spp., 50/378 are bacteria not belonging to the genus Acinetobacter Meanwhile, applying multiplex PCR technique, there are 306/378 samples of A baumannii, 22/378 of Acinetobacter spp., 50/378 is bacteria not belonging to the genus Acinetobacter The identification of A baumannii using multiplex PCR was evaluated with the following results: sensitivity (100%), specificity (100%), positive predictive value (100%), negative predictive value (100%), repeatability (100%), accuracy (100%) MỤC LỤC Trang DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU .1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 VI KHUẨN CHI ACINETOBACTER 1.2 NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI KHUẨN A BAUMANNII 1.4 GEN 16 S rRNA CỦA TẾ BÀO VI KHUẨN 11 1.5 VÙNG ITS 16 S-23 S rRNA 12 1.6 GEN recA 13 1.7 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 14 1.8 THẨM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH, TIÊU CHÍ CỦA QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VK A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 16 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 34 3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN A BAUMANNII 34 3.2 PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT HÌNH DẠNG VI KHUẨN 44 3.3 ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG BỘ KIT IDS 14 GNR 45 3.4 PHÁT HIỆN VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 46 3.5 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 49 i CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 54 4.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII 54 4.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 55 4.3 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG .55 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 KẾT LUẬN 57 5.2 ĐỀ NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC PHỤ LỤC I Phụ luc Kết định danh vi khuẩn A baumannii kit IDS 14 GNR I Phụ lục Kết định danh vi khuẩn Gram (-) A baumannii đƣợc phân lập bệnh viện kit IDS 14 GNR VII Phụ lục Hình thái khóm vi khuẩn A baumannii phân lập mơi trƣờng MC, hình ảnh vi khuẩn quan sát dƣới kính hiển vi x1000 kết định danh kit IDS 14 GNR VIII Phụ lục Hình thái khóm vi khuẩn Gram (-) phân lập mơi trƣờng MC, hình ảnh vi khuẩn quan sát dƣới kính hiển vi x1000 kết định danh kit IDS 14 GNR XXVII phu lục Kết định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR XXX Phụ lục Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn XXXIV i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHÚ GIẢI TỪ VIẾT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT A baumannii Acinetobacter baumannii Vi khuẩn A baumannii ARDRA Amplified Ribosomal DNA TẮT Restriction Analysis DNA Deoxyribonucleic acid Bp Base pair BVĐK CDC Cặp base Bệnh viện đa khoa Center for Disease Cotrol and Trung tâm kiểm soát phòng Prevention ngừa dịch bệnh Mỹ CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc Datp Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic acid GDP Gross Domestic Product HSTC Tổng sản phẩm quốc nội Hồi sức tích cực ITS Intergenis spacer MC MacConkey mM Milimolar NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện NPV Negative predictive value Giá trị tiên đoán âm PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi DNA PFGE Pulsed field gel electrophoresis Điện di gel xung trƣờng PPV Positive predictive value Giá trị tiên đoán dƣơng RFLP Restriction fragment length Phân tích đa hình chiều dài Polymorphisms giới hạn RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid se Sensitivity Độ nhạy sp Specificity Độ đặc hiệu Tm Melting temperature Nhiệt độ chảy TN True negative Âm tính thật TP True positive Dƣơng tính thật TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth IU International Unit Đơn vị quốc tế UV Ultraviolet Tia cực tím WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các cơng trình nghiên cứu nƣớc ƣng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh vi khuẩn 14 Bảng 2.2 Các cơng trình nghiên cứu nƣớc ƣng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh vi khuẩn 15 Bảng 2.3 Một số hoá chất 23 Bảng 2.4 Dụng cụ 24 Bảng 2.5 Thiết bị 24 Bảng 2.6 Bộ kit IDS 14 GNR 25 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng multiplex PCR phát vi khuẩn A baumannii 30 Bảng 2.8 Chƣơng trình luân nhiệt phản ứng multiplex PCR phát vi khuẩn A baumannii 31 Bảng 2.9 Trình tự mồi đặc hiệu phát vi khuẩn A baumannii 31 Bảng 2.10 Mẫu bệnh phẩm nhiểm A baumannii BVĐK Thống Nhất, Đồng Nai34 Bảng 2.11 Mẫu bệnh phẩm nhiểm A baumannii bệnh viện 175 38 Bảng 2.12 Mẫu bệnh phẩm nhiểm A baumannii bệnh viện Bình Dân 39 Bảng 2.13 Mẫu bệnh phẩm nhiểm A baumannii BVĐK tỉnh Bình Dƣơng 40 Bảng 2.14 Mẫu bệnh phẩm nhiểm vi khuẩn Gram (-) khơng phải A baumannii 41 Bảng 2.15 Tóm tắt tỉ lệ nhiễm A baumannii khoa điều trị bệnh viện 43 Bảng 2.16 Tóm tắt tỉ lệ nhiễm A baumannii mẫu bệnh phẩm 43 Bảng 2.17 So sánh kết định danh vi khuẩn A baumannii kit IDS 14 GNR phản ứng sinh hóa bệnh viện 45 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XX Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXI Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXII Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXIII Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXIV Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXV Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXVI Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXVII Phụ lục Hình thái khóm vi khuẩn Gram (-) phân lập mơi trƣờng MC, hình ảnh vi khuẩn quan sát dƣới kính hiển vi x1000 kết định danh kit IDS 14 GNR (a) Hình thái khóm vi khuẩn phân lập mơi trƣờng MC; (b) Hình ảnh nhuộm Gram quan sát dƣới kính hiển vi x1000; (c) Hình ảnh kết định danh kit IDS 14 GNR Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXVIII Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXIX Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXX phu lục Kết định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXXI Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXXII Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXXIII Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh XXXIV Phụ lục Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng Tryptic Soy Broth (TSB) Pepton từ casein 17 g Pepton từ đậu nành 3g NaCl 5g D (+) – glucose 2,5 g K2HPO4 2,5 g pH 7,3 0,2 (25 °C) Môi trƣờng MacConkey (MC) Pepton từ gelatin 17 g Pepton từ casein 1,5 g Pepton từ thịt 1,5 g NaCl 5g Lactose 10 g Hỗn hợp muối mật 1,5 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,001 g Thạch 13,5 g pH 7,1 0,2 (25 °C) Môi trƣờng Tryptic Soy Agar (TSA) Pepton từ casein 15 g Pepton từ đậu nành 5g NaCl 5g Thạch 15 g pH 7,3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 0,2 (25 °C) ... ? ?Đánh giá quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR? ?? đƣợc thực MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thực quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR - Đánh giá quy trình. .. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 55 4.3 KHẢ NĂNG ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN A BAUMANNII BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRONG XÉT NGHIỆM VI. .. tiêu: - Thực quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR - Đánh giá quy trình định danh vi khuẩn A baumannii kỹ thuật multiplex PCR Phƣơng pháp nghiên cứu: vi khuẩn Gram âm