Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực : CAO THỊ THANH THÚY MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Hoài Hƣơng Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn Luận văn đƣợc rõ nguồn gốc TP HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực Cao Thị Thanh Thúy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời cho xin gởi tất lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên chỗ vựa tinh thần vững cho con, ngƣời giúp đứng vững sau lần vấp ngã để có đƣợc nhƣ ngày hơm Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin gửi lời cám ơn chân thành tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trƣờng Đại học Cơng Nghệ TP.HCM nói chung thầy giáo khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, mơn Cơng Nghệ Sinh Học nói riêng tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báo suốt thời gian qua Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trƣờng, trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh Cảm ơn tất bạn động viên, giúp đỡ em suốt trình thời gian học tập trƣờng Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đồng hành chia sẻ buồn vui em suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực Cao Thị Thanh Thúy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Các kết đạt đƣợc đề tài Kết cấu đồ án Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1 Hợp chất thứ cấp 1.1.2 Triển vọng tiếm sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.2 Giới thiệu Prodigiosin 1.2.1 Khái niệm Prodigiosin 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm Prodigiosin 1.2.3 Hoạt động sinh học Prodigiosin 1.2.4 Cơ chế tổng hợp Prodigiosin Serratia marcescens 10 1.3 Giới thiệu Serratia marcescens 14 1.3.1 Lịch sử phát 14 1.3.2 Phân loại khoa học Serratia marcescens 15 1.3.3 Đặc điểm Serratia marcescens 15 1.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 19 1.4.1 Sắc tố 19 1.4.2 Biosurfactant 20 1.4.3 Acid béo 20 1.4.4 Enzyme 20 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.5 Yếu tố động lực Serratia marcescens 21 1.5 Khả diệt sâu Serratia marcescens 22 1.6 Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens 24 1.7 Thu nhận tinh prodigiosin 27 1.8 Một số nghiên cứu giới 30 1.8.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 30 1.8.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin 30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Vật liệu – hóa chất – thiết bị 34 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 34 2.2.2 Môi trường nuôi cấy hóa chất 34 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 35 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 36 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.4.1 Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả tổng hợp prodigiosin enzyme ngoại bào mạnh 41 2.4.2 Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống 44 2.4.3 Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men chế độ lên men 44 2.4.4 Phương pháp phân tích 47 Mục đích 47 Nội dung 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào prodigiosin cao 48 ii Đồ án tốt nghiệp 3.1.1 Khả tiết enzyme ngoại bào 48 3.1.2 Trích ly thu prodigiosin 52 3.1.3 So sánh hình thái, sinh lý, khả tiết enzyme ngoại bào chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) 54 3.2 Thiết lập môi trƣờng nhân giống 56 3.3 Thiết lập môi trƣờng lên men chế độ lên men 58 3.3.1 Thiết lập môi trường lên men 58 3.3.2 Thiết lập chế độ lên men 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 Kết luận 70 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 76 A PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 76 B PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 82 C PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ 87 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng MT2: môi trƣờng iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn prodigiosin (Ramina Samira, 2009) Hình 1.4 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor cộng sự, 2001) 11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho trình sinh tổng hợp prodigiosin 13 Hình 1.6 Hình dáng màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn Serratia marcescens 16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen Gibbs, 2011) 16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh enzyme Serralysin metalloprotease S.marcescens ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014) 23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens đƣợc ghi nhận Sundaramoorthy cộng (2009) 27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp prodiosin Serratia sp BTWJ8 đƣợc ghi nhận Krishna (2008) 27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô 37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật 38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập mơi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4 40 Hình 2.5 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn 43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol 46 Hình 3.1 Khả tiết ezyme protease chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 49 Hình 3.2 Khả tiết ezyme lipase chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 50 Hình 3.3 Khả tiết ezyme chitinase chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh sắc tố (OD 499) tế bào (OD 620) chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc chủng SH4 SH1 54 Hình 3.6 Kết nhuộm Gram hai chủng SH1 SH4 55 Hình 3.7 Khả tiết enzyme ngoại bào hai chủng SH4 SH1 55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian môi trƣờng nhân giống khác 57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian 60 v Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian 61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian 63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 đƣợc môi trƣờng lên men PG nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian 65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men peptone glycerol nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian 67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh sắc tố (OD 499 nm) vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men PG nồng độ tiếp liệu 48h (số liệu thô xem bảng - phụ lục A hình - phụ lục B) 68 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất vi sinh vật Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 17 Bảng 1.4 So sánh trình tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens môi trƣờng nhiệt độ khác (Chidambaram Perumalsamy, 2009) 25 Bảng 1.5 Một số sáng chế prodigiosin 32 Bảng 3.1 Khả tiết enzyme ngoại bào chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid (OD535nm) sắc tố sau trích ly chủng S.marcescens SH4, SH5 HB 53 Bảng 3.3 Khả tiết enzyme ngoại bào chủng SH4 SH1 56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng nhân giống theo thời gian 57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian 59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian 61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian 62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh vi khuẩn S.marcescens SH4 đƣợc môi trƣờng lên men PG nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian 65 vii Đồ án tốt nghiệp Error Mean Square 0.066667 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.5853 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CHUNG A 5.7667 Sh4 A 5.3000 Sh1 Thí nghiệm thiết lập môi trƣờng nhân giống Class Level Information Class Levels Values moitruong 20h MT1 MT2 PG thoigian 0h 16h 20h 24h 4h 8h MT2 PG moitruongthoigian 20 20h PG MT1 0h MT1 16h MT1 20h MT1 24h MT1 4h MT1 8h MT1 MT2 MT2 0h MT2 16h MT2 20h MT2 24h MT2 4h MT2 8h PG 0h PG 16h PG 20h PG 24h PG 4h PG 8h Number of Observations Read 81 Number of Observations Used 50 Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 97 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16 552.9292253 34.5580766 Error 33 9.2016907 0.2788391 Corrected Total 49 562.1309159 R-Square Coeff Var Root MSE 0.983631 13.07694 Source DF 123.94 F moitruong 178.8852946 89.4426473 320.77 F 204.73 F Model 28 740.0586983 26.4306678 Error 61 11.8529948 0.1943114 Corrected Total 89 751.9116931 R-Square Coeff Var Root MSE 106 136.02