Thiết lập quy trình công nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào pichia

ðại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN HỮU QUYỀN THIẾT LẬP QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN, TINH CHẾ INSULIN TÁI TỔ HỢP TỪ TẾ BÀO PICHIA Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2008 CƠNG TRÌNH ðƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : Cán chấm nhận xét : Cán chấm nhận xét : Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ HỘI ðỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðộc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Hữu Quyền Giới tính : Nam / Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 10/06/1982 Nơi sinh : Quảng Bình Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoá (Năm trúng tuyển) : 2005 1- TÊN ðỀ TÀI: “Thiết lập quy trình cơng nghệ lên men, tinh chế insulin .tái tổ hợp từ tế bào Pichia” 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: + Tối ưu hóa mơi trường, điều kiện nuôi cấy Pichia pastoris quy mô erlen + Khảo sát khả tăng trưởng sinh khối cảm ứng sản xuất mini-proinsulin quy mô fermenter + Nghiên cứu phương pháp thu nhận, tinh mini-proinsulin sau lên men 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/2007 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 06/2008 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Nguyễn Quốc Bình Nội dung ñề cương Luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ðồng Chuyên Ngành thơng qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MƠN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn thầy TS Nguyễn Quốc Bình, Phó giám ñốc Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM, ñã ñịnh hướng ñề tài tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho thực luận văn Tôi xin chân thành cám ơn cô ThS Nguyễn Thị Thùy Dương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM, ñã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực thí nghiệm lên men qúa trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cám ơn bạn ThS Trần Thị Thúy Hằng em KS Phạm Thị Thùy Dương ñã hỗ trợ việc chuẩn bị nguyên vật liệu, tiến hành thí nghiệm xử lý số liệu thí nghiệm qúa trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cám ơn cô TS Nguyễn Thúy Hương, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM, ñã hỗ trợ tạo ñiều kiện thuận lợi cho việc thực thủ tục gia hạn thời gian thực luận văn bảo vệ luận văn Tôi xin chân thành cám ơn tất quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học trường ðại học Bách khoa Tp HCM ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM ñã tạo ñiều kiện nguyên vật liệu cho tơi thực qúa trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cám ơn Ban giám đốc Cơng ty Dược phẩm Phil Inter Pharma ñã tạo ñiều kiện mặt thời gian cho tơi qúa trình thực luận văn Tôi xin chân thành cám ơn bạn học lớp Cao học CNSH-K2005 trường ðại học Bách khoa Tp HCM mang lại cho tơi niềm vui, tình bạn ý kiến đóng góp chân thành qúa trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành cám ơn gia đình tơi ủng hộ, khích lệ động viên tơi suốt qúa trình học tập nghiên cứu TĨM TẮT LUẬN VĂN Qúa trình lên men Pichia pastoris fermenter gồm phase (pha): glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase methanol fed-batch phase Pichia pastoris phát triển ñể ñạt mật ñộ sinh khối cao hai phase ñầu: Sử dụng chất glycerol mơi trường ban đầu để phát triển sinh khối glycerol batch phase; sau đó, chất cho phát triển sinh khối (glycerol) ñược bổ sung thêm glycerol fed-batch phase Khi ñạt ñược mật độ sinh khối thích hợp bổ sung chất thứ hai (methanol) methanol fed-batch phase ñể cảm ứng cho qúa trình sản xuất miniproinsulin Mini-proinsulin dịch lên men sau định tính phương pháp ñiện di Western blot, ñịnh lượng sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC Glycerol batch phase: Tiến hành lên men với 4,1% glycerol môi trường ban ñầu Glycerol fed-batch phase: Tiến hành bổ sung glycerol theo chế độ thí nghiệm: Ở chế độ lên men 1, bổ sung liên tục: 0,5% glycerol/h ñầu 0,75% glycerol/h sau (5% glycerol) Trong chế độ cịn lại bổ sung lần: 5% glycerol chế ñộ lên men 7% glycerol chế ñộ lên men Methanol fed-batch phase: Tiến hành bổ sung methanol liên tục: 0,3% methanol/h ñầu, 0,6% methanol/h 0,9 % methanol/h cho ñến kết thúc thí nghiệm ABSTRACT The process of Pichia pastoris fermentation in fermenter containing phases: glycerol batch phase, glycerol fed-batch phase and methanol fed-batch phase Pichia pastoris develops to reach the high mass density in the first two phases: Using glycerol in initial medium to develop the mass in glycerol batch phase; after that, this mass developing – substance (glycerol) will be added more in glycerol fed-batch phase After reaching the suitable mass density, the second substance (methanol) will be added in methanol fedbatch phase for the induction process of producing mini-proinsulin Mini-proinsulin in the cultured supernatant after fermentation will be identified by the method of polyacrilamide gel electrophoresis and Western blot, assayed by the method of high performance liquid chromatography – HPLC Glycerol batch phase: Carry out the fermentation process with 4.1% glycerol in the initial medium Glycerol fed-batch phase: Carry out adding glycerol with experiment regulations: In the 1st experiment, add glycerol continuously: 0.5% glycerol/h in the first hours and 0.75% glycerol/h in the next hours (total 5% glycerol) In the remain experiments, add glycerol only time: 5% glycerol in the 2nd experiment and 7% glycerol in the 3rd experiment Methanol fed-batch phase: Carry out adding methanol continuously: 0.3% methanol/h in the first hours, 0.6% methanol/h in the next hours and 0.9 % methanol/h to the end of experiment MỤC LỤC Lời cám ơn Tóm tắt luận văn Danh mục hình Danh mục bảng PHẦN MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ 14 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15 1.2.1 Các nghiên cứu, ứng dụng giới 15 1.2.2 Các nghiên cứu, ứng dụng nước 16 PHẦN TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TIỂU ðƯỜNG 19 2.1.1 Tiểu ñuờng 19 2.1.2 Các dạng tiểu ñường 19 2.1.2.1 Tiểu ñường tuýp 20 2.1.2.2 Tiểu ñường tuýp 21 2.1.2.3 Xuất bệnh tiểu ñường tuýp 21 2.1.3 Tác hại bệnh tiểu ñường 23 2.1.4 Tình hình bệnh tiểu đường giới Việt Nam 25 2.2 TỔNG QUAN VỀ INSULIN VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP 25 2.2.1 Insulin 25 2.2.2 Cấu tạo insulin 25 2.2.3 Chức sinh học insulin 28 2.2.4 Tại cần phải sản xuất insulin tái tổ hợp 30 2.2.5 Phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp 30 2.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN PICHIA PASTORIS 32 2.3.1 ðặc ñiểm sinh học nấm men Pichia pastoris 32 2.3.1.1 Phân loại khoa học Pichia pastoris 33 2.3.1.2 ðặc ñiểm dinh dưỡng Pichia pastoris 33 2.3.1.3 ðặc điểm sinh hóa – di truyền Pichia pastoris 33 2.3.1.4 Qúa trình trao đổi chất Pichia pastoris 34 2.3.2 So sánh nấm men Pichia pastoris với hệ thống biểu khác 36 2.3.3 ðặc ñiểm thuận lợi Pichia pastoris phù hợp với ứng dụng sản xuất insulin người tái tổ hợp theo qui mô công nghiệp 37 2.4 LÊN MEN PICHIA PASTORIS SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP 38 2.4.1 Khái quát kỹ thuật lên men 38 2.4.2 Phương pháp lên men fed-batch 38 2.4.2.1 Khái quát phương pháp lên men fed-batch 38 2.4.2.2 Ưu ñiểm phương pháp lên men fed-batch 40 2.4.2.3 Nhược ñiểm phương pháp lên men fed-batch 40 2.4.2.4 Các nhân tố kiểm sốt lên men fed-batch 40 2.4.2.5 Các thiết bị cho hệ thống lên men fed-batch 47 2.4.3 Lên men Pichia pastoris sử dụng phương pháp lên men fed-batch 48 2.4.3.1 Glycerol batch phase (GBP) 48 2.4.3.2 Glycerol fed-batch phase (GFP) 49 2.4.3.3 Methanol fed-batch phase (MFP) 49 2.4.4 Các nghiên cứu ứng dụng lên men Pichia pastoris 50 PHẦN NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 54 3.1.1 Môi trường 54 3.1.1.1 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) 54 3.1.1.2 Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-coplex Medium) 54 3.1.1.3 Môi trường BS (Basal Salts Medium) 54 3.1.1.4 PTM1 Trace Metals Solution 54 3.1.2 Chủng vi sinh vật 55 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 56 3.1.3.1 Dụng cụ 56 3.1.3.2 Thiết bị 56 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 3.2.1 Sơ ñồ khối qúa trình nghiên cứu 56 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Pichia pastoris thu sinh khối quy mơ erlen.57 3.2.3 Khảo sát đường cong tăng trưởng chủng quy mô erlen 59 3.2.4 Khảo sát khả tăng trưởng sinh khối cảm ứng sản xuất mini-proinsulin quy mô fermenter .60 3.2.4.1 Khảo sát khả phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu nồng ñộ glycerol bổ sung) 63 3.2.4.2 Khảo sát khả sử dụng chất methanol tổng hợp mini-proinsulin 64 3.2.5 Phương pháp phân tích 64 3.2.5.1 Xác ñịnh hàm lượng sinh khối khô 64 3.2.5.2 Xác ñịnh tốc ñộ tăng trưởng riêng chủng (µ) 65 3.2.5.3 Xác định protein tổng phương pháp Bradford 66 3.2.5.4 ðịnh tính mini-proinsulin phương pháp điện di Western blot 67 3.2.5.5 ðịnh lượng mini-proinsulin phương pháp Sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 70 PHẦN KẾT QỦA VÀ BIỆN LUẬN 4.1 TỐI ƯU HÓA ðIỀU KIỆN NUÔI CẤY PICHIA PASTORIS THU SINH KHỐI Ở QUY MÔ ERLEN 74 4.1.1 Thực nghiệm yếu tố phần 74 4.1.2 Tối ưu hóa thực nghiệm đường dốc 74 4.2 KHẢO SÁT ðƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỦNG Ở QUY MÔ ERLEN 76 4.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG SINH KHỐI VÀ CẢM ỨNG SẢN XUẤT MINI-PROINSULIN Ở QUY MÔ FERMENTER .78 4.3.1 Khảo sát khả phát triển sinh khối (thay ñổi cách nạp liệu nồng ñộ glycerol bổ sung) 78 4.3.2 Kiểm tra khả sử dụng chất methanol tổng hợp mini-proinsulin 83 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ A KẾT LUẬN 88 B ðỀ NGHỊ 89 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 91 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 91 CÁC TRANG WEB 94 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: CÁC BẢNG KẾT QỦA THÍ NGHIỆM 96 PHỤ LỤC B: CÁC HÌNH KẾT QỦA THÍ NGHIỆM .106 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Trang 101 Bảng 7.5 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khơ, tốc độ tăng trưởng riêng hàm lượng tổng protein ngoại bào chế ñộ lên men PHA PHA Thời gian (h) Sinh khối khơ (g/L) µ ( h-1) OD600nm 0,00 7,37 0,0258 2,25 1,00 7,41 0,0300 2,26 2,00 7,41 0,0659 2,26 3,00 8,07 0,1245 2,53 4,00 8,60 0,1242 2,76 4,50 9,30 0,1239 3,34 12,00 45,00 0,1205 14,02 16,50 68,60 0,1142 20,98 18,00 78,49 0,1114 23,90 18,50 79,69 0,1029 25,00 19,00 95,96 0,0922 29,80 20,00 102,06 0,0805 31,60 21,00 107,49 0,0637 33,20 21,00 107,49 0,0637 33,20 22,00 112,91 0,0810 34,80 23,00 135,96 0,0956 41,60 24,00 146,81 0,1037 44,80 25,00 178,00 0,1028 54,00 26,00 196,98 0,1019 59,60 26,50 201,00 0,1000 67,00 30,00 221,26 0,0998 69,00 35,00 259,60 0,0899 80,31 39,50 272,11 0,0619 84,00 Phần 7: Phụ lục Trang 102 PHA Thời gian (h) Thời gian cảm ứng (h) Sinh khối khô (g/L) Protein tổng ( g/L ) 39,50 0,00 273,81 0,1322 41,50 2,00 261,94 0,1368 44,00 4,50 250,96 0,1410 49,75 10,25 268,90 0,1698 63,50 24,00 283,50 0,1852 64,00 24,50 286,58 0,1852 64,25 24,75 286,58 0,1852 71,00 31,50 285,59 0,1935 87,50 48,00 264,55 0,2028 88,50 49,00 270,56 0,2069 89,50 50,00 283,65 0,2168 92,50 53,00 296,89 0,2358 95,00 56,50 310,31 0,2616 110,50 72,00 330,65 0,2969 Phần 7: Phụ lục Trang 103 Bảng 7.6 – Kết qủa hàm lượng sinh khối khơ, tốc độ tăng trưởng riêng hàm lượng tổng protein ngoại bào chế ñộ lên men PHA PHA Thời gian (h) Sinh khối khơ (g/L) µ ( h-1) OD600nm 0,00 10,95 0,0000 3,38 1,00 10,95 0,0050 3,38 1,50 11,63 0,0098 3,58 2,00 11,63 0,0367 3,58 3,00 11,70 0,0936 3,60 3,50 11,70 0,1167 3,60 4,00 13,00 0,1338 3,98 6,00 18,26 0,1477 5,65 16,00 41,00 0,1460 12,69 17,00 48,42 0,1455 14,88 18,50 60,08 0,1413 18,32 19,00 69,78 0,1348 21,48 20,00 78,73 0,1138 24,12 21,00 93,78 0,0808 28,56 23,50 118,52 0,0568 37,10 24,50 119,54 0,0259 37,50 24,50 119,54 0,0259 0,125 25,00 121,57 0,0943 0,127 25,50 132,76 0,1031 0,138 26,00 136,82 0,1077 0,142 26,50 144,96 0,1091 0,143 30,00 209,59 0,0968 0,150 39,00 235,68 0,0385 0,165 41,00 260,15 0,0325 0,178 43,50 264,73 0,0259 0,181 Phần 7: Phụ lục Trang 104 PHA Thời gian (h) Thời gian cảm ứng (h) Sinh khối khô (g/L) Protein tổng ( g/L ) 43,50 0,00 264,73 0,1369 46,50 3,00 238,70 0,1469 49,50 6,00 239,07 0,1881 67,50 24,00 335,03 0,2358 93,00 48,00 351,30 0,2136 Phần 7: Phụ lục Trang 105 Bảng 7.7 – Kết qủa chạy sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC Mẫu kiểm tra Diện tích đỉnh (peak) Mẫu chuẩn IU/ml 1737253 Mẫu chuẩn IU/ml 3595406 Mẫu chuẩn 12 IU/ml 5279427 Mẫu chuẩn 16 IU/ml 6882369 Mẫu thử (chế ñộ lên men 1) 3577324 Phần 7: Phụ lục Trang 106 PHỤ LỤC B CÁC HÌNH KẾT QỦA THÍ NGHIỆM Phần 7: Phụ lục Trang 107 Hình 7.1 – Khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris môi trường YPD Hình 7.2 – Hệ thống fermenter Bioflo 110 1,3 lít Phần 7: Phụ lục Trang 108 Hình 7.3 – ðồ thị ñường chuẩn OD600nm nồng ñộ sinh khối khơ (g/L) Hình 7.4 – ðồ thị đường chuẩn OD595nm nồng ñộ protein tổng (mg/L) Phần 7: Phụ lục Trang 109 Lên men Lên men Mẫu chuẩn Mẫu chuẩn Lên men Lên men Hình 7.5 – Kết định tính mini-proinsulin (điện di Native Western blot) 8000000 y = 435799x 7000000 R = 0.9992 Diện tích đỉnh 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 10 12 14 16 Nồng độ (IU/ml) Hình 7.6 – ðồ thị đường chuẩn nồng độ insulin – diện tích đỉnh Phần 7: Phụ lục 18 Trang 110 Hình 7.7 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ IU/ml (thể tích tiêm 20µl) Phần 7: Phụ lục Trang 111 Hình 7.8 – Sắc ký ñồ mẫu chuẩn insulin nồng ñộ IU/ml (thể tích tiêm 20µl) Phần 7: Phụ lục Trang 112 Hình 7.9 – Sắc ký đồ mẫu chuẩn insulin nồng độ 12 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) Phần 7: Phụ lục Trang 113 Hình 7.10 – Sắc ký đồ mẫu chuẩn insulin nồng độ 16 IU/ml (thể tích tiêm 20µl) Phần 7: Phụ lục Trang 114 Hình 7.11 – Sắc ký ñồ mẫu thử chế ñộ lên men (thể tích tiêm 200µl) Phần 7: Phụ lục LÝ LỊCH TRÍCH NGANG THƠNG TIN CÁ NHÂN Họ tên : Nguyễn Hữu Quyền Ngày, tháng, năm sinh : 10/6/1982 Nơi sinh : Quảng Bình ðịa liên lạc : 177/19/6 TTH1, KP 4, F Tân Thới Hiệp, Q 12, TP HCM QUÁ TRÌNH ðÀO TẠO 9/2000 – 3/2004 : Học ñại học trường ðại học Khoa học Tự nhiên TP HCM, chuyên nghành Công nghệ sinh học 9/2005 – ñến : Học cao học trường ðại học Bách khoa TP HCM, chuyên nghành Công nghệ sinh học Q TRÌNH CƠNG TÁC 3/2004 – 4/2006 : Chun viên Kiểm tra chất lượng, Công ty TNHH Dược phẩm Shinpoong Daewoo Pharma, KCN Biên Hoà 1, ðồng Nai 4/2006 – 5/2008 : Trưởng phịng Kiểm tra chất lượng, Cơng ty TNHH Dược phẩm Phil Inter Pharma, KCN Việt Nam – Singapore, Bình Dương Hiện : Trưởng phịng Kiểm tra chất lượng, Công ty Cổ phần Dược phẩm SPM, KCN Tân Tạo, Q Bình Tân, TP HCM ... hợp theo quy mô công nghiệp, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Thiết lập quy trình cơng nghệ lên men, tinh chế insulin tái tổ hợp từ tế bào Pichia? ?? 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.2.3 Các... tạo insulin tái tổ hợp Một phương pháp ñầu tiên ñược thực sử dụng gene nhân tạo mã hố cho chuỗi A B ñưa vào tế bào vi khuẩn Echerichia coli ñể tổng hợp insulin tái tổ hợp [6, 11, 39] Phần 2: Tổng... Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoá (Năm trúng tuyển) : 2005 1- TÊN ðỀ TÀI: ? ?Thiết lập quy trình cơng nghệ lên men, tinh chế insulin